Étude du rôle de la CaMKII dans le
processus d’exocytose des récepteurs
AMPA
Mémoire
Benoit Audet
Maîtrise en biophotonique
Maître ès sciences (M. sc.)
Québec, Canada
© Benoit Audet, 2016
Étude du rôle de la CaMKII dans le
processus d’exocytose des récepteurs
AMPA
Mémoire
Benoit Audet
Sous la direction de :
Paul De Koninck, directeur de recherche
Mario Méthot, codirecteur de recherche
Résumé
La plasticité synaptique, qui permet l’apprentissage et la mémoire, s’exprime par des changements dans la force de transmission de signal passant par les neurotransmetteurs. La modulation de la quantité de récepteurs au glutamate de type « AMPA » disponibles dans le compartiment post-synaptique est un des moyens que possède le neurone pyramidal de modifier sa réponse à un stimulus. Les mécanismes régissant ce mécanisme de plasticité ne sont pas très bien compris, mais nous savons toutefois que l’enzyme CaMKII joue un rôle important à plusieurs niveaux dans le processus. Par exemple, la CaMKII joue un rôle dans l’immobilisation des récepteurs AMPA dans les synapses de neurones de l’hippocampe en culture, suite à un protocole (appelé « cLTP) qui mène à la Potentialisation à Long Terme de ces synapses et à l’augmentation de leur contenu en récepteurs AMPA.
J’ai testé l’hypothèse que la CaMKII contribue également à augmenter le niveau d’expression membranaire des récepteurs AMPA dans les neurones. Pour ce faire, j’ai procédé à des mesures d’imagerie optique de la livraison des récepteurs AMPA à la membrane plasmique par un processus d’exocytose des réserves intracellulaires du récepteur. Cette mesure exploite la microscopie vidéo à fluorescence ainsi que le transfert de gène d’une protéine fluorescente couplée au récepteur, dont la fluorescence n’apparait que lorsque les récepteurs arrivent à la surface. En bloquant l’activité de la CaMKII avec des outils pharmacologiques ou génétiques, j’ai observé une diminution importante dans la fréquence d’exocytose des récepteurs AMPA, ce qui confirme l’hypothèse qu’elle joue un rôle important dans ce processus. Toutefois, lors d’une stimulation de type cLTP, je n’ai pas observé d’augmentation dans la fréquence d’apparition des événements d’exocytose des récepteurs. Ces résultats
indiquent que malgré le rôle de la CaMKII dans l’augmentation de l’exocytose des récepteurs AMPA, ces derniers ne sont pas davantage livrés à la membrane durant un protocole de cLTP, suggérant que seule l’immobilisation des récepteurs joue un rôle prépondérant dans l’augmentation des récepteurs AMPA à la synapse durant la LTP. Il sera cependant important d’étudier davantage pourquoi la CaMKII promeut l’exocytose des récepteurs AMPA, sans que ce processus soit augmenté durant la LTP.
Table des matières
Résumé ... iii
Table des matières ... v
Table des figures ... vii
Liste des abréviations ... ix
1 Neurobiologie ... 1
1.1 Le cortex cérébral ... 2
1.2 Les noyaux internes ... 3
1.2.1 L'hippocampe ... 4 1.3 Le neurone pyramidal ... 6 1.3.1 Le cytosquelette ... 7 1.3.2 La synapse ... 8 1.3.3 Le récepteur NMDA ... 10 1.3.4 Le récepteur AMPA ... 12
1.3.5 La plasticité synaptique et l'implication de la CaMKII ... 13
2 Photonique ... 19 2.1 La fluorescence ... 20 3 Problématique de recherche ... 24 4 Matériel et méthodes ... 25 4.1 Culture cellulaire ... 25 4.2 Transfection ... 25 4.3 Imagerie ... 26 4.3.1 Cellules vivantes ... 26 4.3.2 Cellules fixées... 28 5 Résultats ... 31
5.1 Exocytose des récepteurs AMPA ... 31
5.1.1 Détection et analyse des événements ... 31
5.1.2 Inhibition aigüe de la CaMKII ... 33
5.1.3 Inhibition chronique de la CaMKII ... 34
5.1.4 cLTP ... 36
6 Discussion et perspectives ... 45
6.1 Influence du pH sur la détection ... 45
6.2 Phototoxicité et excitotoxicité ... 48
7 Conclusion ... 52
8 Annexe ... 54
8.1 Analyse ICA ... 54
Table des figures
Figure 1-1 : Illustration par Ramón y Cajal de neurones colorées par la
technique de Golgi ... 1
Figure 1-2 : Illustration des différentes régions du cortex cérébral. ... 3 Figure 1-3 : Illustration de certains noyaux internes du cerveau humain. ... 3 Figure 1-4 : Illustration simplifiée du réseau cellulaire de l'hippocampe
effectuée par Ramón y Cajal ... 5
Figure 1-5 : Image en fluorescence d'un neurone pyramidal en culture.. ... 6 Figure 1-6 : Illustration du réseau de microtubule (A) et de la distribution de
la CaMKII (B) dans un neurone fixé à la paraformaldéhyde. ... 7
Figure 1-7 : Schéma de la structure d'un microtubule. ... 7 Figure 1-8 : Illustration comparative entre une synapse chimique (A) et une
synapse électrique (B) ... 8
Figure 1-9 : Représentation graphique des principales composantes de la
synapse excitatrice ... 10
Figure 1-10 : Illustration des différents sites de liaison du récepteur NMDA et
des ions qu'il laisse passé lors de son ouverture. ... 11
Figure 1-11 : Diagramme d'un récepteur AMPA ... 12 Figure 1-12 : Représentation des formes fermée (inactive) et ouverte (active)
de la CaMKII ... 15
Figure 2-3 : Illustration schématique de la région périsynaptique. ... 22 Figure 2-4 : Illustration montrant le parcours de la lumière dans une
configuration d'épifluorescence (gauche) et dans une configuration de
réflection totale interne (droite) ... 23
Figure 4-1 : Démonstration de l’effet de photoblanchiment. ... 27 Figure 5-1 : Démonstration des étapes effectuées par le script automatisé.
Une étape de confirmation manuelle est nécessaire pour éliminer les faux positifs. ... 31
Figure 5-2: Image composée d’une projection maximale de la région imagée
ainsi que de la totalité événements d’exocytose détectés sur une période de 100 secondes en condition basale. ... 32
Figure 5-3 : Effet du KN93 sur la fréquence d’exocytose des récepteurs AMPA
contenant la sous-unité GluA1 ... 34
Figure 5-4 : Effet de l’inhibition chronique de la CaMKII par son inhibiteur
naturel CaMKIIn. ... 35
Figure 5-5 : Effet de la réduction de la quantité de CaMKIIα sur la fréquence
d’exocytose des récepteurs AMPA ... 35
Figure 5-6 : Démonstration de l’accumulation synaptique de récepteurs AMPA
Figure 5-7 : Résultat de la stimulation chimique 2.5 µM 4-AP/50 µM
Bicuculine sur la translocation synaptique des récepteurs AMPA ... 38
Figure 5-8 : Classification des régions synaptiques selon leur réponse au
traitement à la bicuculine/4-AP. ... 40
Figure 5-9 : Illustration de l’effet d’un traitement à la bicuculine (50 uM) et au
4-AP (2.5 mM) pendant 5 minutes sur le taux d’exocytose des récepteurs AMPA. ... 42
Figure 5-10 : Illustration du recouvrement de fluorescence membranaire
associée aux récepteurs AMPA. ... 43
Figure 5-11 : Histogrammes représentant la quantification du signal observé
à la figure 5-10. ... 44
Figure 6-1 : Démonstration de l’effet d’augmentation de fluorescence
observée lors d’une stimulation sur une cellule photoblanchie ... 46
Figure 6-2 : Le réseau d’actine synaptique est déstabilisé lors de l’activation
de la CaMKII ... 50
Liste des abréviations
4-AP 4-aminopyridineaCSF Artificial cérébrospinal fluid
ADN Acide désoxyribonucléique
AMPA α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid
ara-C Cytosine β-D-arabinofuranoside
ARN Acid ribonucléique
Bic Bicuculine
CA1 Corne d'Amon 1
CA3 Corne d'Amon 3
CaMKII Ca2+/calmodulin dependent kinase 2
CaMKIIn Ca2+/calmodulin dependent kinase 2 natural inhibitor
CEDE Calcium-evoked Dendritic Exocytosis
DG Dentate gyrus
EC Entorhinal cortex
EGTA ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid
EPSP Excitatory post-synaptic potential
FRAP Fluorescence recovery after photobleaching
GABA Gamma-aminobutyric acid
GFP Green fluorescent protein
ICA Independent component analysis
LTD Long term depression
LTP Long term potentiation
NMDA N-methyl-D-aspartate
PBS Phosphate-buffered saline
PFA Paraformaldéhyde
PKA Protein kinase A
PKC Protein kinase C
PSD Post-synaptic density
ROS Reactive Oxygen Species
SEP Super-ecliptic pHluorin
shRNA Short-hairpin Ribonucleic acid
STDP Spike-timing-dependent plasticity
STED Stimulated emission depletion
Sub Subiculum
Tfr Transferrin receptor
thr Thrombin
TIRF Total internal reflection fluorescence
À mes parents et ami(e)s qui m'ont supporté plus qu'ils ne le réalisent. Avec espoir qu'ils comprennent au moins un peu ce que j'ai fait ces dernières années!
1 Introduction - Neurobiologie
La théorie de l'esprit et de la spiritualité remonte à aussi loin que la Grèce ancienne alors qu'Hippocrate et Platon, entre autres, avaient attribué au cerveau les rôles de messager de la compréhension et de siège de l'esprit rationnel (Crivellato and Ribatti 2007). Ces théories, aujourd'hui beaucoup plus développées, sont toutefois encore bien loin de la neuroscience actuelle et relèvent plutôt de la psychologie et même de la philosophie. La neuroscience moderne n'est née qu'au début du vingtième siècle avec la démonstration expérimentale que le système nerveux est composé de cellules distinctes et non pas d'un circuit continu, tel que décrit par Camillo Golgi (Bock 2013). C'est d'ailleurs ce dernier qui a mis au point la technique de coloration qui a permit de visualiser ce réseau. Les techniques de microscopie de
l'époque ne permettaient toutefois pas de distinguer de séparation entre les différentes cellules que nous connaissons sous le nom de neurones. C'est Santiago Ramón y Cajal, vers la fin des années 1880, qui, suite à l'amélioration de la technique de Golgi, a vu des cellules colorées isolées dans sa préparation. Suite à plusieurs expériences, il fini par affirmer que les cellules du système nerveux central sont belles et bien isolées physiquement les unes
des autres. Cette affirmation a non seulement mené à un prix Nobel pour les deux chercheurs, mais aussi à un conflit d'idées qui ne sera résolu qu'en 1950, plusieurs années après leur mort. L'imagerie par microscopie électronique a donné raison à Ramón y Cajal en permettant pour la toute première fois d'observer la synapse qui permet de faire une jonction
Figure 1-1 : Illustration par Ramón y
Cajal de neurones colorées par la technique de Golgi. On voie une cellule pyramidale du cortex en (a) et une cellule de Purkinje du cervelet en (b). Les images originales proviennent du Textura del Sistema Nervioso del Hombre y de los Vertebrados (Cajal 1899–1904, figures 689 [gauche], et 10 et 365 [droite])
chimique sans contact entre deux cellules nerveuses distinctes. D'autres types de synapses existent aussi et seront brièvement décrites plus loin. Dans la figure 1-1 sont illustrées deux types de cellules très différentes au niveau de leur forme et aussi de leur fonction (Cajal 1899). Les cellules de Purkinje, à droite, se retrouvent dans le cervelet où elles jouent un rôle primordial dans la coordination musculaire (Purves, Augustine et al. 2012). Ce type de neurone ne sera pas abordé dans ce document; il est mentionné simplement pour illustrer la diversité des cellules qui forment le cerveau humain.
Le type de cellule de gauche, le neurone pyramidal, est présent majoritairement dans le cortex cérébral et aussi dans la région qui m'a intéressé particulièrement dans mes recherches, l'hippocampe (Purves, Augustine et al. 2012).
1.1 Le cortex cérébral
Le cerveau, à un niveau plus macroscopique, peut être divisé en plusieurs régions ayant des rôles différents. De façon générale, l'avant du cerveau est attribué au contrôle moteur et l'arrière, au contrôle sensoriel. Dans la figure 1-2, on peut voir de façon plus détaillées les différentes régions du cortex où les sulci centraux et latéraux le séparent en différents lobes. Ces lobes sont ensuite subdivisés par les gyri et sulci qui les composent. Les sulci sont les sillons alors que les gyri sont les renflements (Purves, Augustine et al. 2012). Il est possible d'attribuer des fonctions plus spécifiques à chacun des gyri, cela dépasse toutefois le cadre de ce document.
Figure 1-2 : Illustration des différentes régions du cortex cérébral. Certains rôles généraux ont été associés
à chaque région. On peut voir le sillon central qui sépare les lobes frontaux et pariétaux et le sillon latéral qui sépare le lobe temporal de la partie supérieure du cerveau
1.2 Les noyaux internes
Sous cette couche de cellules relativement épaisse, aussi subdivisée en six sous-couches qu'est le cortex cérébral, se retrouvent plusieurs centres de traitement de signaux. On y retrouve entres autres les noyaux de la base, le thalamus, l'amygdale etl'hippocampe. L'amygdale et l'hippocampe font tous deux partie du lobe Cortex prémoteur
Création des programmes moteurs: contrôle et coordination des actions
Cortex moteur
Contrôle et coordination des mouvements des muscles
Cortex somato-sensoriel
Analyse du sens du toucher de la peau et de la langue
Cortex sensoriel associatif
Assimilation et intégration des informations sensorielles
Cortex visuel associatif
Intégration des informations visuelles avec la mémoire et les émotions
Cortex visuel primaire
Analyse des signaux visuels
Aire de Wernicke
Analyse du langage et de la compréhension des mots
Cortex préfrontal Associé à la personnalité, à la pensée, à l'analyse et à l'orientation Aire de Broca Contrôle de la production de la parole et de l'articulation
Cortex primaire auditif
Analyse les informations auditives
Cortex auditif associatif
Intégration des données auditives avec la mémoire, les émotions et les autres sens
Cervelet
Sillon latéral (Scissure de Sylvius) Scillon central
Lobe frontal
Lobe pariétal
Lobe occipital
Lobe temporal
Figure 1-3 : Illustration de certains noyaux internes du
temporal et sont respectivement les sièges du contrôle des émotions et de la mémoire (Purves, Augustine et al. 2012).
1.2.1 L'hippocampe
Plusieurs rôles ont été attribués à l'hippocampe au cours du temps, mais le rôle le plus prévalent de nos jours concerne la formation de nouvelles mémoires. C'est suite à la chirurgie de Henry Molaison (patient H.M.), en 1953, que ce rôle lui a été attribué définitivement. En effet, suite à sa chirurgie d'ablation des hippocampes et d'autres régions avoisinantes des lobes temporaux dans le but de le guérir de son épilepsie majeure, le patient H.M. ne se rappelait pas des événements précédents son opération et était incapable de former de nouvelles mémoires. Toutefois, malgré son amnésie, le patient H.M., était toujours capable de former des mémoires procédurales à long terme, c'est-à-dire qu'il pouvait toujours apprendre de nouveaux talents moteurs; il ne se souvenait toutefois pas de les avoir appris (Augustinack, van der Kouwe et al. 2014). Les études effectuées sur le patient H.M. jusqu'à sa mort en 2008 ont permis d'établir un lien entre les différents noyaux impliqués dans la formation des mémoires et ont aussi permis de mieux comprendre le flux d'information entre ces régions.
L'hippocampe est physiquement connecté à plusieurs régions du cerveau incluant les noyaux septaux, qui jouent un rôle dans le plaisir associé aux récompenses (Christiansen, Dillingham et al. 2016), les corps mamillaires de l'hypothalamus (Vann and Aggleton 2004), qui jouent un rôle dans la mémoire spatiale chez les rats, et le complexe nucléaire antérieur du thalamus, qui joue un rôle dans la mémoire épisodique (Child and Benarroch 2013).
Plusieurs signaux régulateurs arrivent de ces régions vers les différentes sous-régions de l'hippocampe dont la corne d'Amon 1 (CA1) et le cortex entorhinal (EC). Il a été montré que sans ces signaux régulateurs, l'hippocampe ne peut pas accomplir ses fonctions correctement (Winson 1978). Les réalisations de Ramón y Cajal, décrites plus tôt, ne s'arrêtent pas à la description de ce qu'est un neurone, il a aussi été le premier à décrire la principale voie d'entrée de l'information vers
l'hippocampe, la voie perforante. Les signaux arrivant des différentes régions du cortex vers le EC seront d'abord transmis aux cellules granulaires du gyrus dentelé (DG) par les axones des neurones pyramidaux. Une autre projection, plus limitée, se dirige vers le CA1. Les cellules du DG relaient ensuite l'information aux cellules du CA3 par la voie des fibres moussues. Les axones des neurones de la CA3 forment ensuite une projection appelée "collatérales de Schaffer" qui passe par la CA1 et qui retourne vers le EC. Chacune des régions de l'hippocampe est aussi un centre d'intégration de l'information complexe (Purves, Augustine et al. 2012). La compréhension d'un aspect de cette intégration de l'information est le but principal de ce mémoire.
Figure 1-4 : Illustration simplifiée du réseau cellulaire de l'hippocampe
effectuée par Ramón y Cajal. EC: Enthorinal cortex, Sub: Subiculum, DG: Dentate gyrus (Cajal 1899)
1.3 Le neurone pyramidal
Les neurones sont un type de cellule formé d'une arborisation complexe de dendrites et d'un axone. Les dendrites reçoivent l'influx d'information par l'entremise de leurs synapses, où plusieurs mécanismes complexes, décrit plus loin, permettent de convertir un signal chimique en signal électrique. L'axone, plus mince que les dendrites et unique, permet d'envoyer l'information électrique vers un autre neurone dans le cas du système nerveux central, ou vers un muscle dans le cas de certains neurones périphériques.
Le type de cellule le plus prévalent dans l'hippocampe, tel que décrit plus tôt, est le neurone pyramidal. Ce type de neurone possède deux régions d'arborisation dendritique distinctes par leurs formes et leurs rôles. La première région, à la base du neurone (dendrites basaux), permet d'établir une communication avec les neurones avoisinants dans la même couche de cellules, alors que la seconde projection (dendrite apical), plus longue,
permet de faire le lien entre deux couches de cellules différentes (Megías, Emri et al. 2001).
Figure 1-5 : Image en fluorescence d'un
neurone pyramidal en culture. La sous-unité GluA1 du récepteur AMPA est marquée avec
la phLuorin super-écliptique (SEP) Voir ch. 2.
1.3.1 Le cytosquelette
La forme d'une cellule, peu importe son type, est déterminée par son cytosquelette. Ce cytosquelette, composé principalement d'actine et de tubuline, ainsi que de plusieurs autres protéines qui interagissent avec celles-ci pour les stabiliser ou les remodeler, forme en quelque sorte les muscles et les os des cellules (Alberts 2008). Outre leurs rôles structuraux, les réseaux d'actine et de tubuline jouent aussi des rôles très
importants dans le transport intracellulaire. On peut bien voir dans la figure 1-6, particulièrement dans la dendrite du haut, que les microtubules forment un réseau de tubes linéaires qui originent du corps cellulaire et qui s'étend dans tout les dendrites.
Ces tubes, formés de plusieurs dimères d'alpha et de béta tubuline sont polaires, c'est- à- dire que leurs deux extrémités sont différentes, l'une se terminant par les sous-unités alpha (-) et l'autre par les sous-unités béta (+) (figure 1-7) (Alberts 2008). Certaines protéines spécialisées dans le
Figure 1-6 : Illustration du réseau de microtubule (A) et de la distribution de la CaMKII (B) dans un neurone
fixé à la paraformaldéhyde.
Figure 1-7 : Schéma de la structure d'un microtubule.
transport de cargo utilisent cette propriété afin de diriger le transport dans un sens ou dans l'autre. Les kinésines se dirigent vers l'extrémité (+) des microtubules et dirigent donc les cargos vers les dendrites. Les dynéines, quant à elles, jouent un rôle inverse alors qu'elles dirigent des cargos, souvent destinés au recyclage, vers le corps cellulaire (Alberts 2008). De façon similaire, les filaments d'actine sont aussi polaires. Une autre famille de protéines, les myosines, peuvent utiliser cette polarité afin d'effectuer différentes tâches. La Myosine Vb, par exemple, est impliquée dans le transport des récepteurs AMPA (Lisé, Wong et al. 2006). Ce sont aussi les myosines qui, lorsqu'attachées à deux filaments d'actines, effectuent le travail de contraction musculaire (Alberts 2008).
1.3.2 La synapse
La synapse, endroit de communication entre deux neurones, doit sa structure principalement au réseau d'actine et peut prendre plusieurs formes et jouer
différents rôles. Les synapses électriques, où les membranes
axonales et
dendritiques sont directement en contact
via des canaux
ioniques appelés "jonctions
communicantes", sont extrêmement rapides et se retrouvent principalement dans les systèmes nerveux liés aux réflexes défensifs, mais sont aussi présentes dans l'hippocampe. Les synapses chimiques, quant à elles, sont plus lentes, mais aussi beaucoup plus abondantes. Ce
Figure 1-8 : Illustration comparative entre une synapse chimique (A) et
une synapse électrique (B). Noter la diminution de l'intensité du signal suite au passage dans la synapse électrique. (Pereda 2014)
type de synapse, contrairement à sa contrepartie électrique, permet d'amplifier un signal (Pereda 2014). Il est possible, par exemple, de modifier la composition moléculaire du côté axonale (pré-synaptique) ou du côté dendritique (post-synaptique) afin de libérer plus ou moins de neurotransmetteur ou encore d'être mieux préparé à les recevoir, modulant ainsi la réponse à un signal (Shi, Hayashi et al. 1999). C'est cette propriété, nommée plasticité synaptique, que j’ai étudiée au cours de ma maîtrise.
Certaines synapses ont un rôle excitateur alors que d'autres ont un rôle inhibiteur. Les deux types diffèrent par le neurotransmetteur qu'ils reçoivent et par la cascade de réactions qui s'en suit. Dans l'hippocampe, et dans plusieurs autres régions du cerveau, les synapses inhibitrices sont des cibles de l'acide gamma-aminobutirique (GABA) alors que les synapses excitatrices sont ciblées par le glutamate. Ce ne sont toutefois pas les seuls neurotransmetteurs ayant des rôles excitateurs ou inhibiteurs. La dopamine et la sérotonine, par exemple, jouent des rôles importants dans la signalisation des noyaux de la base. La sérotonine y joue un rôle inhibiteur alors que le rôle de la dopamine est déterminé par le type de récepteur présent sur sa cible (Purves, Augustine et al. 2012). Le coté post-synaptique de la synapse excitatrice est formé d'une région très dense en protéines nommée densité post-synaptique (PSD). Cette région est composée de plusieurs protéines d'échafaudage telles que PSD95 et Homer qui jouent des rôles importants dans le positionnement des récepteurs synaptiques (figure 1-9). On y retrouve aussi un réseau extensif de filaments d'actine qui, tel que décrit précédemment, stabilise la forme de la synapse (Dillon and Goda 2005). Plusieurs protéines régulatrices y sont aussi présentes et ont des rôles allant de la stabilisation ou de la déstabilisation du réseau d'actine, à l'apport de
nouveaux récepteurs dans le but d'amplifier la réponse aux signaux. Une de ces protéines, la protéine kinase dépendante de la Ca2+/calmoduline II
(CaMKII) sera décrite plus en détail dans la section 1.4.4 puisqu'elle joue un rôle essentiel dans les mécanismes que j'ai étudiés.
Dans le côté post-synaptique de la synapse excitatrice se retrouvent aussi trois types de récepteurs à glutamate. Deux de ces récepteurs sont des canaux ioniques qui permettront la transduction du signal chimique en signal électrique. Un troisième type de récepteur, qui lui n'est pas un canal ionique, est aussi présent et joue un rôle dans une cascade de signalisation ayant entre autre un rôle de régulation dans la synapse (Sladeczek, Momiyama et al. 1993).
1.3.3 Le récepteur NMDA
Le récepteur NMDA est un tétramère formé par deux sous-unités GluN1 et deux sous-unités GluN2. Chacune de ces sous-unités peut aussi être légèrement différente des autres. Par exemple, par voie d'épissage alternatif du gène GRIN1, le gène responsable de l'expression de GluN1, la cellule possèdera 8 versions différentes de la sous-unité GluN1 qui
Figure 1-9 : Représentation graphique des principales composantes
de la synapse excitatrice. On peut retrouver les récepteurs NMDA et AMPA dans la fente synaptique et le récepteur mGlur à droite de l'image. Plusieurs autres protéines, telle que Homer, CaMKII et PSD95 jouent un rôle important dans la plasticité synaptique. (Kim and Sheng 2004)
seront alors nommées GluN1-1a jusqu'à GluN1-4b. Ceci est aussi vrai pour GluN2 qui possède 4 versions d'épissage alternatif. La version GluN1-1a est de loin la plus abondante, mais la situation est différente pour GluN2. La version GluN2-B est prédominante dans le cerveau en début de développement alors que la version GluN2-A n'arrivera que plus tard dans le développement. C'est le ratio entre ces deux sous-unités qui confère des propriétés cinétiques différentes aux récepteurs NMDA. Les récepteurs formés de sous-unités GluN2-B restent ouverts plus longtemps et induisent donc une réponse synaptique plus forte (Kandel ER 1991, Dingledine, Borges et al. 1999, Purves, Augustine et al. 2012).
L'ouverture du récepteur requiert la synchronisation de plusieurs facteurs. En effet, le récepteur NMDA est un important détecteur de coïncidence puisque la liaison d'une molécule de glutamate, la liaison d'une molécule de d-sérine ou de glycine et une dépolarisation de la membrane cellulaire doivent se produire simultanément
(Blanke ML 2009). La glycine, ou la d-sérine, est relâchée soit par un autre neurone ou par un astrocyte, un autre type de cellule ayant des rôles régulateurs importants dans le cerveau (Harsing and Matyus 2013). Le glutamate est relâché par le côté présynaptique de la connexion et la dépolarisation membranaire provient de l'ouverture des récepteurs AMPA, aussi sensible au glutamate (Purves, Augustine et al. 2012). Lorsque le récepteur NMDA est ouvert, il devient perméable principalement aux ions calcium (Ca2+) qui vont entrer dans la cellule. Le canal est aussi perméable, dans une moindre mesure, aux ions sodium (Na+), qui entreront dans la cellule et aux ions potassium (K+) qui en sortiront
Figure 1-10 : Illustration des différents sites
de liaison du récepteur NMDA et des ions qu'il laisse passé lors de son ouverture.
(Dingledine, Borges et al. 1999). Les rôles des différents ions seront expliqués dans une autre section.
1.3.4 Le récepteur AMPA
À l'instar des récepteurs NMDA, les récepteurs AMPA sont formés de quatre sous-unités. Les sous-unités GluA1 et GluA2 sont les plus abondantes dans l'hippocampe. La sous-unité GluA3 joue aussi un rôle important. Les récepteurs sont formés la plupart du temps par deux dimères, soit deux sous-unités de GluA1 et deux sous-unités de GluA2, GluA3 ou GluA4. Les combinaisons GluA1/A2 et GluA2/A3 sont les plus importantes. Il y a aussi une contribution mineure d'homomères de GluA1 perméables au Ca2+ (Dingledine, Borges et al. 1999). Les récepteurs sont d'abord assemblés dans le réticulum
endoplasmique et ensuite transportés vers les dendrites par une kinésine où ils seront entreposés dans un endosome (Purves, Augustine et al. 2012). Une certaine proportion de ceux-ci seront alors envoyés à la membrane péri-synaptique par un processus d'exocytose encore mal compris. On sait toutefois que l’expression membranaire
des récepteurs GluA2/A3, qui possèdent une queue intracellulaire C-terminale courte, n'est pas affecté par l'activité synaptique alors que l’expression membranaire des récepteurs contenant la sous-unité GluA1, qui a une queue c-terminale plus longue, l'est (Dingledine, Borges et al. 1999, Shi, Hayashi et al. 2001). Ceci permet un renouvellement constant des récepteurs AMPA présents à la synapse et aussi un maintien de leur quantité en condition basale. C'est aussi cette différence qui permet d'augmenter la quantité de récepteurs lorsque la synapse est activée.
Bien que les mécanismes exacts régissant la translocation synaptique des récepteurs AMPA ne soient pas connus, il a été montré à plusieurs occasions que la CaMKII (décrite plus loin) joue un rôle essentiel dans l'accumulation de récepteurs AMPA aux synapses (Lu, Isozaki et al. 2010, Opazo, Labrecque et al. 2010, Lemieux, Labrecque et al. 2012).
Les récepteurs AMPA ne s'ouvrent que lorsqu'au moins deux des quatre sous-unités sont liées à une molécule de glutamate. La liaison du glutamate aux deux sous-unités restantes permet de moduler la force de la réponse (Dingledine, Borges et al. 1999). Les canaux ne restent toutefois pas ouverts très longtemps puisqu'un mécanisme de désensibilisation fait en sorte que le récepteur se ferme après environ une milliseconde même s'il est encore lié au glutamate. Comme les récepteurs NMDA, les sous-unités du récepteur AMPA sont sujettes à l'épissage alternatif. Les différentes combinaisons alors produites auront des vitesses de désensibilisation/resensibilisation différentes. La vitesse de fermeture du canal peut aussi être affectée (Armstrong, Jasti et al. 2006). Les récepteurs AMPA sont perméables aux ions Na+ et K+ et, dans une moindre mesure, aux ions Ca2+. En effet, seuls les canaux n'ayant pas la sous-unité GluA2 sont perméables au Ca2+. Ceci est dû à une modification post-transcriptionelle de l'ARN codant pour la sous-unité GluA2 (Dingledine, Borges et al. 1999). Il a été montré que les récepteurs perméables au Ca2+ (ne contenant pas la sous-unité GluA2) sont présents presqu'uniquement dans les projections des fibres moussues du DG de l'hippocampe (Tóth and McBain 1998).
1.3.5 La plasticité synaptique et l'implication de la CaMKII
La transduction du signal chimique, le glutamate, en signal électrique passe donc principalement par ces deux récepteurs. La participation des deux récepteurs est nécessaire puisque l'ouverture des
récepteurs NMDA requiert une dépolarisation membranaire. Cette dépolarisation initiale sera fournie par l'ouverture des récepteurs AMPA et l'entrée d'ions Na+ qui s'en suivra. Cette entrée d'ions est toutefois trop faible pour créer une dépolarisation qui quittera l'épine synaptique, donc d'effectuer la transduction complète du signal. Elle permet toutefois une dépolarisation locale de la membrane synaptique qui délogera l'ion Mg2+ des récepteurs NMDA avoisinants et qui permettra leur ouverture (Purves, Augustine et al. 2012). Un potentiel excitateur post-synaptique (EPSP) pourra alors être créé. Ce potentiel se propagera ensuite jusqu'au corps cellulaire où des processus d'intégration feront le poids entre les signaux excitateurs et les signaux inhibiteurs. Le résultat de cette intégration mènera ou non au déclenchement d'un potentiel d'action axonal, permettant ainsi au neurone d'envoyer un signal vers une autre cible. Le potentiel d'action axonal, si déclenché, se propagera aussi dans les dendrites du neurone, créant ainsi une dépolarisation globale qui facilitera l'ouverture de récepteurs NMDA additionnels. C'est ce qu'on appelle la propagation rétrograde des potentiels d'actions. Ce phénomène ajoute un élément de renforcement des connexions entre deux cellules puisqu'il facilitera la communication entre les cellules connectées qui s'activent simultanément (Caporale and Dan 2008).
La présence de deux récepteurs, AMPAr et NMDAr, permet aux synapses de s'adapter et de changer la force de leur réponse à un signal. En effet, un changement du nombre de récepteurs AMPA dans le bouton synaptique, par un mécanisme expliqué plus loin, permettra une facilitation, ou l'inverse, dans le cas où le nombre de récepteurs serait réduit, de l'ouverture des récepteurs NMDA.
Outre l'entrée d'ions Na+, l'ouverture du récepteur NMDA permet aussi aux ions Ca2+ d'entrer dans l'épine synaptique. Le Ca2+ est un messager intracellulaire très important et il intervient dans plusieurs processus. En quantité trop grande et incontrôlée, le Ca2+ déclenchera une cascade de signalisation qui mènera à la mort programmée (apoptose) de la cellule. En plus petite quantité, le Ca2+ permet l'activation de plusieurs protéines jouant des rôles primordiaux dans l'établissement et le maintien de la potentialisation à long terme (LTP) de la synapse (Alberts 2008).
Une d’entre elles, la CaMKII, est une des plus abondantes protéines du cerveau, toutes catégories confondues. Elle représente de 1 à 2% de la totalité des protéines du cerveau et elle est présente dans toutes les sections des neurones de l'hippocampe, incluant les épines dendritiques (voir figure 1-6) où elle joue un rôle important de régulateur de l'activité (Erondu and Kennedy 1985). Sa forme en dodécamère lui permet d'interagir avec plusieurs partenaires proximaux simultanément (figure 1-12). L'activation de la CaMKII requiert sa liaison avec une unité de
Figure 1-12 : Représentation des formes fermée (inactive) et ouverte (active)
de la CaMKII. (A) On voit ici une représentation simplifiée des deux isoformes (α et β) les plus courants de la protéine où les sites importants sont représentés en couleurs transposées en (B) et en (C). (Shonesy, Jalan-Sakrikar et al. 2014)
calmoduline liée à quatre ions de Ca2+ (Shonesy, Jalan-Sakrikar et al. 2014). L'ouverture des récepteurs NMDA rend donc cette activation très favorable.
La CaMKII, dans sa forme active, peut ajouter un groupement phosphate (-PO32-) aux protéines ayant une séquence R/KXXS/TX. Cette séquence d'acides aminés doit être exposée à l'extérieur de la protéine cible et donc accessible par la CaMKII. Toutefois, il a été montré que la phosphorylation est possible sur des cibles légèrement imparfaites comme, entre autres, la sérine (S) 831 de la sous-unité GluR1 du récepteur AMPA. En effet, la séquence cible dans cette région de la protéine est PXXS ce qui mène à une phosphorylation plus lente et moins efficace, mais qui joue tout de même un rôle très important dans la plasticité synaptique en augmentant la conductivité du récepteur d'environ 50% (Barria, Derkach et al. 1997). Cette augmentation de la conductivité du récepteur AMPA mènera à une facilitation de la dépolarisation locale nécessaire pour déloger l'ion magnésium du récepteur NMDA et induit donc une facilitation de la communication synaptique.
La CaMKII joue aussi un rôle important dans la modulation du nombre de récepteurs AMPA présents à la synapse par sa capacité à phosphoryler Stargazin, un partenaire important des récepteurs AMPA (voir figure 1-9). La Stargazin phosphorylée peut se fixer à PSD95, une protéine d'échafaudage importante dans la densité post-synaptique. Cette fixation fera en sorte que les récepteurs AMPA, liés à la Stargazin, seront eux aussi fixés dans la région synaptique et pourront participer à la transduction du signal (Opazo, Labrecque et al. 2010).
Un autre partenaire important de la CaMKII qui joue un rôle particulier dans le maintient de cette potentialisation synaptique est nulle autre qu'elle-même. En effet, la proximité relative des différentes sous-unités
qui forment le dodécamère fait en sorte qu'en conditions idéales, c'est-à-dire que deux sous-unités avoisinantes soient dans leur conformation ouverte simultanément, il est possible qu'une sous-unité phosphoryle la thréonine (T) 286 de la sous-unité voisine. Cette phosphorylation fait en sorte que l'unité de CaMKII reste en conformation ouverte longtemps après sa dissociation d'avec la calmoduline (Shonesy, Jalan-Sakrikar et al. 2014). Ceci permet une persistance à long terme de son activité même s'il n'y a plus d'entrée de Ca2+ dans la cellule.
Plusieurs groupes de recherches ont examiné le rôle que pourrait jouer la CaMKII dans l’accumulation synaptique des récepteurs AMPA. Le groupe de Ryohei Yasuda, par exemple, a déterminé que la CaMKII joue un rôle limité dans le processus d’exocytose en effectuant des tests d’inhibition pharmacologique (KN62) lors de stimulations très localisée sur une épine dendritique. L’expérience, effectuée en présence de TTX, montre que l’accumulation membranaire des récepteurs AMPA est plutôt dépendante de l’activation de la voie Ras-ERK (Patterson, Szatmari et al. 2010). Il a toutefois aussi été montré par d’autres groupes de recherche, entre autre celui de Roberto Malinow, que la CaMKII joue un rôle important dans le processus d’expression synaptique des récepteurs AMPA (Hayashi, Shi et al. 2000). C’est en fait ce groupe de recherche qui a montré un lien entre le début de l’expression de la sous-unité α de la CaMKII et le début de l’exocytose dendritique dépendante du calcium (CEDE). Ils ont aussi montré que ce type d’exocytose était étroitement lié à l’induction de la LTP (Maletic-Savatic, Koothan et al. 1998). Toutefois, ils n’avaient pas fait à l’époque le lien entre ces événements et l’expression membranaire des récepteurs AMPA. Ce lien n’a d’ailleurs toujours pas été clairement établi. D'autres mécanismes n'impliquant pas nécessairement la CaMKII agissent aussi sur les récepteurs NMDA durant l'induction et le maintien
de la LTP. Par exemple, tel qu’expliqué précédemment, il a été montré que la composition des récepteurs NMDA des épines affectées par la LTP change. Les récepteurs contenant à l'origine la sous-unité GluN2-B seront progressivement remplacés par des récepteurs contenant la sous-unité GluN2-A. Ces derniers montrent des propriétés cinétiques plus rapides et seraient donc plus appropriés à des conditions où des signaux répétés arrivent à la synapse (Massey, Johnson et al. 2004). Toutefois, contrairement aux récepteurs AMPA, la quantité totale de récepteurs NMDA à la synapse ne change pas (Kopec, Li et al. 2006). C'est donc principalement la quantité de récepteurs AMPA piégés à la synapse par les mécanismes décrits plus haut qui permet de moduler l'activité synaptique.
Il ne s'agit cependant pas du seul facteur. En effet, il a été montré qu'une certaine proportion des récepteurs présents à la synapse en condition basale, principalement composés des sous-unités GluA1-2, donc imperméable au Ca2+, sont remplacés par des récepteurs composés de quatre sous-unités GluA1, donc perméables au Ca2+. Ce changement, quoique mineur (<5%), offre une source d'ion de Ca2+ supplémentaire pour faciliter le maintien de la potentialisation (Guire, Oh et al. 2008).
2 Introduction - Photonique
Bien qu’il existe plusieurs techniques de biochimie qui permettent l’étude des interactions entre les différentes protéines décrites au chapitre 1, une technique qui permettrait d’imager et de visualiser directement ce qui se produit serait bien entendu souhaitable. La microscopie traditionnelle, où l'échantillon est simplement agrandi, n'est toutefois pas suffisante, car, les cellules étant composées en grande partie d'eau, il est très difficile et voir même impossible de distinguer quoique ce soit d'intéressant. Cette technique ne permet pas, par exemple, de visualiser directement les protéines. Afin d’accomplir ceci, nous devons trouver un moyen de leur donner un effet de contraste par rapport au reste de la cellule.
La technique la plus utilisée de nos jours est l'ajout de marqueurs fluorescents qui seront attachés par ingénierie génétique spécifiquement à la protéine qui nous intéresse. La première protéine fluorescente qui a été utilisée à cet effet est la protéine fluorescente verte (GFP).
La découverte de cette protéine par Osamu Shimomura (1962) a en effet donné lieu à une vague de développement technique en microscopie. C’est Martin Chalfie, 30 ans plus tard, qui procédera au premier clonage de la GFP qu’il utilise alors pour visualiser l’expression génétique dans E.
coli et C. elegans. Roger Tsien et son groupe ont quant à eux procédé à
la caractérisation du mécanisme de fonctionnement de la GFP et encore aujourd’hui produisent des mutants ayant différentes propriétés. Les travaux de trois chercheurs leur ont d’ailleurs mérité le prix Nobel de chimie en 2008.
La GFP, et toutes ses dérivées développées en laboratoire, constitue donc l'agent de contraste par excellence en imagerie biologique, car grâce à
des techniques génétiques avancées, il est possible "d'accrocher" une unité fluorescente de GFP, par exemple, à une cible de notre choix, une sous-unité de GluA1, et ainsi être capable d'observer spécifiquement les mouvements des récepteurs AMPA dans une cellule vivante.
2.1 La fluorescence
Le principe de la
fluorescence vient de l'interaction entre un photon de longueur d'onde spécifique et un électron de la protéine cible. La GFP possède un spectre d'absorption centré à 488 nm et un spectre d'émission centré à 515 nm (figure 2-1). Au cours des années suivant sa découverte, la GFP a été utilisée comme base pour développer plusieurs autres protéines fluorescentes ayant des propriétés chimiques différentes. Par exemple, la phLuorin super-écliptique (SEP) est une variante qui possède le même spectre que son homologue, mais qui montre une très grande sensibilité aux variations de pH. Dans un environnement acide, comme dans
certaines vésicules intracellulaires (pH ~6.5), la SEP n'est que très peu fluorescente alors qu’elle l'est beaucoup plus lorsqu'elle est exposée à l’environnement plus neutre (ph 7.4) de l’espace extracellulaire (figure
2-300 400 500 600 700 Protéine fluorescente verte (GFP) 100 75 50 25 0 (nm) %
Figure 2-1 : Spectres d'absorption et d'émission de
la GFP. Tiré de l'utilitaire en ligne SpectraViewer de ThermoFisher.
Figure 2-2 : Courbes d’intensité d’émission de
2). C’est d’ailleurs ce phénomène qui m’a permis d’étudier les dynamiques d’exocytose des récepteurs AMPA.
Comme les spectres d’émission et d’absorption de la GFP, et de SEP, font partie de la lumière visible, il est possible d'utiliser des instruments de mesure traditionnels pour les détecter. L'acquisition d'une caméra ultra-sensible peut toutefois être requise dans certains cas où le signal que l'on désire mesurer est très faible et qu'on désire limiter la quantité de lumière envoyée sur l'échantillon. En effet, il est souvent nécessaire, afin d'obtenir un bon signal de fluorescence, d'utiliser un laser à puissance relativement élevée. Dépendamment des conditions expérimentales, l'utilisation d'un tel laser peut causer la décomposition (photoblanchiment) des protéines fluorescentes en espèces réactives (ROS). Il faut toutefois noter que la décomposition en ROS n'est pas le seul mécanisme menant au photoblanchiment d'une protéine. Ce processus cause d'abord la perte du signal, puisque la protéine fluorescente est "morte", mais peut aussi causer un effet toxique sur la cellule et peut causer sa mort dans certains cas. Des techniques d'imageries ont quand même été développées en prenant avantage de ce phénomène. Une de ces techniques, le recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP), permet d'étudier la diffusion de certaines protéines soit dans la membrane cellulaire ou même dans le cytosol.
Le signal produit par la fusion d’une vésicule unique contenant quelques récepteurs AMPA couplés à une SEP étant beaucoup plus faible que le signal produit par tous les autres récepteurs déjà présents à la membrane cellulaire, j’ai dû prendre avantage du phénomène de photoblanchiment afin de pouvoir bien voir les événements d’exocytose (figure 2-3).
D’autres groupes de recherche ont utilisé cette technique par le passé afin d’étudier des protéines membranaires. Le groupe de Jeremy Henley, par exemple, a utilisé cette technique afin de mesurer le recouvrement de fluorescence membranaire associée au récepteur AMPA suivant l’application de NMDA ou de KCl (Hildick, González-González et al. 2012). Afin de faciliter davantage la détection d'un signal membranaire très faible, et de réduire autant que possible le besoin de photoblanchir la membrane, il est possible de faire appel au phénomène de la réflexion totale interne de la lumière. En effet, en envoyant le faisceau de lumière à un angle précis sur la lamelle de verre, il est possible de créer une onde évanescente. Cette onde permettra d'exciter seulement les molécules fluorescentes très près de la lamelle (~400 nm), dans la membrane cellulaire. Cette technique, comparée à la technique traditionnelle où la lumière traverse l'échantillon en entier, permet donc de retirer en très grande partie le signal de fond inutile (figure 2-4). Toutefois, vu la nature tridimensionnelle des neurones en culture, l’utilisation de cette technique est parfois trop restreignante. En effet, lorsqu’on désire imager une section de dendrite qui forme des « s » sur le plan z, en profondeur, l’illumination « TIRF » fait en sorte qu’il est impossible de voir toute la dendrite. Il est alors préférable de faire un compromis et d’utiliser une illumination oblique qui permet de limiter le bruit de fond tout en
Figure 2-1 : Illustration schématique de la région périsynaptique. On voit l’effet du photoblanchiment permet
de visualiser l’insertion des nouveaux récepteurs par le processus d’exocytose. Image créée par Simon Labrecque.
Figure 2-2 : Illustration montrant le parcours de la lumière dans une configuration d'épifluorescence
(gauche) et dans une configuration de réflection totale interne (droite). Il est aussi possible d'obtenir un état intermédiaire, faisant un compromis entre le signal obtenu et le signal de fond. Image tirée de Konopka et Bednarek, 2007
3 Problématique de recherche
Tel qu'expliqué plus haut, la contribution de la CaMKII dans le processus d'expression membranaire des récepteurs AMPA n'est pas claire, possiblement parce que les conditions expérimentales effectuées dans les études sur le sujet étaient différentes l'une de l'autre. Par ailleurs, aucune étude n’a examiné le rôle de la CaMKII dans l’exocytose des récepteurs AMPA en l’absence de TTX.
Pour tester le rôle de la CaMKII dans l’exocytose des récepteurs AMPA, j’ai fait appel à une méthode, mise au point par Simon Labrecque, faisant appel à la microscopie par illumination oblique (Fig 2.4). Cette méthode a été d’abord utilisée par Yudowski et al (Yudowski, Puthenveedu et al. 2007).
Étant donné que la CaMKII promeut l’accumulation de récepteurs AMPA aux synapses (Hayashi, Shi et al. 2000, Opazo, Labrecque et al. 2010) et que Yudowski et al ont montré que l’activité électrique stimule l’exocytose des récepteurs AMPA (Yudowski, Puthenveedu et al. 2007), mon hypothèse est que la CaMKII régule positivement cette exocytose. Nous avons identifié quelques cibles possibles de la CaMKII en introduction telles que Stargazin et certains sites sur la queue C-terminale des récepteurs AMPA. La CaMKII ayant un spectre d'action très large dans les neurones, il est bien possible qu'elle ait un effet à plusieurs étapes du mécanisme d’adressage des récepteurs AMPA aux synapses.
4 Matériel et méthodes
4.1 Culture cellulaire
La dissection et la préparation des neurones hippocampaux de rat ont été effectuées par Francine Nault avec l’aide de Charleen Salesse et de Laurence Emond de notre laboratoire selon un protocole adapté de Hudmon (Hudmon et al, 2005). Les rats étaient sacrifiés à P1 ou P2. Les cellules étaient déposées en trois gouttes de 0,75 million de cellules par mL sur des lamelles de verre de 18mm recouvert de poly-d-lysine, pour permettre l’adhésion, et reposaient dans 2ml de milieu de culture neurobasal supplémenté de B-27 (Gibco)(NBC) dans une plaque de 12 puits. La prolifération des cellules gliales est arrêtée cinq jours suivant la préparation des neurones avec de la Cytosine β-D-arabinofuranoside (ara-C). Ceci permet d’obtenir un environnement plus naturel sans toutefois laisser la glie prendre le dessus sur les neurones.
4.2 Transfection
La transfection des plasmides préparés par la plateforme d’outils moléculaires du centre de Neurophotonique a été effectuée à l’aide de Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Le mélange d’ADN (~0.5 ug/puit) et de Lipofectamine 2000 (2 uL/puit) a été fait dans du neurobasal sans B-27 et laissé au repos pour 20 minutes pour permettre la formation du complexe. Avant l’application de 200 uL du mélange dans chaque puits de culture, j’ai prélevé 1mL du milieu de culture dans lequel les cellules reposaient en le déposant dans une nouvelle plaque stérile. J’ai ajouté 1 mL de NBC dans chaque puits pour un total de 2 mL. J’ai ensuite placé les deux plaques, une avec les cellules dans 1 mL de NBC + 200 µL du mélange d’ADN et de lipofectamine 2000, l’autre avec 2 mL de milieu de culture sans cellule, dans l’incubateur pour 4 h après quoi j’ai transféré les lamelles vers la plaque contenant 2 mL de milieu de culture. Les
cellules restent ensuite à l’incubateur jusqu’à l’imagerie, quelques jours plus tard, dépendamment de l’expérience effectuée et des plasmides choisis. Certains plasmides ont une expression plus forte et deviennent toxiques alors que d’autres ont une expression plus lente et demandent une attente plus longue. Dans le cas de SEP-GluA1 et Homer-dsRED, un marqueur synaptique, avec lesquels j’ai effectué la plupart de mes expériences, j’attendais de 3 à 4 jours selon la disponibilité du microscope. La transfection des cellules a été effectuée 8 ou 11 jours suivant leur préparation. Ces périodes ont été déterminées expérimentalement et donnaient les résultats les plus stables.
4.3 Imagerie
4.3.1 Cellules vivantes
Microscopie
L’imagerie des cellules vivantes a été effectuée sur un microscope Olympus IX71 contrôlé par un script Matlab maison codé par Simon Labrecque. Un objectif à l’huile U-Apo N 100x TIRF d’ouverture numérique de 1.49 a permit d’utiliser la technique d’illumination oblique décrite au chapitre 2.1 et d’obtenir une résolution suffisante pour bien imager les régions synaptiques. L’acquisition des images était prise en charge par une caméra ultra-sensible ProEM de Princeton Instruments à une vitesse de 10 images par seconde. Cette vitesse d’acquisition permet de bien caractériser les événements d’exocytose. Une région d’intérêt était choisie pour chaque cellule imagée. Tel que décrit au chapitre 2, la région était d’abord photoblanchie afin de permettre la détection des événements d’exocytose.
On peut bien voir l’effet décrit dans le clip vidéo 1 où il est d’abord impossible de détecter les événements d’exocytose. Au fur et à mesure que les SEP exposées à la membrane cellulaire sont photoblanchis, il devient possible de détecter des événements de fusion vésiculaire distincts.
La période de photoblanchiment typiquement utilisée lors de mes expériences était d’une durée de 40 secondes où la région imagée était exposée à environ 6,2 mW de puissance laser. Les cellules ont ensuite été imagées pour une période de 100 secondes en utilisant 10% de la puissance laser disponible soit environ 620 uW. Dans le cas où des stimulations ou des drogues telles que le KN93 devaient être appliquée, les cellules subissaient trois sessions d’imageries espacées de 5 minutes. Afin de compenser pour le recouvrement de fluorescence par diffusion membranaire, une courte période de photoblanchiment (~10 secondes)
Figure 4-1 : Démonstration de l’effet de photoblanchiment. On voit
bien dans l’image que le signal associé à un événement d’exocytose est trop faible pour être vu sans la période de photoblanchiment. Accompagné du clip vidéo 1.
était effectuée avant les sessions 2 et 3. Cette période de photoblanchiment permettait de retrouver un niveau de fluorescence similaire à celui du clip vidéo précédent. Il est important d’effectuer cette étape afin de ne pas biaiser le niveau de détection des événements. Système de perfusion
Un système de perfusion a été installé sur la plateforme d’imagerie afin d’assurer la viabilité des cellules lors des longues sessions expérimentales. La température était maintenue à 30°C à l’aide d’un tube chauffant à 6 canaux de Warner Instruments.
Les cellules ont été transférées vers le microscope dans une solution contenant une haute concentration en ions MG2+ chauffée à 37°C. Cette solution permet de faire une transition plus douce vers la solution de perfusion régulière qui contient moins de magnésium et qui est à 30°C. La solution de transfert (block) est composée de 110 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 10 mM de tampon Na-HEPES à pH 7.8, 0.6 mM de CaCl2, 5 mM de MgCl2 et 10 mM de D-Glucose. La solution de perfusion régulière (aCSF) est quant à elle composée de 110 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 10 mM de tampon Na-HEPES à pH 7.8, 1.2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2 et 10 mM de D-Glucose.
4.3.2 Cellules fixées
Fixation
Les cellules ont été stimulées, ou non, pendant 5 minutes par immersion dans une solution de 0 Mg2+ contenant 200 uM de glycine et 2 uM de picrotoxine. Elles ont ensuite été transférées dans une solution d’aCSF régulière pour des périodes de temps différentes après quoi elles ont été transférées dans une solution de PFA à 4% tamponée au phosphate.
correspondre à l’osmolarité du milieu de culture (~240 osm). Les ions divalents pouvant interférer avec la fixation étaient chélatés avec de l’EGTA. Les cellules étaient submergées dans cette solution pour une période de 10 minutes et subséquemment lavées au PBS contenant 0.1M de glycine trois fois. La glycine permet de bloquer l’autofluorescence de la paraformaldéhyde (PFA) et permet ainsi d’obtenir un signal plus clair à la suite du marquage immunocytochimique.
Immunocytochimie
Le marquage par anticorps à été fait en deux étapes très similaires. La première vise à marquer les récepteurs présents à la surface des cellules. Afin de réduire les signaux non-spécifiques une solution de blocage à base de PBS contenant du sérum de chèvre à 10% a été appliquée sur les cellules pour une période de 30 minutes. L’anticorps primaire polyclonal anti-GFP de Clontech a été déposé sur les cellules pendant 2 heures à une concentration 1 : 500. Les cellules étaient ensuite lavées 2 fois avec la solution de blocage et 3 fois avec du PBS. Les lavages étaient d’une durée de 5 minutes chacun. L’anticorps secondaire Alexa-633 anti-lapin à ensuite été appliqué pendant 1 heure à une concentration 1 : 1000. Cinq lavages au PBS supplémentaires ont été effectués afin de retirer tous les anticorps non liés.
La seconde étape de marquage visait à effectuer un marquage de la quantité totale de récepteurs contenant la construction SEP-GluA1. La solution de blocage a donc été supplémentée de Triton X-100 afin de perméabiliser les membranes. Les autres étapes du marquage sont les mêmes à l’exception de l’anticorps secondaire utilisé. J’ai dans ce cas utilisé un anticorps Alexa-546 anti-lapin à une concentration de 1 : 500.
Les lamelles ont été montées sur des lames de microscopie à l’aide de Prolong Gold de ThermoFisher.
Imagerie et analyse
Les cellules ont été imagées sur un microscope confocal Zeiss Axioskop FS 2 MOT et un objectif à immersion à l’huile Zeiss plan-apochromat 63x. Les images ont été analysées à l’aide d’un script Matlab que j’ai écrit. Le script effectue d’abord une projection maximale des images multi-plans originales. Le bruit de fond est ensuite retiré en effectuant une moyenne de quelques régions sélectionnées manuellement. L’utilisateur choisit ensuite un seuil d’intensité qui permettra d’obtenir un masque binaire recouvrant la cellule d’intérêt. Une option est disponible pour retirer des régions non désirables qui ne peuvent pas être retirées automatiquement par le seuil d’intensité. Un ratio d’intensité de la région correspondant au masque est ensuite effectué en utilisant le canal 546 (marquage total) comme référence. Ce ratio permet de corriger pour le taux d’expression variable du plasmide SEP-GluA1. Il est ainsi possible d’obtenir des résultats plus constants.
5 Résultats
5.1 Exocytose des récepteurs AMPA
5.1.1 Détection et analyse des événements
L’analyse des clips vidéo obtenus suite aux sessions de microscopie était largement prise en charge par un script Matlab codé par Simon Labrecque, se référer au clip vidéo 2 au besoin. Plusieurs étapes automatisées sont nécessaires afin de détecter seulement les événements réels et une étape de confirmation manuelle permet d’éliminer les erreurs. Le script procède par soustraction d’images afin d’identifier les différences entre deux images subséquentes d’une même vidéo. Lorsqu’une différence significative est détectée, l’endroit et le temps exact où l’événement est survenu est pris en note pour révision future. Un rapport d'intensité de fluorescence est alors calculé entre l'image où l'événement
Figure 5-1 : Démonstration des étapes effectuées par le script automatisé. Une étape de
confirmation manuelle est nécessaire pour éliminer les faux positifs. Image et méthode analytique par Simon Labrecque.
a été détecté(n) et l'image précédente(n-1) (deltaF/F). Ce calcul est propagé sur le clip vidéo à partir de l'image n-5 jusqu'à ce que le rapport donne 0, c'est à dire que l'événement se soit complètement dissipé. Ceci permet d'obtenir la trace complète de l'événement d'exocytose et il est ensuite possible d'en extraire un maximum d'information. Un système de seuil est implémenté dans le script d’analyse pour réduire la pollution causée par le bruit d’imagerie. Ce seuil ne peut toutefois pas exclure les bruits de caméra où un groupe de pixel s’allume à saturation. Ce type de bruit est classé comme étant un événement et doit être retiré lors de la confirmation manuelle. La trace de chaque événement est alors conservée et il est possible d’extraire l’information sur leur décroissance ainsi que sur leur amplitude. Les
événements sont ensuite compilés sur une projection maximale de la cellule afin de pouvoir facilement visualiser les résultats (figure 5-2). La résultante de l’analyse est donc une valeur de fréquence des événements qui est mise en relation avec la longueur des dendrites imagés
(hz/um). Figure 5-2: Image composée d’une projection maximale de la région imagée ainsi que de la totalité événements d’exocytose détectés sur une période de 100 secondes en condition basale.
5.1.2 Inhibition aigüe de la CaMKII
J’ai d’abord effectué des expériences visant l’inhibition aigüe de l’activité de la CaMKII. Pour ce faire, j’ai utilisé une perfusion d’aCSF à laquelle j’ai ajouté 10 µM de KN93 ou 10 µM de KN92. Le KN93 se lie de façon compétitive au domaine de liaison à la calmoduline de la CaMKII et empêche donc sont activation. Le KN92, quant à lui, ne peut pas se lier à la CaMKII et est donc utilisé comme contrôle expérimental (Sumi, Kiuchi et al. 1991, Tombes, Grant et al. 1995). Il est important de noter que les deux drogues ont aussi des effets inhibiteurs sur certains canaux ioniques voltage-dépendants (Li, Satoh et al. 1997).
La drogue a été appliquée par perfusion, sans pré-incubation, pendant 5 minutes. Il a donc été possible d’observer l’effet de la drogue en comparant la fréquence d’exocytose d’une cellule avant et après son exposition à celle-ci, ce qui n’est pas possible lors d’une pré-incubation. Les résultats obtenus (figure 5-3), accompagnés du clip vidéo 2, montrent une diminution significative de la fréquence d’exocytose du récepteur dans les cellules traitées avec le KN93, mais pas dans les cellules traitées au KN92. Il faut toutefois noter une légère diminution dans ces cellules, ceci est possiblement causé par les effets non-spécifiques du KN92 décrit précédemment. Cette diminution n’est toutefois pas significative et elle est beaucoup moins importante que celle observée dans le cas du KN93. Les statistiques ont été obtenues avec le test signrank de Matlab. Ce test correspond au test statistique de Wilcoxon pour données pairées.
Ces résultats suggèrent une implication de la CaMKII dans le processus d’exocytose des récepteurs AMPA. Le KN93 ne bloque cependant pas toute l’exocytose, suggérant soit que la drogue ne bloque pas toute la CaMKII dans les cellules ou que d’autres enzymes participent aussi à cette régulation.
5.1.3 Inhibition chronique de la CaMKII
J’ai aussi évalué l’effet de l’inhibition chronique de la CaMKII sur l’exocytose des récepteurs afin de confirmer l’effet incomplet observé lors de l’inhibition pharmacologique aigüe. J’ai d’abord visé l’inhibition directe de la CaMKII par surexpression de son inhibiteur naturel, CaMKIIn, sur une période de 3 jours. Le CaMKIIn est un peptide endogène capable de lier le site T de la CaMKII. Le peptide vient alors recouvrir le site de liaison au substrat et empêche ainsi la CaMKII de phosphoryler ces cibles. La liaison du CaMKIIn au site T empêche aussi la liaison de la CaMKII à la sous-unité NR2B du récepteur NMDA et inhibe ainsi l’accumulation synaptique de la kinase qui est observée lors de la LTP (Thalhammer, Rudhard et al. 2006, Vest, Davies et al. 2007).
Comme il s’agit ici d’une inhibition sur 3 à 4 jours, je m’attendais à observer une diminution très marquée de la fréquence d’exocytose. On peut bien voir cet effet dans la figure 5-4 où chaque événement est
Figure 5-3 : Effet du KN93 sur la fréquence d’exocytose des récepteurs AMPA
contenant la sous-unité GluA1. Une concentration de 10 µM a été utilisée pour les deux drogues. Les colonnes vertes représentent la fréquence d’exocytose 5 minutes après le début de la perfusion des drogues et les colonnes bleues montrent la fréquence d’exocytose 5 minutes après la fin de la perfusion. L’erreur standard sur la moyenne (SEM) est aussi représentée sur le graphique. Accompagné du clip 2.
montré à l’endroit où il est apparu sur la cellule. Comme il s’agit ici d’une inhibition chronique, il n’a bien entendu pas lieu d’observer la cellule à différents temps et il n’est donc pas possible d’obtenir des données pairées. Toutefois, vu la force significative de l’effet d’inhibition observé, il est justifiable d’attribuer ici aussi un rôle de modulateur à la CaMKII. Il est aussi possible d’inhiber
l’activité de la CaMKII en réduisant son expression par voie de shRNA. Cette expérience a été effectuée
principalement par Simon Labrecque et je l’inclus ici comme complément.
Figure 5-4 : Effet de l’inhibition chronique de la CaMKII par son inhibiteur naturel CaMKIIn.
L’inhibition à un effet très fort sur la fréquence d’exocytose et aussi sur le temps de décroissance des événements. Les événements sont donc moins nombreux et disparaissent plus vite qu’en condition contrôle.
Figure 5-5 : Effet de la réduction de la quantité de
CaMKIIα sur la fréquence d’exocytose des récepteurs AMPA. La fréquence d’exocytose est diminuée significativement lorsque la quantité de CaMKIIα est réduite par surexpression du plasmide shRNAα (rouge). La combinaison du plasmide shRNAα avec le plasmide Rescueα (bleu) donne une fréquence d’exocytose similaire à la fréquence contrôle alors que la combinaison avec le plasmide Rescueβ (vert) ne permet pas de retrouver la fréquence d’exocytose contrôle. Les barres d’erreurs représentent l’erreur standard sur la moyenne (SEM). Simon Labrecque (non publié)
On peut voir dans la figure 5-5 que la réduction de la quantité de CaMKIIα disponible cause une diminution significative du nombre d’événement d’exocytose détectés. On peut aussi noter que l’effet est renversé si le plasmide Rescue α est aussi présent. Ce plasmide produit un ARN insensible au shRNA et permet donc de garder un niveau de CaMKII similaire à celui de la condition contrôle.
Les résultats obtenus indiquent une implication importante de la CaMKII dans le processus d’exocytose et viennent confirmer les résultats obtenus lors de l’inhibition aigüe. Il n’est toutefois pas possible d’infirmer la contribution d’autres kinases, car l’inhibition chronique de la CaMKII dérégule plusieurs mécanismes cellulaires qui pourraient avoir des effets indirects sur le processus étudié.
5.1.4 cLTP
J’ai montré jusqu’ici que la CaMKII joue un rôle important dans le processus d’exocytose des récepteurs AMPA. J’ai aussi expliqué plus tôt comment la CaMKII est activée lors de la LTP et comment cette activation est importante lors de l’accumulation de récepteurs AMPA dans les synapses. J’ai donc posé l’hypothèse que l’induction de LTP causerait une augmentation de la fréquence de détection d’événement d’exocytose de récepteurs AMPA.
Afin de tester cette hypothèse, j’ai d’abord effectué des tests d’accumulation synaptique de récepteurs AMPA afin de déterminer le meilleur protocole de stimulation. Cet effet a déjà été montré par le passé (Opazo, Labrecque et al. 2010) et j’ai donc pu utiliser les résultats
Figure 5-6 : Démonstration de l’accumulation synaptique de récepteurs AMPA causé par l’application d’un protocole de cLTP. Le KN93 bloque l’effet. (Opazo,
