Méthodes d’évaluation de l’activité des antibiotiques ou détermination des sensibilités aux antibiotiques in vitro : CMI et CMB (Evaluation de l’antibiorésistance)
Les tests de sensibilité bactérienne les plus répandus ont pour but d'étudier l'effet bactériostatique ou bactéricide des antibiotiques. Pour chaque souche bactérienne, on peut définir une concentration minimale inhibitrice (CMI) qui correspond à la concentration minimale d'antibiotique qui inhibe la croissance visible du germe. Elle est donc associée à un phénomène macroscopique, ce qui explique sa relative facilité d'obtention et son universalité. Il existe deux grandes familles de tests pour étudier l'effet bactériostatique ou bactéricides : Ceux utilisant une méthode quantitative aboutissant à un résultat chiffré correspondant à une CMI : ce sont les tests par dilution, ou ceux utilisant une méthode qualitative permettant de classer les bactéries en sensible(S), ou résistante(R) : ce sont les tests par diffusion.
Toutes ces méthodes doivent suivre des règles de standardisation rigoureuses pour pouvoir être reproductibles, interprétables et comparables au sein du laboratoire, du pays ou entre les Etats.
Toutefois il existe autres méthodes pour l’étude de l’antibiorésistance utilisant des méthodes génotypiques permettant de détecter les déterminants génétiques de la résistance. La PCR (Polymerase Chain Reaction) est classiquement utilisée. Cependant le développement des techniques de biologie moléculaire a permis de développer des puces à ADN qui peuvent détecter un large panel de gènes de résistance.
1. Méthode par dilution
Le Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CA SFM),‐ (Comité de l'antibiogramme 2005) définit la CMI comme étant la plus faible concentration d'une gamme de dilution d'antibiotique de demi en demi qui inhibe la croissance visible du germe. L'avantage des méthodes par dilution est leur relative souplesse d'utilisation puisqu'on peut supplémenter le milieu de culture pour des germes à besoin particulier et utiliser n'importe quel antibiotique pourvu qu'il soit disponible sous forme de poudre ou liquide. De plus, les résultats peuvent être donnés sous forme de CMI et/ou sous forme de classification ‘’Sensible(S)/Intermédiaire (I)/Résistant (R)’’. Ces techniques de dilution, sur milieu solide ou en milieu liquide, sont les méthodes de référence.
1.1. Méthodes par dilutions successives en milieu liquide
Le principe est le même que pour le milieu solide sauf que l'on travaille en milieu liquide (Figure 6). On peut faire une distinction entre des méthodes de macrodilution et des méthodes de microdilution.
1.2. Méthode par dilutions successives en milieu solide
Cette méthode consiste en l’ensemencement de géloses contenant des concentrations décroissantes en antibiotique. On recherche la plus faible concentration pour laquelle il y a inhibition macroscopique de la croissance bactérienne. La lecture des CMIs est effectuée à l’œil nu. La concentration inhibitrice à considérer est la concentration minimale d’antibiotique
Concentration d’antibiotiques
mg/l
Même inoculum bactérien
10 6 bactéries/ml
pour laquelle aucune croissance n’est détectée. C'est une méthode de référence du fait de sa standardisation et qui permet d'évaluer les performances des autres tests.
2. Méthode par diffusion en milieu solide
Ce test consiste en l'application de disques imprégnés d'antibiotiques sur une gélose préalablement ensemencée par des bactéries. L'antibiotique va diffuser dans la gélose avec une concentration décroissante vers la périphérie. Dans la zone où la concentration est inhibitrice, on n'observera pas de croissance bactérienne. Avec la mesure du diamètre de la zone d'inhibition et grâce à des abaques, on pourra classer la bactérie en sensible (S) ou résistante (R). L'analyse de l'efficacité de différents antibiotiques sur une souche bactérienne donne un antibiogramme.
Exemple de gélose avec des disques d’antibiotiques et une souche bactérienne ayant une sensibilité variable aux antibiotiques testés.
Courbe de concordanc : diamètre d’inhibition = f (log CMI par dilution)
3. Etablissement de la courbe de concordance
Pour un grand nombre de souches, on met en relation le diamètre d'inhibition avec la CMI obtenue par une des méthodes de dilution: on obtient un nuage de points dans un graphique représentant le diamètre en fonction du log2 de la CMI . On peut calculer alors une courbe de régression, appelée courbe de concordance, qui met en relation la CMI avec le diamètre de la zone d’inhibition de croissance bactérienne.
4. Origine génétique de la résistance et modalités de transfert génétique
La résistance bactérienne à un antibiotique est d’origine génétique. Les gènes de résistance se trouvent soit dans le chromosome (résistance chromosomique), soit dans des éléments mobiles, comme plasmides, éléments transposables ou intégrons (résistance extra chromosomique). La résistance peut être soit naturelle,‐ soit acquise.
4.1. Résistance naturelle (ou intrinsèque)
Les gènes de résistance font partie du patrimoine génétique de la bactérie, la résistance naturelle est un caractère présent chez toutes les souches appartenant à la même espèce. Ce type de résistance est détecté dès les premières études réalisées sur l’antibiotique afin de déterminer son activité et contribue à définir son spectre antibactérien. Cette résistance peut être due à l’inaccessibilité de la cible pour l’antibiotique, à une
faible affinité de la cible pour l’antibiotique ou encore à l’absence de la cible. Par exemple, la résistance des
entérobactéries et de Pseudomonas aux macrolides ou des bactéries à Gram négatif à la vancomycine est naturelle. La résistance intrinsèque est permanente, stable est transmissible à la descendance (transmission verticale) lors de la division cellulaire, mais elle n’est généralement pas transférable d’une bactérie à l’autre (transmission horizontale).
Les bactéries, préalablement sensible à un antibiotique, peuvent développer une résistance à cet antibiotique, ce qui implique des changements génétiques chromosomiques ou extra chromosomiques. Elles ne‐ concernent que quelques souches, d’une même espèce, normalement sensibles à un antibiotique donné. La résistance acquise possède généralement un faible risque de transmission horizontale lorsque la résistance est la suite d'une mutation chromosomique. En revanche, la résistance acquise est considéré comme ayant un potentiel plus élevé pour la diffusion horizontale de résistance aux antibiotiques, lorsque les gènes de résistance sont présents sur des éléments génétiques mobiles.
5. Les mécanismes de résistance aux antibiotiques
Le Tableau ci-dessous résume les mécanismes de résistance majeurs des principales classes d’antibiotiques.
5.1. Résistance par inhibition enzymatique
Le micro organisme produit une enzyme qui détruit ou inactive l’antibiotique. La‐ production enzymatique peut être induite par un facteur externe (un antibiotique) ou constante (non affectée par des stimuli externes). On appelle inductible une résistance qui se produit à la suite d’une exposition à un agent d’une classe pharmacologique donnée et constitutive lorsque les gènes à l’origine de la résistance s’expriment en permanence, même en l’absence de tout antibiotique. Les béta lactamases sont des enzymes produites par les bactéries et transmises‐ par des chromosomes ou des plasmides. Elles constituent un mécanisme de résistance très efficace. Les béta lactamases inactivent les lactamines en détruisant le lien amide sur‐ le cycle lactame. Puisque ce sont les antibiotiques les plus prescrits au monde, il n’est pas étonnant que la résistance à cette importante classe d’antibiotique pose un problème inquiétant.
5.2. Réduction de la perméabilité cellulaire
Les bactéries sont des micro organismes unicellulaires: une membrane cytoplasmique‐ sépare leur cytoplasme du milieu externe. Les bactéries à Gram négatif sont également munies d’une enveloppe additionnelle, la paroi externe, qui sert de barrière et protège les protéines de liaison aux pénicillines (PLP) du milieu externe. Les nutriments et les antibiotiques doivent traverser cette enveloppe pour pénétrer dans la bactérie. Le passage se fait par diffusion passive à travers les canaux que forment les protéines caniculaires nommées porines.
La réduction de la perméabilité cellulaire se produit par diminution de l’entrée de l’antibiotique sur son site, provoquée par une modification de la perméabilité de la membrane interne ou externe de la bactérie. Une altération des porines dans la paroi des bactéries à Gram négatif peut réduire ou bloquer la pénétration de l’antibiotique jusqu’à son site d’action. Les mutations des porines joueraient un rôle important dans l’émergence d’une résistance, particulièrement à la suite d’une réduction du calibre des canaux ou du nombre de porines.
5.3. Altération (ou modification) des sites de liaison
Altération des protéines de liaison aux pénicillines (PLP) aussi connues sous PBP (Penicillin Binding Protein)
Ce phénomène réduit l’affinité de la cible (PLP) pour les beta lactamines soit par une‐ mutation des gènes chromosomiques, soit par l’acquisition de gènes supplémentaires exprimant de nouvelles PLP. Ce mécanisme de résistance est important chez les cocci à Gram positif, alors qu’il serait beaucoup plus rare chez les bactéries à Gram négatif.
Altération des sites de liaison ribosomaux
L’altération intracellulaire de la sous unité ribosomale ciblée dans la bactérie peut‐ atténuer les effets antibactériens des macrolides, de la tétracycline, des aminosides ou du chloramphénicol, cette altération va empêcher l’antibiotique d’inhiber la synthèse protéique et donc la croissance bactérienne car il ne peut plus se lier au site ribosomal.
Altération de l’ADN-gyrase et de la topoisomérase
L’ADN gyrase est une enzyme nécessaire à l’activité des quinolones. Des mutations spontanées d’un seul acide aminé de l’ADN gyrase engendrent de la résistance à des antibiotiques. Il en est de même pour les mutations de la topoisomérase.
Altération des précurseurs cibles de la paroi cellulaire bactérienne
Ce phénomène peut être induit par l’utilisation de la vancomycine, comme pour l’entérocoque résistant à la vancomycine.
Altération des enzymes cibles
Une modification de la dihydroptéroate synthétase résistant à la liaison avec les sulfamides et de la dihydroptéroate réductase insensible au triméthoprim entraîne également une résistance. La résistance des bactéries à Gram négatif envers les sulfamides est attribuable aux plasmides générant des enzymes résistantes.
5.3. Pompes (transporteurs) à efflux
L’antibiotique ne peut atteindre son site d’action par pompage actif de l’antibiotique vers l’extérieur de la bactérie (efflux). Les transporteurs d’efflux de plusieurs antibiotiques sont des composants normaux des cellules bactériennes et contribuent pour une large part à la résistance intrinsèque des bactéries à de nombreux agents antibactériens. Ces pompes ont besoin d’énergie. L’exposition aux antibiotiques favorise une surexpression par mutation de transporteurs, entraînant une hausse de la résistance bactérienne. Il est également possible qu’une résistance par efflux apparaisse à cause de l’exposition à un antibiotique d’une autre classe. Ainsi, on sait que la ciprofloxacine peut favoriser l’émergence d’une résistance à la céphalosporine et aux macrolides par la voie de ce mécanisme.
Antibiotique Résistance chromosomiqu Résistance ext chromosomique
Aminoside Diminution de la
perméabilité
Modification de la cible (protéine S12 sous unité 30S).‐
Inactivation par acétyltransférases
beta-lactamines
Diminution de la perméabilité, Diminution de l’affinité des PLP, Diminution de la synthèse des PLP, Synthèse de
nouvelles
PLP, Inactivation enzymatique par des
céphalosporinases.
Inactivation par diverses ß lactamases ou carbapénémases.
bet lactamines est inhibiteurs de beta-lactamases Inactivation par des céphalosporinases chromosomiques.
Inactivation par ß lactamases hyperproductrices et ß lactamases‐ résistantes aux inhibiteurs.
Glycopeptides
Modification de la cible, Diminution de l’affinité,
ERV, 6 gènes de résistance identifiés (VanA, VanB, etc).
Macrolide Méthylation du ribosome bactérien
(ARN 23S).
Chloramphénicol Diminution de la perméabilité Efflux actif Inactivation
par acétyltransférases. Quinolones
Modification de la cible ADN gyrase ou topoisomérase IV (gène gyrA, gyrB ou par C) par mutation spontanée,
Diminution de la perméabilité.
Rifampicine Modification de la cible
(ARN polymérase ADN dépendante).
Sulfamidé Diminution de la perméabilité,
Modification par mutation de la dihydroptéroate synthétase.
Dihydroptéroate synthétase
additionnelle sans affinité pour sulfamidés.
Tétracyclines Diminution de la perméabilité Efflux actif spécifique
Triméthoprime Diminution de la perméabilité,
Mutation de
dihydrofolate réductase.
Dihydrofolate réductase additionnelle insensibleau triméthoprime.
