Composition et atteintes musculaires du quadriceps des
patients atteints de la maladie pulmonaire obstructive
chronique
Mémoire
Sandra Martineau
Maîtrise en médecine expérimentale - avec mémoire
Maître ès sciences (M. Sc.)
Résumé
Introduction
Les patients atteints de la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) ont une dysfonction importante au niveau des muscles locomoteurs caractérisés, entre autres, par de la faiblesse, de l’atrophie et des dommages oxydatifs. Certains auteurs ont également suggéré que la fonction mitochondriale soit altérée dans la MPOC, possiblement en lien avec le tabagisme.
Objectifs
Évaluer la fonction et le nombre de mitochondries, ainsi que les dommages à l’ADN chez les sujets atteints de la MPOC et déterminer les effets du tabagisme sur les mitochondries et la qualité du muscle, indépendamment de la maladie.
Méthodes/Résultats
Nous avons recruté 22 patients atteints de la MPOC et 23 sujets témoins. Tous sont ex-fumeurs et sédentaires. Une biopsie du quadriceps a été effectuée. Nous avons démontré que les sujets atteints de la MPOC ont une plus grande proportion de fibres dont le complexe IV de la chaine de transport des électrons ne fonctionne pas comparativement aux sujets témoins (p=0,032). Ils ont également une diminution de l’expression de la protéine SDHB (succinate dehydrogenase complexe iron sulfur subunit B) (complexe II) comparativement aux sujets témoins (p=0,002), mais celle de la protéine COX4 (cytochrome c oxidase subunit 4) (complexe IV) est similaire entre les deux groupes (p=0,076). Il n’y a pas de différence entre les deux groupes pour la présence de la délétion commune, la quantité de mitochondries, l’expression protéique de MFN1 (mitofusin-1), MFN2 (mitofusin-2), TFAM (mitochondrial transcription factor A) et Mn-SOD (manganese-dependent superoxide dismutase) et la quantité de 8-OHdG (8-hydroxy-2’-deoxyguanosine) présente dans l’ADN. Il y a une corrélation entre l’exposition cumulative au tabac (nombre de paquets-année) et la quantité de 8-OHdG (p=0,026), la proportion de fibres déficientes en COX (p=0,002), l’atténuation
musculaire moyenne (p=0,041) et l’atténuation du muscle normal (p=0,020) lorsque tous les sujets (témoins et MPOC) sont regroupés.
Conclusion
Nous avons démontré qu’il y a des anomalies de la fonction mitochondriale dans la MPOC. Il est intéressant de noter que le tabac affecte la fonction des mitochondries et la qualité du muscle de façon indépendante à la MPOC.
Abstract
Rationale
Patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) demonstrate a locomotor muscle dysfunction characterized by weakness, atrophy and poor oxidative capacity. Some authors also suggested that the mitochondrial function might be altered in this disease, possibly linked with smoking.
Objectives
To evaluate the function and the number of mitochondria, and DNA damage in patients with COPD and to determine the effects of smoking on the mitochondria and the quality of the muscle, independently of the disease.
Methods/Results
We recruited 22 patients with COPD and 23 healthy subjects. All were ex-smokers and sedentary. A biopsy of the quadriceps was performed. We demonstrated that patients with COPD had a larger proportion of COX (cytochrome c oxidase)-deficient fibers than healthy subjects (p=0.032). They also had a decreased expression of the protein SDHB (succinate dehydrogenase complex iron sulfur subunit B) (complex II) compared to controls (p=0.002), but no change in the expression of the protein COX4 (cytochrome c oxidase subunit 4) (complex IV) (p=0.076). There was also no difference between the two groups for the common deletion, the quantity of mitochondria, the protein expression of MFN1 (mitofusin-1), MFN2 (mitofusin-2), TFAM (mitochondrial transcription factor A) and Mn-SOD (manganese-dependent superoxide dismutase) and the quantity of 8-OHdG (8-hydroxy-2’-deoxyguanosine) in the DNA. There was a correlation between the cumulative smoking exposure (pack-year) and the quantity of 8-OHdG (p=0.026), proportion of COX-deficient fibers (p=0.002), mean muscle attenuation (p=0.041) and attenuation of the normal muscle (p=0.020) when all subjects (healthy and COPD) were regrouped.
Conclusion
We demonstrated evidences of mitochondrial dysfunction in COPD. Interestingly, there was an effect of smoking on the mitochondria and the quality of the muscle, independently of COPD.
Table des matières
RÉSUMÉ ...II ABSTRACT ... IV TABLE DES MATIÈRES ... VI LISTE DES TABLEAUX ... VIII LISTE DES FIGURES ...IX REMERCIEMENTS ...X
INTRODUCTION ... 1
LA MALADIE PULMONAIRE OBSTRUCTIVE CHRONIQUE (MPOC) ... 1
Généralités ... 1 L’emphysème ... 2 La bronchite chronique... 2 Épidémiologie ... 3 Étiologie ... 3 La cigarette ... 3 Déficits génétiques ... 3 Facteurs environnementaux... 4 Atteintes extra-pulmonaires ... 5
Survol rapide des traitements ... 5
LE MUSCLE SQUELETTIQUE ... 5
Les types de fibres ... 7
La mitochondrie ... 8
Structure ... 9
La respiration cellulaire aérobie ... 10
Glycolyse ... 10
Cycle de l’acide citrique ... 10
Phosphorylation oxydative ... 11
La chaine de transport des électrons ... 11
L’ATP synthase ... 13
ADN mitochondrial ... 13
La mitochondrie : une organelle dynamique ... 14
Densité musculaire et fonction musculaire ... 16
LA DYSFONCTION MUSCULAIRE ASSOCIÉE À LA MPOC ... 16
La force et l’endurance du quadriceps ... 18
L’atrophie musculaire ... 18
La distribution des fibres musculaires ... 18
La capacité oxydative ... 19
La fonction mitochondriale ... 19
Le tabagisme ... 20
CHAPITRE 1 PROBLÉMATIQUE, OBJECTIFS ET HYPOTHÈSES DE RECHERCHE ... 22
CHAPITRE 2 MATÉRIEL ET MÉTHODES ... 25
2.1 RECRUTEMENT DES SUJETS ... 25
2.2 TESTS DE FONCTIONS PULMONAIRES ET MESURES ANTHROPOMÉTRIQUES ... 26
2.3 BIOPSIES ... 27
2.4 TOMODENSITOMÉTRIE DE LA CUISSE ... 27
2.5 IMMUNOBUVARDAGE ... 28
2.5.1 Extraction des protéines ... 28
2.5.2 Électrophorèse ... 29
2.6 EXTRACTION DE L’ARN ... 30
2.6.1 Rétrotranscription (RT) ... 30
2.6.2 Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) ... 31
2.7 EXTRACTION DE L’ADN ... 32
2.7.1 qPCR ... 32
2.7.2 ELISA pour mesurer le 8-OHdG dans l’ADN ... 33
2.8 HISTOCHIMIE POUR LES FIBRES COX-DEFICIENT ... 35
2.9 ANALYSES STATISTIQUES ... 36
CHAPITRE 3 RÉSULTATS ... 37
3.1 CARACTÉRISTIQUES DES SUJETS ... 37
3.2 LES COMPLEXES DE LA CHAINE DE TRANSPORT DES ÉLECTRONS ... 37
3.3 BIOGENÈSE MITOCHONDRIALE ... 39
3.4 L’EXPRESSION DES MODULATEURS DE LA FUSION MITOCHONDRIALE,MFN1 ET MFN2 ... 41
3.5 LES DOMMAGES OXYDATIFS ... 41
3.6 EFFETS DU TABAGISME SUR LE MUSCLE SQUELETTIQUE, INDÉPENDAMMENT DE LA MALADIE ... 42
CHAPITRE 4 DISCUSSION ... 44
4.1 LES COMPLEXES DE LA CHAINE DE TRANSPORT DES ÉLECTRONS ... 44
4.1.1 Complexe IV ... 45
4.2 LES DOMMAGES OXYDATIFS ... 46
4.3 LE TABAGISME INFLUENCE LA DENSITÉ DU MUSCLE ... 47
4.4 L’INTÉGRITÉ DE L’ADN MITOCHONDRIAL ... 47
4.5 LIMITES DE L’ÉTUDE ... 48
CONCLUSION ET PERSPECTIVES ... 50
Liste des tableaux
Tableau 1. Classification de la sévérité de l’obstruction chez les patients atteints de la MPOC. ... 1 Tableau 2. Caractéristiques des différents types de fibres du muscle squelettique
humain. ... 8 Tableau 3. Séquences des amorces utilisées pour les qPCR sur l’ADN. ... 33 Tableau 4. Caractéristiques des sujets de l’étude... 37
Liste des figures
Figure 1. Structure du muscle squelettique [27]. ... 7 Figure 2. Structures de la mitochondrie [31]... 9 Figure 3. Composantes impliquées dans la dysfonction musculaire chez les
patients atteints de la MPOC selon l’American Thoracic Society [49]. ... 17 Figure 4. Représentation schématique des manipulations effectuées lors de cette
étude ... 26 Figure 5. Limites d’atténuation prédéterminées pour l’analyse des images de
tomodensitométrie ... 28 Figure 6. Réaction de formation du 8-OHdG ... 34 Figure 7. Expression protéique de SDHB et COX4 dans le muscle vastus lateralis.
... 38 Figure 8. Mesure, par histochimie, de l’état fonctionnel du complexe IV de la
mitochondrie du muscle vastus lateralis... 39 Figure 9. Expression protéique et de l’ARNm de TFAM dans le muscle vastus
lateralis. ... 40
Figure 10. Expression protéique de MFN1 et MFN2 dans le muscle vastus lateralis. ... 41 Figure 11. Les dommages oxydatifs dans le muscle vastus lateralis. ... 42 Figure 12. Effets du tabagisme sur le muscle squelettique de manière
Remerciements
Tout d’abord, j’aimerais remercier mon directeur de maitrise, Dr François Maltais pour sa confiance et son support tout au long de ces nombreuses années. Votre passion est contagieuse et je me considère très chanceuse d’avoir été sous votre mentorat.
Merci également à mon codirecteur, Dr Sébastien Bonnet, pour ta disponibilité et tes conseils, mais aussi pour m’avoir donné ta confiance en m’offrant une opportunité sans égale de faire partie dans ton équipe de professionnel(le)s de recherche avant même la fin officielle de ma maitrise.
Les personnes sans qui cette expérience n’aurait pas été aussi enrichissante, mais surtout agréable : Dany et Annie. Vous m’avez appris plus que de simples techniques de laboratoire. Vous m’avez appris à travailler avec rigueur et intégrité, mais aussi à m’amuser en le faisant ! Je n’oublierais pas nos fous rires, délires et écureuils, malgré les bourrages papier et les périodes plus difficiles. Je suis heureuse d’avoir travaillé avec vous, mais encore plus de vous compter parmi mes amis. Dany, tu es la personne qui a rendu cette aventure possible en parlant en ma faveur à Dr Maltais lorsque je me cherchais un stage au baccalauréat, malgré le fait qu’on ne se connaissait pas tant que ça à ce moment-là, chose qui a bien changé depuis!
Finalement, merci à ma famille, mon père, ma mère et mon frère. Vous m’avez toujours soutenu et encouragé dans mes choix. Je vous aime.
Introduction
LA MALADIE PULMONAIRE OBSTRUCTIVE CHRONIQUE (MPOC)
Généralités
La MPOC est caractérisée par une obstruction de l’écoulement de l’air dans les voies respiratoires [1]. L’ATS et l’ERS définissent la MPOC comme « a preventable and treatable disease state characterized by airflow limitation that is not fully reversible. The airflow limitation is usually progressive and is associated with an abnormal inflammatory response of the lungs to noxious particles or gases, primarily caused by cigarette smoking. Although COPD affects the lungs, it also produces significant systemic consequences »[2]. Les symptômes de la maladie sont la dyspnée, une toux chronique et une production accrue de mucus [3]. Le degré d’obstruction bronchique est séparé en 4 catégories selon la Global Initiative
for Chronic Lung Disease (GOLD) (Tableau 1) [4]. Le degré d’obstruction est
déterminé selon le rapport du volume expiratoire maximal seconde (VEMS) sur la capacité vitale forcée (CVF). Une valeur inférieure à 0,7 indique une obstruction bronchique alors que la sévérité de l’obstruction est déterminée par le VEMS.
Tableau 1. Classification de la sévérité de l’obstruction chez les patients atteints de la MPOC.
Chez les patients dont le rapport VEMS/CVF<0.70
GOLD 1 Léger VEMS ≥80% de la prédite GOLD 2 Modéré 50%≤ VEMS <80% de la prédite GOLD 3 Sévère 30%≤ VEMS <50% de la prédite GOLD 4 Très sévère VEMS <30% de la prédite
La MPOC est une maladie chronique qui évolue lentement au cours des années et est partiellement réversible. La progression de la maladie entraine des épisodes d’aggravation plus fréquents (appelés exacerbations), un débit aérien de plus en plus limité, un essoufflement qui limite l’activité et réduit la qualité de vie et peut ultimement causer une mort précoce [3]. La progression de la maladie est variable d’un individu à l’autre. Ce ne sont pas toutes les personnes qui vont développer la maladie à la même vitesse et au même degré de sévérité. La MPOC regroupe deux pathologies : l’emphysème et la bronchite chronique.
L’emphysème
L’emphysème est caractérisé par une perte d’élasticité au niveau des alvéoles pulmonaires dont la paroi se détruit progressivement ce qui va mener, au fil du temps, à la formation de bulles d’emphysème. C’est au niveau des alvéoles que les échanges gazeux entre l’air des poumons et le sang sont faits. Plus la surface de contact entre l’air et le sang est grande, plus il y a de molécules d’oxygène et de CO2 qui peuvent se déplacer. Ainsi, lorsque les alvéoles sont endommagés ou
détruits, comme dans le cas de l’emphysème, la surface de contact est diminuée et les échanges gazeux entre l’air et les poumons sont moins efficaces. De plus, lors de l’expiration, la pression intrapleurale augmente graduellement et peut même devenir supérieure à la pression à l’intérieur des voies aériennes ce qui entraîne un phénomène de compression dynamique des voies respiratoires et par le fait même, un collapsus des voies respiratoires et une gêne accrue au passage de l’air. Ce problème survient particulièrement dans l’emphysème où l’on retrouve une perte du soutient structural péribronchique et il est amplifié durant l’expiration forcée ou active. Il y a alors une séquestration d’une quantité anormale d’air au sein des poumons. Malheureusement, cet air est stagnant et contient très peu d’oxygène et ne contribue donc pas à l’oxygénation du sang.
La bronchite chronique
La bronchite chronique est caractérisée par la présence d’inflammation constante au niveau des bronches. Il y a également une production accrue de mucus
qui contribue à l’obstruction des voies respiratoires. La définition clinique de la bronchite chronique est la présence d’une toux chronique et la production d’expectorations sur une durée d’au moins trois mois pendant deux années consécutives [5].
Épidémiologie
Selon l’Organisation mondiale de la Santé (OMS), la MPOC est la 4e cause
de mortalité au monde [6]. En 2015, 3,2 millions de personnes en sont décédées [7], ce qui représentait plus de 5% de tous les décès répertoriés dans le monde. Environ 65 millions de personnes dans le monde en seraient atteintes. En 2009-2010, 772 200 Canadiens et Canadiennes ont déclaré avoir eu un diagnostic de MPOC [8]. Cela représente 4% de la population canadienne. On prédit que d’ici 2030, la MPOC sera la 3e cause de décès au monde [1]. Dans le passé, il y avait plus d’hommes qui
développaient la maladie. Avec l’augmentation du nombre de femmes qui fument ou qui sont exposées à la pollution de l’air, la maladie affecte maintenant autant de femmes que d’hommes [9].
Étiologie
La cigarette
Le tabagisme est le facteur de risque le plus important pour le développement de la maladie. Il est la cause d’environ 80 à 90% des cas de MPOC [3]. Ce ne sont pas tous les fumeurs qui vont développer la maladie. Une étude a démontré que, chez les fumeurs actifs, 35,5% sont atteints de la maladie [10].
Déficits génétiques
Certaines personnes sont génétiquement prédisposées à une perte prématurée des capacités pulmonaires causée par un déficit en alpha-1 antitrypsine
(AAT). La prévalence de ce déficit est d’environ 1 sur 3 000 à 5 000 personnes [11][12].
Le déficit en AAT est causé par une mutation dans le gène SERPINA1 situé sur le chromosome 14. L’AAT est une protéine produite par le foie. Lorsque la configuration de la molécule d’AAT est altérée suite à une mutation du gène SERPINA1, elle n’est pas relâchée par les hépatocytes et il y a donc une diminution de la concentration d’AAT dans le sérum sanguin et dans les poumons [13]. L’AAT est nécessaire à la protection du tissu pulmonaire contre les protéases. Une concentration insuffisante en AAT dans les alvéoles cause une destruction des parois des alvéoles et, donc, le développement d’emphysème et de la MPOC. Il est estimé que 1 à 5% des cas de MPOC sont causés par un déficit en AAT [14]. Ces personnes ont plus de risques de développer la maladie plus jeune (30-40 ans) que lorsque la cause est la cigarette. Les fumeurs qui ont un déficit en AAT ont tendance à développer de l’emphysème encore plus tôt que ceux qui sont non-fumeurs.
Certains autres gènes, tels que le cytochrome P450A1 et l’alpha2
-macroglobuline ont été démontrés comme étant impliqués dans la pathogenèse de la MPOC [15].
Facteurs environnementaux
L’exposition chronique à la poussière (par exemple, la poussière de charbon ou la poussière céréalière) et à certaines fumées peut également être la cause de la maladie [16]. Certains facteurs, sans être la cause principale du développement de la maladie, peuvent contribuer à son développement. L’exposition à la pollution de l’air causée par la combustion du bois ou d’autres combustibles fossiles, ainsi que l’exposition à certaines poussières peut aggraver les effets du tabagisme et donc augmenter les risques de développer la maladie [17][18]. Des infections répétées ou une exposition à la fumée secondaire du tabac pendant l’enfance causent une diminution des fonctions respiratoires qui peut donner lieu à une prédisposition à la MPOC [19].
Atteintes extra-pulmonaires
La MPOC est maintenant reconnue comme une maladie qui ne touche pas exclusivement les poumons puisque certaines atteintes systémiques variées y sont associées. Le muscle squelettique est un exemple de tissu dont l’intégrité est perturbée au cours de la progression de la maladie. Dans la section 1.3, les atteintes musculaires seront décrites plus en profondeur. Plusieurs autres manifestations extra-pulmonaires ont été démontrées telles que les maladies cardiovasculaires, l’anémie et l’ostéoporose [20].
Survol rapide des traitements
La MPOC est une maladie incurable. L’arrêt tabagique est une étape cruciale dans le traitement de la maladie. Les traitements pharmacologiques actuels, le plus souvent administrés par inhalations, servent à réduire les symptômes, les risques et la sévérité des exacerbations. Ils permettent d’améliorer la tolérance à l’exercice et la qualité de vie des patients. Le choix des thérapies pharmacologique se fait en fonction de la sévérité des symptômes et des risques d’exacerbation. De façon générale, les bronchodilatateurs relaxent les muscles lisses des voies respiratoires et permettent d’améliorer les débits expiratoires ce qui se traduit par un soulagement de l’essoufflement. Quant à eux, les corticostéroïdes en inhalation réduisent l’inflammation bronchique et la survenue des exacerbations [21].
LE MUSCLE SQUELETTIQUE
Le muscle squelettique est fixé au squelette par l’intermédiaire de tendons, ce qui lui permet de remplir sa fonction principale qui est d’assurer la motricité du corps, par la contraction musculaire. Le muscle squelettique remplit plusieurs autres fonctions; il permet le maintien de la posture, la production de chaleur pour l’homéostasie de la température corporelle, il contribue également au métabolisme
énergétique basal et sert de réserve pour des substrats importants, tels que les acides animés et les glucides [22]. Le muscle squelettique est composé de cellules musculaires, de tissu conjonctif, de vaisseaux sanguins et de nerfs. Les muscles sont formés de plusieurs faisceaux organisés parallèlement. Ceux-ci sont séparés entre eux par le périmysium, un tissu conjonctif. Chaque faisceau est formé de plusieurs cellules musculaires, qui sont appelées les fibres musculaires qui sont, elles aussi, organisées de façon parallèle [22][23][24] (Figure 1).
Une fibre musculaire est une cellule de forme cylindrique, multinucléée. Les noyaux se situent en périphérie de la cellule. Chaque fibre musculaire est de la longueur complète du muscle. Elles peuvent atteindre une longueur de 30 cm et un diamètre de 100 µm [23].
La fibre musculaire est organisée en faisceaux qui s’appellent les myofibrilles. Les myofibrilles sont faites de plusieurs sarcomères qui sont les unités contractiles du muscle. La contraction musculaire est un raccourcissement des sarcomères causé par un glissement des filaments d’actine sur ceux de myosine. La myosine est une molécule allongée formée de deux chaines lourdes et quatre chaines légères [24]. La chaine lourde à une tête globulaire à son extrémité N-terminale. Cette tête à une activité ATPasique. Plusieurs molécules de myosine s’assemblent pour former le filament épais. Les têtes globulaires dépassent en périphérie et sont disponibles pour lier l’actine. Cette dernière comporte des sites actifs qui sont cachés par la tropomyosine. Lorsqu’il y a présence de calcium, la troponine vient déplacer la tropomyosine et ainsi exposer les sites actifs. L’adénosine triphosphate (ATP) sur la tête globulaire est hydrolysée en adénosine diphosphate (ADP) et phosphate inorganique (Pi). Il y a liaison entre l’actine et la myosine. Le Pi est relâché, ce qui
entraine un changement de conformation de l’angle de la tête de myosine et un glissement de l’actine sur la myosine [25][26].
Figure 1. Structure du muscle squelettique [27].
Les types de fibres
Les fibres sont classées selon le ou les isoforme(s) de la chaine lourde de myosine (en anglais myosin heavy chain, MyHC) présente(s) dans les sarcomères. Chaque fibre peut contenir une seule ou plus d'une isoforme de la MyHC. Chez l'humain, il existe trois isomères: I, IIa et IIx [28].
Les fibres de type I et IIa ont un métabolisme oxydatif/aérobie [28]. Les fibres qui ont un métabolisme oxydatif ont besoin d'oxygène pour fabriquer de l'énergie sous forme d'ATP. Elles sont riche en mitochondries. Ces organelles, nécessaires pour la production d’énergie, et leur fonctionnement seront décrits ci-dessous. Les enzymes utilisées par ces fibres sont des enzymes oxydatives, telles que la citrate synthase. Elles sont particulièrement en demande lors d'une activité d'endurance, c'est-à-dire qui est de longue durée et d'intensité modérée. Ces fibres ne
développent pas une force importante, mais peuvent soutenir une contraction prolongée. Les fibres oxydatives sont riches en myoglobine et en capillaires, ce qui leur donne leur couleur rouge caractéristique. Les fibres de type IIx, qui ont un métabolisme glycolytique/anaérobie [28], utilisent, plus généralement, le glycogène comme source d'énergie et ont moins de mitochondries que les fibres oxydatives. Elles sont également pauvres en myoglobine. Ces fibres sont sollicitées lors d'activités de courte durée et de haute intensité.
Les fibres peuvent également être caractérisées selon leur vitesse de raccourcissement. Les fibres de type I sont dites lentes, se raccourcissant donc plus lentement que les fibres de type II, qui sont dites rapides [28].
Tableau 2. Caractéristiques des différents types de fibres du muscle squelettique humain. Isoforme MyHC Métabolisme énergétique Vitesse de contraction Sensible ou résistante à la fatigue
I Oxydatif Lente Résistante
IIa Oxydatif Rapide Résistante
IIx Glycolytique Rapide Sensible
La mitochondrie
L’ATP nécessaire pour la contraction musculaire est produite par la mitochondrie. Elle convertit l’énergie contenue dans les nutriments (carbohydrates et acides gras) en énergie qui peut être utilisée par la cellule par un processus nommé la phosphorylation oxydative [29], qui est la dernière étape de la respiration cellulaire aérobie et sera décrit plus loin.
La mitochondrie est une organelle qui est présente dans le cytoplasme de toutes les cellules du corps humain, à l’exception des globules rouges [30]. Chaque cellule contient des centaines, parfois même des milliers de cette organelle, selon leur demande énergétique.
Structure
La mitochondrie est entourée de 2 membranes : la membrane externe qui sépare le cytoplasme de la cellule du contenu de la mitochondrie et la membrane interne qui sépare l’espace intermembranaire et la matrice mitochondriale (Figure 2). La membrane interne contient plusieurs repliements appelés crêtes (ou cristae) [29]. Ces crêtes augmentent la superficie de la membrane interne qui est l’endroit où se situent les complexes de la chaine de transport des électrons, ce qui permet donc à la mitochondrie d’avoir des milliers d’exemplaires de cette chaine.
La respiration cellulaire aérobie
La respiration cellulaire aérobie regroupe trois étapes : i) la glycolyse, ii) le cycle de l’acide citrique et iii) la phosphorylation oxydative [32]. Toutes ces étapes permettent la formation d’ATP par la dégradation du glucose. Le bilan total de la respiration cellulaire aérobie est de 36 à 38 moles d’ATP formé à partir d’une mole de glucose [33]. Ce processus porte son nom, car il nécessite la présence de dioxygène. La première étape, la glycolyse, en elle-même ne nécessite pas de dioxygène, mais les étapes subséquentes en dépendent.
Glycolyse
La glycolyse se produit dans le cytosol de la cellule. Elle est composée de 10 étapes, chacune étant catalysée par une enzyme spécifique. Lors de la glycolyse, 1 mole de glucose permet de former 2 moles de pyruvate, 2 molécules d’ATP et de réduire 2 molécules de nicotinamide adenine dinucleotide oxydé (NAD+) pour former
de la nicotinamide adenine dinucleotide réduit (NADH) et relâcher un proton (H+)
[34][35].
Cycle de l’acide citrique
Le pyruvate formé lors de la glycolyse entre dans la mitochondrie grâce à un mécanisme de co-transport actif de protons et de pyruvate. Ce dernier est, par la suite, transformé en acétyl-CoA, celle-ci étant la molécule nécessaire pour le début du cycle de l’acide citrique.
Le cycle de l’acide citrique, aussi appelé le cycle de Krebs, se déroule dans la matrice mitochondriale. Il est composé de 8 étapes chacune catalysée par une enzyme différente, telle que la citrate synthase, mentionnée plus tôt et qui sont utilisés par les fibres oxydatives/aérobie. Les cellules utilisent ce processus pour produire de l’énergie par l’oxydation de l’acétyl-CoA qui provient de la glycolyse, mais qui peut aussi provenir de la bêta-oxydation ces acides gras ou du catabolisme des protéines [33]. Une seule molécule d’ATP est produite par cycle. Par contre, trois molécules de NAD+ et une molécule de flavine adenine dinucleotide (FAD) sont
réduites, donnant trois NADH + H+ et un FADH2 qui apporteront par la suite leurs
électrons très riches en énergie vers la chaine de transport des électrons [35][36].
Phosphorylation oxydative
La phosphorylation oxydative est la formation d’ATP en présence d’oxygène. Elle se déroule dans la membrane interne de la mitochondrie. La réaction est dite couplée, c’est-à-dire qu’il y a deux réactions qui se produisent et qui sont dépendantes l’une de l’autre : i) le déplacement des électrons à travers la chaine de transport des électrons, ii) la synthèse d’ATP par l’ATP synthase [37].
En bref, le NADH et le FADH2 produits lors de la glycolyse et du cycle de
l’acide citrique cèdent leurs électrons aux complexes I et II de la chaine de transport des électrons, respectivement. Par la suite, ces électrons se déplacent jusqu’au complexe IV. Ce déplacement libère de l’énergie qui permet aux protons de traverser la membrane interne jusqu’à l’espace intermembranaire, ce qui crée un gradient électrochimique de part et d’autre de la membrane. Ce gradient permet ensuite la production d’ATP par l’activation de l’ATP synthase.
La chaine de transport des électrons
La chaine de transport des électrons est un ensemble de molécules qui se situent dans la membrane interne de la mitochondrie. La plupart de ces molécules sont des protéines qui composent les complexes, numérotés de I à IV. Les autres molécules servent majoritairement au déplacement des électrons entre les complexes, tel que l’ubiquinone et le cytochrome c1. Le déplacement des électrons
à travers la chaine ne produit aucune molécule d’ATP directement.
Il y a deux points d’entrée pour les électrons dans la chaine. Les électrons provenant du NADH sont acceptés par le complexe I et ceux du succinate par le complexe II. Par la suite, le trajet est le même : les électrons se déplacent vers le complexe III et, ensuite, le complexe IV [33]. Les électrons du NADH libèrent 33% plus d’énergie pour le déplacement des protons vers l’espace intermembranaire que ceux du FADH2 [38].
Les électrons se déplacent d’un transporteur à l’autre. Chaque transporteur devient réduit lorsqu’il accepte un électron de son voisin en amont (qui a une plus petite affinité pour les électrons) et retrouve sa forme oxydée lorsqu’il cède les électrons à son voisin en aval (qui a une plus grande affinité pour les électrons).
Complexe I : NADH déshydrogénase. La flavine mononucléotide (FMN)
dans le complexe I accepte un électron provenant du NADH. Celui-ci est par la suite transféré à une protéine contenant du fer et du soufre fortement liés (Fe•S). Finalement l’électron est transféré à l’ubiquinone, qui est une petite molécule à l’extérieur du complexe possédant une queue hydrophobe, ce qui lui permet d’être soluble dans les lipides et donc d’être mobile dans la membrane. Le déplacement d’un électron dans ce complexe rend possible le transfert de 4 protons vers l’espace intermembranaire et donc le début de la formation du gradient de protons. Ce complexe est la principale source d’espèces oxygénées réactives (ROS; ions superoxydes et peroxydes) dans la chaine. Il s’agit de produits provenant de la réaction de l’oxygène avec un électron qui s’est échappé [35].
Complexe II : Succinate déshydrogénase. Les électrons du FADH2 sont
acceptés par une molécule de FAD qui est dans le complexe II. Les étapes suivantes sont les mêmes que dans le complexe I : les électrons sont transférés à une protéine Fe•S et ensuite à une molécule d’ubiquinone [35]. Le complexe II est particulier, car il est le seul complexe qui est codé seulement par l’ADN génomique (ADNg) [39]. Les trois autres sont formés de protéines traduites à partir d’ADN génomique et mitochondrial (ADNmt). Ce complexe ne contribue pas à la formation du gradient de protons. Les électrons acceptés par le complexe II peuvent provenir d’autres sources que le glycogène, telles que la dégradation du glycérol-3-phosphate et des acides gras [33]. Le complexe II est composé de 4 sous-unités, dont le succinate
dehydrogenase complexe iron sulfur subunit B (SDHB) [39].
Complexe III : Coenzyme Q-cytochrome c réductase. Les molécules
d’ubiquinone réduites par les électrons provenant des complexes I et II vont par la suite porter les électrons au complexe III. Dans ce complexe, une molécule de cytochrome b va accepter un électron pour le transférer à une protéine Fe•S et
finalement à une molécule de cytochrome c1. Une molécule de cytochrome c, qui se
déplace dans la membrane, va accepter l’électron pour le déplacer vers le complexe IV. Le complexe III permet à 4 protons de se déplacer vers l’espace intermembranaire [35].
Complexe IV : Cytochrome c oxydase (COX). Une molécule de
cytochrome a dans le complexe IV va recevoir l’électron du cytochrome c et le transférer à un cytochrome a3. Finalement, l’électron est utilisé pour former une
molécule d’eau. Deux électrons provenant du complexe IV, deux protons (H+) et une
demi-molécule de dioxygène (O2) sont nécessaires pour la formation d’une molécule
d’eau (H2O). C’est à cette étape que l’oxygène est nécessaire. Le complexe IV
permet de pomper quatre protons dans l’espace intermembranaire pour contribuer à la formation du gradient de protons [35][33]. Ce complexe consiste en 13 sous-unités, dont le cytochrome C oxidase subunit 4 (COX4) [40].
L’ATP synthase
L’ATP synthase est un complexe protéique et une enzyme qui fabrique l’ATP à partir de l’adénosine diphosphate (ADP) et de phosphate inorganique (Pi). Pour ce
faire, il utilise l’énergie du gradient de protons formée par le déplacement des électrons dans la chaine de transport des électrons. En passant dans l’ATP synthase, les protons l’actionnent en induisant un changement de sa conformation, ce qui active les sites catalytiques qui se situent dans la matrice mitochondriale. L’ADP peut alors se lier au phosphate inorganique pour former l’ATP [35].
ADN mitochondrial
La mitochondrie est la seule organelle à posséder son propre ADN. L’ADN mitochondrial provient de la mère. Il est circulaire, à double-brins et a une longueur de 16 569 paires de bases. Il contient 37 gènes, dont 13 gènes codants pour des protéines nécessaires à la phosphorylation oxydative, 2 pour des ARN ribosomaux (ARNr) et 22 pour des ARN de transfert (ARNt) [41]. L’ADNmt se situe dans la matrice mitochondriale. Une mitochondrie en contient de 2 à 10 copies. Comme pour
le nombre de mitochondries, le nombre de copies de l’ADNmt varie selon le type cellulaire.
L’ADNmt est fragile et plus susceptible aux mutations et aux délétions que l’ADNg. Le taux de mutation de l’ADNmt est de 10 à 20 fois plus élevé que celui de l’ADNg [42]. Une mutation dans l’ADNmt peut entrainer un mal fonctionnement de l’organelle [41] et ainsi ne pas remplir son rôle qui est de fournir l’ATP nécessaire à la contraction musculaire.
Premièrement, l’ADNmt n’a pas de système de révision pour détecter les erreurs de réplication. De plus, son taux de réplication est élevé, ce qui augmente les risques de mutations et de délétions. Finalement, il n’a pas de système de réparation de l’ADN, ce qui fait que lorsqu’il y a des bris dans l’ADNmt, ce dernier ne peut pas être réparé [42].
Une autre raison qui explique pourquoi l’ADNmt est plus à risque de contenir des mutations est sa proximité avec les ROS [42]. Ces derniers sont majoritairement produits par la chaine de transport des électrons. Les chaines de transport des électrons se situent dans la membrane interne de la mitochondrie qui, elle, est adjacente à la matrice mitochondriale où se trouve l’ADNmt. La probabilité que l’ADNmt soit en contact avec les ROS est donc élevée.
L’ADNmt ne contient pas d’introns. Pour cette raison, la présence de mutations affecte automatiquement les régions qui codent pour les complexes de la chaine de transport des électrons ou la machinerie traductionnelle.
La mitochondrie : une organelle dynamique
La mitochondrie est une organelle qui est dynamique. Elle est dans un cycle constant de fusion et de fission. La régulation de ce processus est cruciale pour la santé de la cellule. Un débalancement dans la fusion/fission a été démontré dans plusieurs maladies, telles que l’hypertension artérielle pulmonaire, le Parkinson, la maladie d’Huntington et l’Alzheimer, pour n’en nommer que quelques-unes [43].
Cette dynamique est orchestrée par des protéines situées au niveau des membranes externes et internes des mitochondries.
Lors de l’étape de la fusion, les membranes externes et internes de deux mitochondries distinctes se fusionnent, ce qui fait que les deux mitochondries ne deviennent qu’une. La mitochondrie résultante est alors plus grosse. Cela permet le partage du contenu de la matrice mitochondriale d’une mitochondrie à l’autre. Les mutations, délétions et protéines oxydées qui se sont accumulées dans une mitochondrie sont alors diluées. Les protéines responsables de la fusion sont mitofusin (MFN) 1 et 2, pour la fusion des membranes externes, et mitochondrial dynamin like GTPase (OPA1), pour la fusion des membranes internes [43] [44].
Lors de la phase de fission, les deux mitochondries vont se séparer. Cela va créer des mitochondries plus petites. Chacune part avec la moitié du bagage génétique qui est un mélange du matériel génétique des deux mitochondries qui ont fusionné en premier lieu. Des mitochondries plus petites facilitent la production de ROS, la mitophagie et accélèrent la prolifération cellulaire. La division des mitochondries est régulée par la protéine DRP1 [43] [44].
La fragmentation mitochondriale cause une déstabilisation de la membrane mitochondriale, facilite la mort cellulaire et augmente le stress oxydatif, ce qui contribue au développement et à la progression de différentes maladies reliées aux mitochondries. Un débalancement dans la dynamique fusion/fission de la mitochondrie a donc un impact sur la production de ROS par la mitochondrie. Une augmentation de la fusion est associée à une diminution de la production de ROS, le contraire se produit lorsqu’il y a une augmentation de la fission. Le débalancement vers la fission est aussi une cause de diminution du potentiel membranaire mitochondrial, une diminution de la production d’ATP et une augmentation du relâchement de protéines pro-apoptotiques [45].
Densité musculaire et fonction musculaire
La densité musculaire mesurée par tomodensitométrie est un indice de la qualité du muscle, un muscle de faible densité étant considéré comme de moins bonne qualité. Pour certains, la diminution de la densité musculaire à la tomodensitométrie est le reflet d’une accumulation intramusculaire de tissus non musculaires comme des lipides [46] mais il faut se rappeler que la tomodensitométrie ne permet pas de déterminer la nature exacte de cette perte de densité musculaire. Peu importe la nature du tissu qui infiltre le muscle et en réduit la densité, ce phénomène pourrait avoir des conséquences fonctionnelles, étant associées à une diminution de la force et l’endurance musculaire [47].
Différentes fonctions du muscle seront mentionnées tout au long de ce mémoire. La force musculaire est la capacité du muscle à générer une force alors que l’endurance représente la capacité du muscle à soutenir ou répéter un travail donné dans le temps. Quant à elle, la fatigue musculaire se définit comme étant une réduction réversible de la force générée par le muscle pendant une tâche spécifique.
LA DYSFONCTION MUSCULAIRE ASSOCIÉE À LA MPOC
Une des conséquences importantes de la MPOC est la dysfonction musculaire des muscles locomoteurs, plus particulièrement des quadriceps. En raison de la présence d’essoufflement, il peut être inconfortable pour les individus atteints de la MPOC de faire de l’activité physique. Plusieurs d’entre eux adoptent un mode de vie sédentaire à cause de la maladie. Évidemment, un tel manque d’activité physique peut affecter, à long terme, la fonction musculaire, mais la diminution de la fonction musculaire observée chez les sujets atteints de la MPOC n’est pas uniquement causée par la sédentarité. Par exemple, Gifford et al. ont comparé le phénotype mitochondrial du muscle squelettique de sujets atteints de la MPOC et de sujets contrôles ayant au niveau d’activité physique semblable aux
MPOC. Leur étude a démontré que le phénotype mitochondrial qu’ils ont observé est attribuable à la maladie et non à la sédentarité [48].
Il y a d’autres mécanismes responsables de cette dysfonction observée chez les patients atteints de la MPOC [49], tels que l’hypoxie chronique qui, elle, peut augmenter le stress oxydatif dans les muscles. Les patients atteints de la MPOC ont également une augmentation des protéines Atrogin-1 et MURF1, qui sont impliquées dans la dégradation des protéines et l’atrophie musculaire [50].
La dysfonction musculaire dont souffrent les patients atteints de la MPOC a été décrite par l’American Thoracic Society comme ayant cinq composantes distinctes (Figure 3) : i) la faiblesse musculaire, ii) l’atrophie musculaire, iii) le changement de distribution des fibres de type I en fibres de type II, iv) la diminution de la capacité oxydative et v) la dysfonction mitochondriale [49].
Figure 3. Composantes impliquées dans la dysfonction musculaire chez les patients atteints de la MPOC selon l’American Thoracic Society [49].
La force et l’endurance du quadriceps
La fonction des muscles locomoteurs des patients atteints de la MPOC est altérée ce qui a comme conséquence de réduire leur qualité de vie [51]. Ceci se manifeste également par une diminution de la force musculaire comparée aux sujets témoins [52]. En effet, la contraction maximale volontaire du quadriceps d’individus atteints de la MPOC est diminuée de 20 à 30% [49]. L’endurance musculaire est également réduite dans cette situation [53][54] et affecte autant les hommes que les femmes [55][56]. Une augmentation de la fatigabilité musculaire des muscles périphériques [57] est également observée chez 48 à 58% des patients [58][59].
L’atrophie musculaire
Le maintien de la masse musculaire est un fragile équilibre entre la synthèse et la dégradation des protéines. Lorsqu’il y a davantage de dégradation que de synthèse de protéines, c’est là qu’on retrouve de l’atrophie musculaire. Le muscle est dégradé plus rapidement qu’il est réparé, causant une diminution de la masse musculaire.
Ceci se manifeste par une réduction de la surface musculaire de la cuisse [52] et aussi par une réduction de la surface des fibres musculaires. Lors du processus d’atrophie, certains auteurs ont rapporté que ce sont tous les types fibres qui sont affectés [60]. D’autres affirment que les fibres de type IIx sont plus affectées par l’atrophie que les autres types [61].
La distribution des fibres musculaires
Chez les patients atteints de la MPOC, la proportion de fibres de type II du quadriceps augmente, alors que la proportion de fibres de type I diminue [60][62]. Certaines études ont démontré que l’augmentation des fibres de type II est en lien
avec une augmentation de la proportion de fibres de type IIx [53]. Les patients atteints de la MPOC ont donc des muscles qui utilisent, comme source principale d’énergie, le glycogène.
La capacité oxydative
À partir d’homogénat de muscle, il a été démontré que les patients atteints de la MPOC ont moins d’enzymes impliquées dans les réactions d’oxydation que les sujets témoins [53][63]. Cela sous-entend donc une diminution de la capacité des muscles à produire de l’énergie à partir de l’oxygène.
La fonction mitochondriale
La densité mitochondriale, déterminée par microscopie électronique, est diminuée dans le muscle vaste latéral des patients atteints de la MPOC comparativement à celui des sujets témoins [64]. Cette diminution est aussi observée dans d’autres pathologies qui présentent une intolérance à l’effort, telle que l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) [65]. Il y a une augmentation de l’expression des gènes SQSTM1, BNIP3 et PARKIN qui sont reliés à l’autophagie ciblant spécifiquement les mitochondries (mitophagie). De plus, la réplication mitochondriale n’est peut-être pas en mesure de suivre le rythme de la mitophagie, ce qui créerait un épuisement du contenu mitochondrial [66]. Il y a également une diminution du niveau protéique du facteur de transcription Mitochondrial
Transcription Factor A (TFAM) et de la quantité d’ARNm du coactivateur de la
transcription Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (PGC-1α) [67], un régulateur de la biogenèse des mitochondries.
Konokhova et al. ont mesuré une augmentation de la prévalence de mutations dans l’ADN mitochondrial (ADNmt) des patients atteints de la MPOC associée à une diminution du nombre de copies d’ADNmt [68].
Il y a une plus grande production de dérivés réactifs de l’oxygène (en anglais
reactive oxygen species, ROS) dans le muscle vastus lateralis des patients atteints
de la MPOC. Puente-Maestu et al. ont mesuré une production de ROS trois fois plus élevée dans les mitochondries isolées de muscles de patients atteints de la MPOC que dans les mitochondries isolées de muscles de sujets témoins [69]. Les ROS induisent la dysfonction mitochondriale, mais la dysfonction mitochondriale est également à l’origine de la production de ROS; il y a donc mise en place d’une boucle de rétroaction qui alimente la progression de la dysfonction.
La dysfonction mitochondriale peut contribuer au développement de chacune des composantes de la dysfonction musculaire qui ont été décrites ci-dessus. Le tabagisme peut aussi y contribuer. Les conséquences du tabagisme sur le muscle squelettique seront abordées un peu plus loin.
MÉCANISMES DE L’ATTEINTE MUSCULAIRE
Différents facteurs ont été explorés dans le but d’expliquer l’initiation et la progression de la dysfonction musculaire observée chez les sujets atteints de la MPOC. Parmi ceux-ci, nous retrouvons la sédentarité, la présence d’inflammation, l’hypoxémie chronique et le tabagisme.
Le tabagisme
Le tabagisme en lui-même a plusieurs conséquences sur le muscle squelettique. Les fumeurs ont une plus faible résistance à la fatigue musculaire que les non-fumeurs [70][71]. Certains auteurs ont aussi rapporté une diminution de la force musculaire chez les fumeurs lorsqu’ils sont comparés à des non-fumeurs [72][73], alors que d’autres n’ont pas détecté de différence [71].
Les fumeurs ont une perte de masse musculaire qui pourrait être expliquée par un débalancement entre la synthèse et la dégradation des protéines. Après une
exposition de 8 semaines à la fumée de cigarette, les niveaux d’ARNm de F-box
protein 32 (MAFBx) et muscle RING-finger protien-1 (MURF1) sont augmentés chez
la souris [74]. Ces deux gènes contribuent à la protéolyse. Chez les sujets fumeurs, il y a une augmentation de la myostatin qui inhibe la croissance musculaire et une augmentation de MAFbx qui favorise la dégradation des protéines musculaires [75].
Ölander et al ont démontré que les sujets fumeurs ont une augmentation de la proportion de fibres de type IIx et une diminution de la proportion des fibres de type I comparativement aux sujets non-fumeurs [72], alors que certaines études n’ont pas remarqué de différences dans la distribution de types de fibres musculaires [76]. L’aire des fibres de type I est plus petite chez les fumeurs que chez les non-fumeurs [76]. Wüst et al ont démontré une diminution de 25% de la surface des fibres musculaires chez les fumeurs [71].
Une diminution de la capacité oxydative [72][76] et une augmentation de l’activité glycolytique ont été remarquées dans les muscles des sujets fumeurs. Il y a une augmentation de l’enzyme lactate déshydrogénase, une augmentation de la proportion de fibres qui ont une grande capacité glycolytique et une diminution de celles qui ont une grande capacité oxydative chez les sujets fumeurs comparés aux sujets non-fumeurs [76].
Degens et al. ont démontré qu’il y a une diminution de l’activité du complexe IV de la chaine de transport des électrons et donc une diminution de la quantité d’ATP produit par les mitochondries lors de la respiration oxydative chez les sujets fumeurs comparés aux non-fumeurs [77].
Van den Borst et al. ont démontré que les sujets fumeurs sans MPOC ont une composition corporelle semblable aux sujets qui ont une MPOC. Ces deux groupes ont une diminution du poids corporel, de la masse maigre, de la masse grasse, de l’indice de masse corporelle (IMC) et de la force du quadriceps comparativement aux sujets qui n’ont jamais fumé [78].
Chapitre 1
Problématique, objectifs et hypothèses de
recherche
Les patients atteints de la MPOC ont plusieurs problèmes musculaires comme nous venons de le voir. Par contre, les mécanismes impliqués dans la survenue de ces problèmes ne sont pas complètement élucidés. Parmi ceux-ci, nous croyons que le tabagisme joue un rôle important dans le développement de la dysfonction musculaire, notamment pour ce qui est de la mitochondrie dont le fonctionnement semble altéré dans la MPOC et qui pourrait être sensible aux effets néfastes du tabac.
Ce mémoire a trois objectifs distincts. Le premier est de déterminer les atteintes mitochondriales des patients atteints de la MPOC. La mitochondrie, étant la centrale énergétique des cellules, est un élément important pour la production de force dans les muscles locomoteurs et l’endurance à l’exercice. Des atteintes mitochondriales chez les patients atteints de la MPOC pourraient expliquer la diminution de force et d’endurance observée chez ces sujets. Le deuxième est de déterminer les niveaux de dommages à l’ADNmt et à l’ADNg présents chez les sujets atteints de la MPOC. Le troisième est d’évaluer si le tabagisme indépendamment de la maladie, est associé à l’atteinte du muscle squelettique et de la mitochondrie.
Objectif général 1 :
Comparer le nombre et la fonction des mitochondries dans le muscle vastus lateralis chez les patients atteints de la MPOC et les sujets témoins ayant une fonction pulmonaire normale.
Hypothèse générale 1 :
Le nombre et la fonction des mitochondries au niveau du muscle squelettique sont altérés chez des patients atteints de la MPOC par rapport à des sujets témoins.
Objectif spécifique 1.1 : Mesurer les niveaux protéiques de SDHB et COX4,
ainsi que la proportion de fibres dont le complexe IV ne fonctionne pas.
Hypothèse spécifique 1.1 : Dans le muscle vastus lateralis des patients
atteints de la MPOC comparativement aux sujets témoins ayant une fonction pulmonaire normale, une diminution des sous-unités SDHB et COX4 des complexes II et IV respectivement de la chaine de transport des électrons est attendue. De même, une augmentation de la proportion de fibres dont le complexe IV de la chaine de transport des électrons ne fonctionne pas sera mesurée.
Objectif spécifique 1.2 : Mesurer la quantité de mitochondries présentes
dans le tissu en évaluant le nombre de copies de l’ADNmt. Hypothèse
spécifique 1.2 : Une diminution du nombre de copies d’ADNmt sera
observée dans le muscle vastus lateralis des patients atteints de la MPOC comparativement aux sujets témoins ayant une fonction pulmonaire normale.
Objectif spécifique 1.3 : Mesurer les niveaux protéiques de TFAM, Mn-SOD
MFN1 et MFN2. Hypothèse spécifique 1.3 : Dans le muscle vastus lateralis des patients atteints de la MPOC, comparativement aux sujets témoins ayant une fonction pulmonaire normale, une diminution de TFAM, MFN1 et MFN2 et une augmentation de Mn-SOD seront observées.
Objectif général 2 :
Comparer les dommages à l’ADNmt et à l’ADNg présents dans le muscle vastus
lateralis chez les patients atteints de la MPOC par rapport à des sujets témoins ayant
une fonction pulmonaire normale.
Hypothèse générale 2 :
Le muscle vastus lateralis des patients atteints de la MPOC ont plus de dommages à l’ADNmt et à l’ADNg que les sujets témoins ayant une fonction pulmonaire normale.
Objectif spécifique 2.1 : Mesurer la quantité de 8-OHdG dans l’ADNg du
muscle vastus lateralis. Hypothèse spécifique 2.1 : Une augmentation de la quantité de 8-OHdG présent dans l’ADNg sera observée dans le muscle
vastus lateralis des patients atteints de la MPOC comparativement aux sujets
témoins ayant une fonction pulmonaire normale.
Objectif spécifique 2.2 : Quantifier la délétion de 4977 pb dans l’ADNmt. Hypothèse spécifique 2.2 : L’ADNmt du vastus lateralis des patients atteints
de la MPOC a davantage de délétion de 4977 pb que les sujets témoins ayant une fonction pulmonaire normale.
Objectif général 3 :
Déterminer les effets du tabagisme sur les mitochondries du muscle vastus lateralis et la qualité du muscle chez tous les sujets indépendamment de leur état de santé.
Hypothèse générale 3 :
Les sujets qui ont une exposition tabagique plus importante (nombre de paquets-années plus élevé) ont moins de mitochondries, celles-ci fonctionnent moins bien et leurs muscles sont de moins bonne qualité.
Objectif spécifique 3.1 : Déterminer les effets du tabagisme sur l’état
fonctionnel du complexe IV de la chaine de transport des électrons dans la mitochondrie chez tous les sujets, indépendamment de la maladie.
Hypothèse spécifique 3.1 : Il y aura une corrélation positive chez tous les
sujets entre le nombre de paquets-années et la proportion des fibres dont le complexe IV ne fonctionne pas (COX-deficient).
Objectif spécifique 3.2 : Déterminer les effets du tabagisme sur la densité
musculaire chez tous les sujets, indépendamment de la maladie. Hypothèse
spécifique 3.2 : Il y aura une corrélation négative entre le nombre de
paquets-années et la densité musculaire moyenne et la densité du muscle normal.
Chapitre 2
Matériel et méthodes
L’ensemble des expériences ont été réalisées et analysées à l’aveugle en suivant les recommandations décrites par Provencher et al [79].
2.1 RECRUTEMENT DES SUJETS
Des patients atteints de la MPOC modérée à sévère selon la classification GOLD ainsi que des sujets témoins ont été recrutés à partir d’une base de données de recherche qui contient des informations génériques sur des participants à la recherche qui ont été en contact avec l’équipe de recherche de mon directeur de recherche. Tous étaient des ex-fumeurs. Un questionnaire d’activité physique spécifique aux personnes âgées utilisé dans la population de MPOC a été rempli (Voorrips) [80]. Tous les sujets étaient sédentaires et devaient être âgés entre 50 et 80 ans.
Les sujets ont été exclus de l’étude en présence de l’une ou plusieurs de ces conditions :
- Toutes maladies chroniques (cancer, insuffisance cardiaque, insuffisance rénale, SIDA),
- Diabète diagnostiqué,
- Maladies hormonales (ex. glande thyroïde) non contrôlées, - Atteintes vasculaires des membres inférieurs,
- Pathologie neuromusculaire,
- Prise de corticostéroïdes oraux (< 2 mois), - Histoire de toxicomanie (alcool, drogues), - Tabagisme actif.
Tous les sujets ont signé le formulaire de consentement approuvé par le Comité d’éthique de la recherche de l’Institut universitaire de cardiologie et de pneumologie de Québec (IUCPQ) (#20458)
Figure 4. Représentation schématique des manipulations effectuées lors de cette étude
2.2 TESTS DE FONCTIONS PULMONAIRES ET MESURES ANTHROPOMÉTRIQUES
Une spirométrie a été réalisée selon les méthodes standardisées et usuelles [81]. Ce test, utilisé de façon courante en pneumologie, permet de mesurer les débits expiratoires. Le VEMS est exprimé en pourcentage de la valeur prédite, elle-même calculée selon le sexe, l’âge et la taille du sujet [82][83]. Le poids et la taille ont été
Sujets - Témoins - MPOC Fonctions pulmonaires Mesures anthropométriques Biopsie Tomodensitométrie de la cuisse Spirométrie - Taille - Poids
Extraction protéines Extraction ARN Extraction ADN Histochimie
Western Blot - SDHB - COX4 - TFAM - MFN1 - MFN2 - Mn-SOD RT-qPCR - TFAM Fibres COX-deficient qPCR - ADNg18s - ADNmtWT - ADNmt(dc4977pb) ELISA -8-OHdG
mesurés à l’aide d’une balance à bioimpédance (In Body 520, Biospace Co.) [84] afin de calculer l’indice de masse corporelle (IMC) de chaque participant. L’IMC est calculé à l’aide de l’équation suivante : 𝑝𝑜𝑖𝑑𝑠 (𝑒𝑛 𝑘𝑔)
𝑡𝑎𝑖𝑙𝑙𝑒2 (𝑒𝑛 𝑚2).
2.3 BIOPSIES
Une biopsie musculaire du vastus lateralis a été effectué après un repos de 30 minutes tel que décrit par Bergström [85][86]. Cette technique est réalisée de manière routinière dans notre laboratoire. Une partie du tissu musculaire a été immédiatement congelée dans l’azote liquide pour être par la suite conservée à -80°C pour des analyses postérieures.
2.4 TOMODENSITOMÉTRIE DE LA CUISSE
Une image transversale de la cuisse a été prise pour chaque sujet. La mesure a été faite au niveau de la partie médiane de la cuisse, c’est-à-dire à la mi-cuisse entre la tête et la base du fémur à l’aide de l’appareil TCT-900S de Toshiba tel que décrit précédemment [87]. Toutes les images analysées avec le logiciel SliceOMatic 4.3 Rev-6f (Tomovision) ont été réalisées par la même personne. Les tissus ont été caractérisés en fonction de leur densité en HU (Housefield Units). Ceux ayant une densité entre -190 et -30 HU ont été considérés comme étant du tissu adipeux, alors que ceux ayant une densité entre -29 et 100 HU comme étant du tissu musculaire. La valeur de densité moyenne du muscle total (-29 à 100 HU) a été calculé, ainsi que celle du muscle caractérisé comme normal (35 à 100 HU) [88]. Les limites d’atténuation présentées à la figure 5 ont été utilisées pour distinguer les différents tissus présents dans la cuisse.
Figure 5. Limites d’atténuation prédéterminées pour l’analyse des images de tomodensitométrie
2.5 IMMUNOBUVARDAGE
2.5.1 Extraction des protéines
Les protéines ont été extraites à partir de 30 mg de tissu musculaire congelé et lavé dans une solution de tampon phosphate salin (phosphate buffer saline (PBS) en anglais). L’extraction est faite dans un tampon d’extraction RIPA [25 mM de Tris pH 7,6, 150 mM de NaCl, 1% NP40, 1% de sodium déoxycholate, 0,1% de SDS] auquel un cocktail d’inhibiteurs de protéases et de phosphatases a été ajouté (Fisher Scientific,). Les tissus ont été homogénéisés à l’aide d’un Polytron PT 1200 c (Kinematica). La concentration en protéine dans chaque échantillon a été déterminée à l’aide d’un essai commercial (DC Protein Assay; Bio-Rad).
2.5.2 Électrophorèse
L’électrophorèse a été réalisée en conditions dénaturantes sur des gels de polyacrylamide 10 ou 12%. La concentration en polyacrylamide dans le gel diffère selon la cible, dans le but d’avoir une meilleure séparation des protéines. Suite à la migration, les protéines ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose. Le transfert a été fait au froid pendant 1h30 à 100 V. La membrane a ensuite été bloquée dans une solution saline (TBS) qui contient 5% de sérum bovin (BSA) pendant 1 heure à la température de la pièce avec une agitation constante. Par la suite, la membrane a été incubée dans une solution de TBS-Tween 0,2%-BSA 5% contenant l’anticorps primaire. Les anticorps suivants ont été utilisés : SDHB (Abcam), COX4 (Novus Biological), TFAM (Millipore), MFN1 (Cell Signaling), MFN2 (Abcam) et Mn-SOD (Millipore) pendant environ 16h à 4°C. La membrane a ensuite été lavée avec du TBS – Tween20 (0,1%) et incubée avec l’anticorps secondaire correspondant, selon l’espèce de l‘hôte de l’anticorps primaire, dans une solution de TBS – Tween20 (0,2%) – lait (5%). L’incubation s’est effectuée à la température de la pièce, à l’obscurité, pendant 1 heure, avec une agitation constante.
Après avoir été lavée de nouveau avec du TBS – Tween20 (0,1%), la membrane a été exposée dans deux appareils différents selon l’anticorps secondaire utilisé. Si l’anticorps utilisé devait être excité à une longueur d’onde de 800 nm, la membrane a été exposée dans l’appareil d’imagerie Odyssey® (LI-COR, Mandel). L’intensité des bandes a été obtenue à l’aide du logiciel Image Studio Lite. Si la méthode de détection utilisée était la chimiluminescence, l’appareil ChemiDoc™ MP Imaging System (Bio-Rad) permettait de visualiser les protéines et l’analyse était faite avec le logiciel Image Lab™ (Bio-Rad), version 5,0.
Pour déterminer la quantité de protéines totales de chaque échantillon, la membrane a été colorée avec une solution d’amido black [0,1% Amido Black, 40% Méthanol, 10% acide acétique]. Une image de la membrane a été prise avec l’appareil ChemicDoc ™ MP Imaging System (Bio-Rad) et a été analysée avec le logiciel Image Lab™ (Bio-Rad), version 5,0. La quantité relative de l’expression
protéique était déterminée par le ratio de l’intensité de la bande de la protéine d’intérêt sur l’intensité des bandes des protéines totales.
2.6 EXTRACTION DE L’ARN
L’ARN total a été extrait à partir d’environ 15 mg de tissu musculaire congelé dans le réactif TRIzol (Thermo Fisher Scientific). Les tissus ont été homogénéisés à l’aide d’un Polytron PT 1200 c.
La pureté de l’ARN de tous les échantillons a été déterminée par spectrophotométrie à l’aide de l’appareil Synergy H1 (BioTek). L’absorbance aux longueurs d’onde 230 (molécules organiques, tampon), 260 (ARN) et 280 (protéines) nm a été mesuré. Le ratio 260/280 permet de déterminer s’il y a présence de contaminants de nature protéiques et le ratio 230/260 permet de déterminer s’il y a des contaminants de nature organique. Les deux ratios doivent être entre 1,8 et 2,0 pour que l’ARN soit considéré pure.
Ensuite, l’intégrité de l’ARN de chaque échantillon a été vérifiée par électrophorèse sur un gel dénaturant d’agarose et formaldéhyde. Le colorant SYBR Safe – DNA Gel Stain (Thermo Fisher Scientific) a été ajouté au gel pour permettre la visualisation de l’ARN par luminescence. Si l’ARN est intact, deux bandes distinctes peuvent être observées, représentant les sous-unités 18s et 28s du ribosome.
2.6.1 Rétrotranscription (RT)
L’ADNc a été synthétisée à l’aide de la trousse iScript Advanced cDNA
Synthesis kit for RT-qPCR (Bio-Rad). 1 µg d’ARN a été utilisé pour la réaction de
rétrotranscription (RT) qui s’est déroulée à 42°C sur une période de 30 minutes suivie d’une étape à 85°C pendant 5 minutes pour désactiver l’enzyme rétrotranscriptase.
2.6.2 Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)
Le thermocycleur Rotor Gene 6000 (Corbett, Life Science) a été utilisé pour réaliser les réactions de qPCR. Le niveau d’expression de l’ARNm de TFAM (F : 5’-GAAGTTCCCTCCAACGCT-3’, R : 5’-GCAAGTTGTCCAAAGAAACCT)-3’) de chaque échantillon a été obtenu à l’aide de la solution SsoAdvanced Universal
SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Les conditions de la réaction de qPCR ont été
optimisées pour cette paire d’amorces. Premièrement, un gradient de température a permis de déterminer la température optimale pour les étapes d’appariement et extension. Une courbe standard a été réalisée pour déterminer l’efficacité de la réaction, qui doit être entre 90 et 110%, et l’étendue de validation. Les conditions suivantes ont été utilisées pour la réaction de qPCR : 1) activation de l’enzyme à 95°C pendant 30 secondes, 2) 40 cycles de 15 secondes à 95°C (étape de dénaturation) et 30 secondes à 55°C (étapes d’appariement et d’élongation). Finalement, une courbe de dissociation a été effectuée pour déterminer que les amorces étaient spécifiques et donc qu’il n’y aurait qu’une seule température de dissociation représentant un seul produit amplifié.
Le niveau d’expression relative de chaque ARNm a été normalisé par rapport à l’expression de 2 gènes de références, soit RPLP0 (R : 5’-TGTCTGCTCCCACAATGAAAC-3’, R : 5’-TCGTCTTTAAACCCTGCGTG-3’) et GNB2L1 (F : 5’-TGGTCTTCAGCTTGCAGTTAG, R : 5’-GCAAATACACTGTCCAGGATGA-3’). La stabilité des gènes de références a été déterminée à l’aide de l’algorithme geNorm [89]. Les gènes de référence sélectionnés avaient une valeur M plus petite que 0,5, ce qui indique qu’ils sont stables dans toutes les conditions, soit en présence ou non de la maladie. Par la suite, la moyenne géométrique de ces deux gènes de référence a été calculée pour chaque échantillon. La valeur obtenue, le facteur de normalisation, a été utilisée pour déterminer l’expression du gène d’intérêt, soit TFAM.
2.7 EXTRACTION DE L’ADN
L’ADN total a été extrait à partir des biopsies musculaires à l’aide d’une trousse commerciale (DNeasy Blood and Tissue kit; Qiagen). 25 mg de tissu ont été utilisés. La concentration d’ADN de chaque échantillon a été déterminée par spectrophotométrie avec le lecteur de plaques Synergy H1 de Bio-tek.
2.7.1 qPCR
La présence de la délétion commune et la quantité d’ADN mitochondrial ont été mesurées quantitativement par qPCR. Les trois paires d’amorces utilisées sont présentées dans le tableau 3. La première cible est une partie de la région 18S de l’ADN génomique (ADNg18S), la deuxième, une partie de l’ADN mitochondrial qui
n’est pas touchée par la délétion commune (ADNmtWT) et la troisième détecte la
présence de la délétion commune (ADNmt(dc4977pb)). Pour cette dernière, lorsque la
délétion est présente, le fragment amplifié est de 135 pb. Lorsque la délétion n’est pas présente, c’est-à-dire lorsque l’ADN mitochondrial est intact, le fragment est de 5112 pb. Les conditions utilisées ne sont pas suffisantes pour amplifier un ADN aussi long, tel qu’indiqué dans la fiche technique du SsoAdvanced Universal SYBR Green
Supermix de Bio-Rad. Alors si la délétion commune n’est pas présente, il n’y a pas
d’amplification.
Les réactions de qPCR ont été réalisées dans un Rotor-Gene™ 6000 (Corbett Life Science). Le niveau d’expression de chaque cible a été obtenu à l’aide de la solution SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Les conditions de la réaction de qPCR ont été optimisées pour chaque paire d’amorces telle que décrite dans la section 2,6. Finalement, les produits des réactions de qPCR ont été déposés sur un gel d’agarose 1% pour s’assurer que la taille des fragments amplifiés correspondait à la taille attendue. Les conditions suivantes ont été utilisées pour toutes les réactions de qPCR : 3 minutes à 98°C, puis 40 cycles de 15 secondes à 98°C et 30 secondes à 60°C. Selon les recommandations du fabricant, une température de 98°C a été utilisée pour les étapes de dénaturation de l’ADN, à la place de 95°C tel qu’utilisé avec de l’ADNc lors des réactions de RT-qPCR.
