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Identification d'effecteurs du pouvoir pathogène et de voies métaboliques chez l'oomycète Aphanomyces euteiches par une approche génomique

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Délivré par l’Université Toulouse III – Paul Sabatier Discipline ou spécialité : Biosciences Végétales

Présentée et soutenue par Mohammed-Amine Madoui Le 12 mai 2009

Identification d'effecteurs du pouvoir pathogène et de voies métaboliques

chez l'oomycète Aphanomyces euteiches par une approche génomique

JURY

Harald Keller (Rapporteur) – Directeur de Recherhce à l’UMR IPMSV, INRA/CNRS/UNSA, Sophia Antipolis Marc-Henri Lebrun (Rapporteur) – Directeur de Recheche à l’UMR 5240, CNRS/UCB/INSA/BCS, Lyon +XEHUW6FKDOOHU ([DPLQDWHXU &KDUJpGH5HFKHUFKHjO835&1568QLYHUVLWpGH6WUDVERXUJ Mathieu Arlat (Président du jury) – Professeur au LIPM, INRA/CNRS, Castanet-Tolosan

Bernard Dumas (Directeur de thèse) – Chargé de Recherche à l’UMR 5546, CNRS/UQLYHUVLWp3DXO6DEDWLHU7RXORXVH,,, Elodie Gaulin (Directrice de thèse) – Maître de Conférences à l’UMR 5546, CNRS/UQLYHUVLWp3DXO6DEDWLHU7RXORXVH,,, Ecole doctorale : SEVAB, Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries

Unité de recherche : UMR 5546 CNRS - UPS, Surface Cellulaires et Signalisation chez les Végétaux

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Je remercie en premier lieu mes encadrants, Bernard Dumas et Elodie Gaulin pour m’avoir fait confiance pendant et à la suite de mon stage de master et pour m’avoir permis de réaliser mes travaux de thèse dans de très bonnes conditions. Je les remercie également pour leur encadrement de qualité qui m’a permis de me former à la démarche de la recherche scientifique ainsi qu’aux techniques de la biologie moléculaire. Merci à vous deux pour votre patience et votre dévouement.

Je remercie ensuite mes deux aides précieuses, Catherine Mathé et Hélène San Clémente qui m’ont donné goût à la programmation. Elles m’ont largement aidé à me former et à mettre en pratique les notions de bioinformatique acquises de jours en jours. Un grand merci à vous deux pour vos enseignements.

Un énorme merci à Justine Bertrand-Michel de la plate-forme de lipidomique de l’INSERM de Purpan. Merci pour l’investissement considérable qu’elle a apporté dans les travaux de

biochimie des stérols d’Aphanomyces. Merci également à Hubert Schaller pour ses conseils

avisés lors de mon comité de thèse et pour le suivi de mes travaux.

Je tiens également à remercier spécialement Arnaud Bottin pour tous les repas passés

ensemble à discuter d’Aphanomyces et à confronter nos hypothèses sur ce parasite. Je

souhaite aussi remercier Christophe Jacquet, Marie-Thérèse Esquerré-Tugayé, Francis Carbonne et Claude Lafitte pour leur participation à mes travaux durant les diverses réunions d’équipe.

Et puis que seraient ces trois années passées sans la présence des autres doctorants ? Merci à Valérie Jaulneau pour l’ambiance qu’elle a mis dans le laboratoire. Et merci aux autres doctorants : aux anciens comme Marc, Ilham, Joanne et Nasser ainsi qu’au nouveau, merci Mathieu pour ta bonne humeur.

Un grand merci aux services communs de l’UMR 5546, à Jean-Luc, Catherine, Nicole et Michèle.

Et enfin merci à toutes les personnes qui ne sont pas du laboratoire mais qui m’ont aidé ou ont participé à un moment donné à mes travaux, alors merci à Martina Rickauer du laboratoire SP2 de l’INP/ENSAT, à David Allouche et à Didier Laborie de la plateforme bioinformatique de l’INRA de Toulouse, à Gérald Salin et à Julien Sarry de la plateforme génomique de Toulouse.

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Résumé ... 7

Abstract ... 9

Chapitre 1 : Introduction ... 11

1 Les oomycètes : classification et importance ... 13

1.1 Caractéristiques et classification des oomycètes... 13

1.2 Des microorganismes parasites de plantes et d'animaux... 15

2. Génomique des oomycètes... 17

2.1 Banques d’ESTs et génomes d’oomycètes... 17

2.2 Outils bioinformatiques dédiés à l’étude des oomycètes ... 21

2.3 Effecteurs du pouvoir pathogène... 23

3. Aphanomyces euteiches, un parasite des légumineuses ... 31

3.1 La pourriture racinaire précoce du pois... 31

3.2 Biologie d’A. euteiches ... 35

3.3 Variabilité du pouvoir pathogène ... 41

4 Objectifs de la thèse ... 43

Chapitre 2 : AphanoDB: une ressource génomique pour Aphanomyces ... 47

Introduction ... 49

Article 1 : AphanoDB : a genomic ressource for Aphanomyces pathogens...……...51

Conclusion... 59

Chapitre 3 : Identification d’effecteurs et de voies métaboliques chez Aphanomyces euteiches ... 61

Introduction ... 63

Article 2 : Transcriptome of Aphanomyces euteiches : New Oomycete Putative Pathogenicity Factors and Metabolic Pathways………65

Conclusion... 77

Chapitre 4 : Synthèse de sterols chez A. euteiches... 79

Introduction aux stérols... 81

Structure chimique et nomenclature des stérols ... 81

Diversité des stérols chez les organismes vivants ... 83

Fonctions biologiques des stérols... 85

Voies de synthèse de stérols... 89

Article 3 : Sterol metabolism in the oomycete Aphanomyces euteiches, a legume root pathogen………....91

Conclusion... 107

Chapitre 5 : Discussion ...109

1. Génomique d’A. euteiches... ....111

2. Identification de gènes d’interêt chez A. euteiches ... .112

3. Synthèse des stérols par A. euteiches ... ....113

3.1 Une nouvelle voie de synthèse identifiée ... 113

3.2 Voie des stérols et molécules anti-oomycètes... 115

4. Conclusion... 116

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Résumé

Les oomycètes sont des microorganismes eucaryotes responsables de maladies dévastatrices

chez les plantes cultivées. La pourriture racinaire causée par l’oomycète Aphanomyces

euteiches est à l'origine de dommages importants sur les cultures de légumineuses. Afin

d’identifier les effecteurs du pouvoir pathogène et de mieux connaitre le métabolisme

d'A. euteiches, une analyse globale du transcriptome a été réalisée. L’analyse bioinformatique de 20 000 ADNc issus de la souche ATCC201684 a conduit à la mise en place d’une base de données accessible en ligne, AphanoDB, sur laquelle les ESTs assemblées et annotées ont été déposées. L’exploitation d’AphanoDB a permis l’identification de nouveaux effecteurs putatifs du pouvoir pathogène et de voies métaboliques originales comme celle des stérols. L'étude de ce métabolisme a été approfondie par une approche biochimique. Contrairement à

d'autre oomycètes comme Phytophthora, incapables de synthétiser des stérols, A. euteiches

possède tous les gènes nécessaires à leur synthèse. L’analyse biochimique des stérols d’A. euteiches a montré que le fucostérol correspond au stérol majoritaire. L’inhibition de la synthèse de stérols par des triazoles comme le tébuconazole et l’époxiconazole a conduit à une inhibition de la croissance mycélienne. L'ensemble de ces travaux, associant des approches génomique et biochimique, ont permis une meilleur compréhension de la biologie

et du pouvoir pathogène d'A. euteiches. Ils permettront à terme de définir de nouvelles pistes

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Abstract

Oomycetes are a group of eukaryotic microorganisms causing devastating diseases on crops.

Pea root rot disease caused by the oomycete Aphanomyces euteiches is the causal agent of

important damages on legumes. To identify effectors of pathogenicity and metabolic

pathways a transcriptomic approach was developped. In silico analysis of 20, 000 cDNAs

obtained from the ATCC201684 strain led to the development of a database, AphanoDB,

which is an online genomic ressource containing processed A. euteiches ESTs. Data mining

on AphanoDB allowed identifying new putatives effectors, and metabolic pathways, such as a

sterol biosynthesis pathway. While most of oomycetes such as Phytophthora are unable to

produce their own sterols, all the genes required for sterol synthesis were found in

A. euteiches. Biochemical analysis showed that fucosterol is the major A. euteiches sterol.

Inhibition of sterol synthesis with triazoles, such as tebuconazole and epoxiconazole, led to an

inhibition of mycelial growth. This study is the first overview of A. euteiches genomic,

transcriptomic and metabolism that paves the way to the identification of new molecular

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Figure 1 : Arbre phylogénique des eucaryotes inféré par maximum de vraissemblance et analyse bayesienne de 16 protéines codées par le noyau. Les Chromalvéolés constituent un groupe monophylétique composés des Chromistes

(Straménopiles, Haptophytes et Cryptophytes) et des Alvéolés (Ciliés, Dinoflagélés et Apicomplexes). Les oomycètes appartiennent au phylum des Straménopiles et sont ici représentés par Phytophthora sojae et Phytophthora ramurum dans un clade contenant également la diatomée Thalassiosira pseudonana. (Hacket et al, 2007). Les valeurs des bootstrap sont situées au dessus de chaque branche. Les branches épaisses ont une probabilitéa posteriori de 1. L’arbre est enraciné sur le super-groupe des Opistokontes.

Figure 1 : Arbre phylogénique des eucaryotes inféré par maximum de vraissemblance et analyse bayesienne de 16 protéines codées par le noyau. Les Chromalvéolés constituent un groupe monophylétique composés des Chromistes

(Straménopiles, Haptophytes et Cryptophytes) et des Alvéolés (Ciliés, Dinoflagélés et Apicomplexes). Les oomycètes appartiennent au phylum des Straménopiles et sont ici représentés par Phytophthora sojae et Phytophthora ramurum dans un clade contenant également la diatomée Thalassiosira pseudonana. (Hacket et al, 2007). Les valeurs des bootstrap sont situées au dessus de chaque branche. Les branches épaisses ont une probabilitéa posteriori de 1. L’arbre est enraciné sur le super-groupe des Opistokontes.

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1 Les oomycètes : classification et importance

1.1 Caractéristiques et classification des oomycètes

La classe des oomycètes regroupe plus de 600 espèces de micro-organismes filamenteux vivant en milieux marin ou terrestre (Dick et al. 1999). Ces microorganismes coenocytiques sont pour la plupart homothalliques. Certains oomycètes ont un mode de vie saprophyte et se nourrissent par conséquent de débris organiques (Margulis and Schwartz 1998). D’autres sont des parasites d’algues, d’animaux ou de plantes. Dans les anciennes classifications, plusieurs caractéristiques phénotypiques et biochimiques ont conduit au classement des oomycètes au sein du règne des champignons. Parmi ces caractéristiques communes, on trouve la structure filamenteuse, l’absence de pigment chlorophyllien et l’organotrophie. Cependant, la présence de cellulose dans les parois cellulaires, la diploïdie au cours de l'essentiel du cycle de développement, l’existence de zoospores biflagellées et les analyses phylogénétiques moléculaires montrent que les oomycètes n’appartiennent pas au règne des champignons. Les dernières études phylogéniques ont démontré que les oomycètes appartiennent au

super-groupe des chromalvéolés (Chromalveolata) (Hackett et al. 2007; Harper, Waanders, and

Keeling 2005; Martens, Vandepoele, and Van de Peer 2008). Les chromalvéolés sont

subdivisés en deux groupes, les Chromistes (Chromista) et les alvéolés (Alveolata). Le groupe

des Alvéolés comprend des organismes non phototrophes appartenant au phylum des Ciliés, des Apicomplexes ou des Dinoflagéllés. Le groupe des chromistes comprends trois phyla : les Cryptophytes, les Haptophytes et les Straménopiles (aussi appelés Hétérokontes) (Figure 1). La présence des plastes chez les Chromalvéolés aurait comme origine l’endosymbiose secondaire d’une algue rouge, il semblerait que la majorité des groupes photosynthétiques de Chromalvéolés ait une origine unique (Li et al. 2006; Martens, Vandepoele, and Van de Peer

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Tableau 1 : Classification des oomycètes parasites de plantes ou d'animaux les plus étudiés selon la classification taxonomique disponible sur le site NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy). La liste des organismes infectés par ces oomycètes n’est pas exhaustive mais représente les hôtes majoritairement associés à l’oomycète concerné.

Solanacées infestans Solanacées parasitica Chêne ramorum Soja sojae Phytophthora Vigne viticola Plasmopara Crucifères parasitica Hyaloperonospora Peronosporaceae Peronosporales Mammifères insidiosum Solanacées oligandrum Angiospermes ultimum Pythium Pythiaceae Pythiales Peronosporomycetidae Poissons, amphibiens ferax Poissons parasitica Saprolegnia Crustacées astaci Betteraves, épinards cochlioides Légumineuses, céréales euteiches Aphanomyces Saprolégniaceae Saprolegniales Saprolegniomycetidae Hôtes Espèce Genre Famille Ordre Sous-classe

Tableau 1 : Classification des oomycètes parasites de plantes ou d'animaux les plus étudiés selon la classification taxonomique disponible sur le site NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy). La liste des organismes infectés par ces oomycètes n’est pas exhaustive mais représente les hôtes majoritairement associés à l’oomycète concerné.

Solanacées infestans Solanacées parasitica Chêne ramorum Soja sojae Phytophthora Vigne viticola Plasmopara Crucifères parasitica Hyaloperonospora Peronosporaceae Peronosporales Mammifères insidiosum Solanacées oligandrum Angiospermes ultimum Pythium Pythiaceae Pythiales Peronosporomycetidae Poissons, amphibiens ferax Poissons parasitica Saprolegnia Crustacées astaci Betteraves, épinards cochlioides Légumineuses, céréales euteiches Aphanomyces Saprolégniaceae Saprolegniales Saprolegniomycetidae Hôtes Espèce Genre Famille Ordre Sous-classe

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Au sein de l’embranchement des Straménopiles, les oomycètes sont phylogénétiquement

proche des diatomées (Bacillariophyceae), des algues dorées (Pelagophyceae) et des algues

brunes (Pheophyceae) (Figure 1).

1.2 Des microorganismes parasites de plantes et d'animaux

La classe des oomycètes comprend des parasites destructeurs de nombreuses plantes

cultivées. La sous-classe des Peronosporomycetidae (Tableau 1), comprend certaines espèces

pathogènes d’animaux et de nombreuses espèces phytopathogènes responsables de maladies communément appelées "mildiou" (francisation du nom anglais « mildew »). On trouvera

ainsi Phytophthora infestans (Figure 2.1), responsable du mildiou de la pomme de terre, qui a

causé une importante famine aux conséquences tragiques dans l’Irlande du XIXème siècle.

Les études phylogénétiques de différentes souches de P. infestans montrent que celles qui se

situent actuellement en Europe sont toutes originaires des Andes (Gomez-Alpizar, Carbone, and Ristaino 2007), une des régions initiales de la culture des solanacées dans le monde.

L'oomycète responsable du mildiou de la vigne, Plasmopara viticola (Figure 2.B), a

également été importé depuis l’Amérique et infecte toutes les plantes du genre vitis. Certains

oomycètes sont des parasites responsables de pourritures racinaires comme par exemple

Phytophthora sojae (Figure 2.C), à l'origine de lourdes pertes sur les cultures de soja (Wrather

et al. 2001).

La sous-classe des Saprolegniomycetidae (Tableau 1) comprend des espèces phyto et

zoopathogènes. Ainsi le genre Aphanomyces regroupe plusieurs espèces de parasites

racinaires. Parmi les plus importants d'un point de vue agronomique, on trouve Aphanomyces

cochlioides (Figure 2.D) qui infecte la betterave et l’épinard ainsi qu’Aphanomyces euteiches

(Figure 2.E) qui infecte une large gamme de légumineuses telles que le haricot, la luzerne et le pois. La maladie du pois causée par A. euteiches est appelée « pourriture racinaire précoce»

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Figure 2 : Illustration des principaux oomycètes pathogènes et de leurs hôtes. A. Phytophthora infestans

sur pomme de terre (www.agen.ufl.edu). B.Plasmopara. viticola sur la vigne (www.apsnet.org). C. Champ de soja contaminé par Phytophthora s ojae (www.apsnet.org). D. Betterave saine à gauche et infecté par A.

cochlioides à droite (www.apsnet.org). E. Champ de pois contaminé par Aphanomyces euteiches (INRA). F.

Cheval infecté par Pythium in sidiosum (www.cpap.embrapa.br). G. Saprolegnia p arasitica sur une Perche (www.umassvegetable.org). H. Pythium u ltimum sur des pommes de terre (www.gov.mb.ca). I.

Hyaloperonospora parasitica sur le broccoli (www.bspp.org.uk)

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Figure 2 : Illustration des principaux oomycètes pathogènes et de leurs hôtes. A. Phytophthora infestans

sur pomme de terre (www.agen.ufl.edu). B.Plasmopara. viticola sur la vigne (www.apsnet.org). C. Champ de soja contaminé par Phytophthora s ojae (www.apsnet.org). D. Betterave saine à gauche et infecté par A.

cochlioides à droite (www.apsnet.org). E. Champ de pois contaminé par Aphanomyces euteiches (INRA). F.

Cheval infecté par Pythium in sidiosum (www.cpap.embrapa.br). G. Saprolegnia p arasitica sur une Perche (www.umassvegetable.org). H. Pythium u ltimum sur des pommes de terre (www.gov.mb.ca). I.

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(Gaulin et al. 2007). L’ampleur des dégâts causés par cette maladie en France et le manque de moyen de lutte efficace contre cette maladie ont limité fortement l'extension de la culture de pois fourrager en France. D'autres oomycètes sont responsables de maladies sur les animaux,

tel que Pythium insidiosum (Figure 2.F) capable d’infecter des mammifères comme le chien,

le cheval et l’homme et provoquant une maladie appelé pythiose (Mendoza, Hernandez, and Ajello 1993). Cependant la plupart des hôtes d'oomycètes parasites d'animaux sont des organismes aquatiques, comme les poissons et les crustacés (van West 2008). Pour exemple,

les épizooties dûes à Saprolegnia parasitica (Figure 2.G) ont de lourdes conséquences sur la

production et les rendements de la pêche et des fermes piscicoles (Hatai and Hoshiai 1992).

De façon similaire, Aphanomyces astaci vivant en milieu aquatique serait responsable de la

disparition de la plupart des écrevisses dites « Europénnes » (Unestam and Weiss 1970) (Austropotamobius pallipes ). Il semblerait que la souche d’A. astaci ait été importée en

Europe au XIXème siècle via des écrevisses dites « Américaines » (Orconectes limosus )

introduite dans les cours d’eau européens (Vennerström, Söderhäll, and Cerenius 1998).

2. Génomique des oomycètes

2.1 Banques d’ESTs et génomes d’oomycètes

La plupart des produits phytosanitaires utilisés habituellement contre les maladies fongiques sont généralement inefficaces contre les maladies causées par les oomycètes. Afin d'identifier de nouvelles cibles de molécules anti-oomycètes et de mieux comprendre les mécanismes moléculaires infectieux des oomycètes, des projets de séquençages de banque d’ADNc à grande échelle et de génomes ont été développés. Ces projets ont concerné en priorité

plusieurs espèces de Phytophthora, ceci étant justifié par l’importance des dégâts causés par

ces organismes sur des plantes cultivées d'intérêt agronomique majeur comme le soja et la pomme de terre.

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-19160 -Aphanomyces euteiches -3599 -Aphanomyces cochlioides -3 -Aphanomyces piscida -1513 -Saprolegnia parasitica -145 -Plasmopara halstedii -10 -Plasmopara viticola -4652 -Pythium oligandrum -100391 -Pythium ultimum 8,5x 387 14,7 75 Hyaloperonospora parasitica -1 -Phytophthora megakarya -6 -Phytophthora colosaiae -12922 -Phytophthora brassicae -755 -60-70 Phytophthora nicotinae -3 568 -60-70 Phytophthora parasitica 2-30x (en cours) 56457 -60-70 Phytophthora capsici 9x 41K 18 95 Phytophthora sojae 7x -16 65 Phytophthora ramorum 9x 94 k 22 237 Phytophthora infestans Couverture du génome Nombre d'ESTs Nombre de gènes (x 1000) Taille du génome (Mb) Organismes

Tableau 2 : Données de génomiques d’oomycètes disponibles. Les données d’EST sont celles disponibles sur le NCBI.

-19160 -Aphanomyces euteiches -3599 -Aphanomyces cochlioides -3 -Aphanomyces piscida -1513 -Saprolegnia parasitica -145 -Plasmopara halstedii -10 -Plasmopara viticola -4652 -Pythium oligandrum -100391 -Pythium ultimum 8,5x 387 14,7 75 Hyaloperonospora parasitica -1 -Phytophthora megakarya -6 -Phytophthora colosaiae -12922 -Phytophthora brassicae -755 -60-70 Phytophthora nicotinae -3 568 -60-70 Phytophthora parasitica 2-30x (en cours) 56457 -60-70 Phytophthora capsici 9x 41K 18 95 Phytophthora sojae 7x -16 65 Phytophthora ramorum 9x 94 k 22 237 Phytophthora infestans Couverture du génome Nombre d'ESTs Nombre de gènes (x 1000) Taille du génome (Mb) Organismes

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Les efforts de séquençage (Tableau 2) se sont tout d'abord focalisés sur P. infestans, une banque de 1000 clones d’ADNc issues d’hyphes a été réalisée (Kamoun et al. 1999). En 2003,

2147 ESTs ont été obtenues à partir de P. infestans (Torto et al. 2003) qui furent complétées

par 75757 ESTs issues de 20 banques d’ADNc différentes représentant un large spectre de condition de culture (Randall et al. 2005). L’assemblage de ces séquences a permis l’annotation et la prédiction de 18256 unigènes. Parmi les gènes identifiés, plusieurs interviennent dans les mécanismes infectieux et sont communs aux champignons.

P. sojae a également fait l'objet d'un séquençage massif d'ADNc. 3035 ESTs issues de sojas

infectés par P. sojae ont été obtenues (Qutob et al. 2000). Les 3035 ESTs obtenues ont pu être

analysées et classées selon différents critères comme l’homologie avec d’autres séquences connues, le pourcentage de GC, la présence de motifs conservés. Les premiers ESTs de

P. sojae ont été complété par la suite par d’autres programmes de séquençages sur des

banques d’ADNc issues de mycélium cultivé dans des conditions de culture différentes. Les

ESTs de P. sojae ont atteint finalement un total de 28 913 ESTs assemblées en 13 234

unigènes. D’autres organismes du genre de Phytophthora ont pu aussi faire l’objet de

séquençage d’ADNc. 755 ESTs de P. nicotianae ont été obtenus et assemblés en 386

unigènes qui ont permis la mise en évidence de gènes intervenant spécifiquement dans certaines phases de développement de l’organisme (Shan, Marshall, and Hardham 2004;

Skalamera, Wasson, and Hardham 2004). P. parasitica a également bénéficié du séquençage

de 3568 clones d’ADNc obtenus à partir de mycélium cultivé in vitro . Les ESTs furent

ensuite assemblés en 2269 unigènes (Panabieres et al. 2005). L’obtention de souche de

P. parasitica exprimant une gène rapporteur de type GFP, a permis d’établir précisément les

stades de l’interaction avec la tomate. Ainsi 4 000 ESTs ont été générées au moment de la

phase tardive de l’interaction (phase nécrotrophe). L’analyse de ces ESTs de P. parasitica (Le

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la phase nécrotrophe de la croissance du pathogène. Récement, 90 664 ESTs de Pythium

ultimum ont été générés par pyroséquençage, les ESTs ont été assemblés en 35 507 unigènes

(Cheung et al. 2008).

Certains ESTs d’organismes appartenant aux Saprolégniales ont également été obtenus. 1513

ESTs de S. parasitica ont été générés puis assemblés en 1155 unigènes (Torto-Alalibo et al.

2005). Chez le genre Aphanomyces, trois banques de 1500 ADNc issues d’A. cochliodes de

trois conditions de culture différentes, un milieu de culture pauvre, un milieu de culture riche et une condition d’infection d’une lignée sensible de betterave (Weiland and MacGrath 2006). Au total, 3599 ESTs ont été générés puis assemblés en 1964 unigènes. Les unigènes ont été annotés puis implémentés sur la « Oomycete Genomic Database » (www.oomycete.org). Les premiers séquençages de génome ont été entrepris par le Joint Genome Institute (JGI,

USA) en 2004 sur les espèces P. sojae et P. ramorum (Govers and Gijzen 2006). La méthode

rapide de séquençage par shotgun (ou Whole-Genome Shotgun) a permis de bénéficier très tôt des données nucléiques pour ces deux espèces, à savoir 86 Mb, avec une couverture de 9x,

comportant 19 027 modèles de gènes chez P. sojae et de 66.6 Mb, avec une couverture de 7x,

comportant 15 743 modèles de gènes chez P. ramorum (Tyler et al. 2006). Par la suite le

séquençage du génome de P. infestans a été entrepris au Broad Institute, USA. Le génome

génome de 237 Mb comportant 22658 modèles de gènes, les données sont disponibles sur

Phytophthora infestans genome database (http://www.broad.mit.edu/) (Nusbaum 2008). Il

s’avère que 50 Mb du génome de P. infes tans sont uniquement constitués de séquences

répétées ce qui a rendu l’assemblage du génome difficile. Le JGI a également séquencé le

génome de Hyaloperonospora parasitica qui comporte 75 Mb avec une couverture de 8,5x.

La recherche de modèle de gène a conduit à l’identification de 14 700 modèles de gènes. Pour l’ensemble de ces génomes, la prédiction de gènes a été réalisée à l’aide de l’algorithme

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FGENESH (Solovyev, Salamov, and Lawrence 1994). Les ESTs disponibles pour chacune des espèces ont facilité la prédiction des modèles de gènes. Ceci a permis de mettre à la disposition de la communauté scientifique les protéomes prédits de ces différents organismes sur différents sites web et bases de données.

2.2 Outils bioinformatiques dédiés à l’étude des oomycètes

L’essor du nombre de données nucléiques et leur mise à disposition à la communauté scientifique a nécessité le développement de bases de données. Elles sont pour la plupart facilement utilisables sur Internet et permettent de récupérer les données nucléiques et protéiques. Oomycete Genomics Database (http://www.oomycete.org/) contient en plus des

données génomiques de Phytophthora, les données de transcrits de Hyaloperonospora

parasitica, Plasmopara halstedii, Saprolegnia parasitica et Aphanomyces cochlioides . Cette

base de données contient également des données de génomique de clones de P. infestans. VBI

Microbial Database V3.0 (http://phytophthora.vbi.vt.edu/) est un portail qui permet d’accéder

aux bases de données du Virginia Bioinformatics Institute (VBI). Les génomes de P. sojae,

P. ramorum, P. infestans. H. parasitica sont disponibles. En plus des bases de données

génomiques, le VBI met également à disposition une base de données des EST de P. sojae,

P. infestans et H. parasitica. (Tripathy et al. 2006). BI Phytophthora infestans database est

une base de données développée par le Broad Institut. Le site permet l’accès au génome de P.

infestans ainsi qu’aux annotations. JGI genome database (http://genome.jgi-psf.org/) est un

ensemble de base de données de génomes eucaryotes et procaryotes dont celui de P. sojae,

P. ramorum, P. capsici. Le site propose une large gamme d’outils de recherche sur les

modèles de gènes. L’annotation de ces modèles est très complètes, annotation BLAST sur les protéines connues, recherche de domaine InterPro et l’assignation de catégorie Gene Ontology. En plus de ces

(22)
(23)

trois genomes de Phytophthora, le JGI met également à disposition le génome entièrement

séquencés de trois autres chromalvéolés celui des diatomés Thalassiosisra pseudonana et

Phaeodactylum trichornotum et celui de la Pelagophyceae, Aureococcus anophagefferens.

Phytophthoradb (University of Califonia) (http://www.phytophthoradb.org) élaborée par l’université de Pennsylvanie est plus particulièrement dédiée à la recherche de marqueurs

génétiques et contient des données de marqueurs sur 93 espèces de Phytophthora. La

particularité de cette base de données et de pouvoir effectuer sur le site des analyses RFLP virtuelles.

L’ensemble de ce type d’outils facilite grandement la recherche in silico de gène d’interêt en

offrant notamment la possibilité de les identifier par mots clés, catégorie fonctionnelles, ou par leurs relations de paralogie/orthologie avec d’autres organismes. Ces gènes d’interêt pourront être ensuite expérimentalement testés.

2.3 Effecteurs du pouvoir pathogène

2.3.1 Définition et généralités sur les effecteurs

Au cours d’une interaction avec la plante, les oomycètes secrètent des molécules qui participent à l’infection des cellules hôtes et qui sont regroupées sous le terme d'effecteurs. Il s'agit notamment de protéines impliquées dans l'adhésion du parasite aux cellules de l'hôte ou encore la dégradation de molécules végétales. Une classe importante de ces molécules a pour rôle de bloquer la mise en place des réactions de défense de l’hôte afin de faciliter la colonisation de l’hôte. Les données moléculaires sur les génomes d’oomycète et les outils bioinformatiques ont permis la recherche et l’identification in silico d’effecteurs protéiques en recherchant notamment l’occurence d’un peptide signal dans les séquences.

(24)

Figure 3 : Schéma représentant le mode d’action des effecteurs sécrétés par les oomycètes.

En bleu figurent les effecteurs et les cibles apoplasmiques, en rouge les effecteurs et les cibles symplasmiques (Kamoun 2006). Les effecteurs apoplasmiques sont sécrétés dans l’espace extracellulaire et vont pouvoir interagir avec des cibles végétales pariétales ou membranaires. Les effecteurs symplasmiques sont sécrétés dans l’apoplasme puis ils sont internalisés dans la cellule végétale où ils peuvent interagir avec une cible cytoplasmique.

Figure 3 : Schéma représentant le mode d’action des effecteurs sécrétés par les oomycètes.

En bleu figurent les effecteurs et les cibles apoplasmiques, en rouge les effecteurs et les cibles symplasmiques (Kamoun 2006). Les effecteurs apoplasmiques sont sécrétés dans l’espace extracellulaire et vont pouvoir interagir avec des cibles végétales pariétales ou membranaires. Les effecteurs symplasmiques sont sécrétés dans l’apoplasme puis ils sont internalisés dans la cellule végétale où ils peuvent interagir avec une cible cytoplasmique.

(25)

Les effecteurs sont classés sous le terme de cytoplasmique ou apoplastique en fonction de leur localisation dans les tissus de l’hôte. Certains sont capables d’interagir avec une ou plusieurs cibles appartenant à la plante hôte (Figure 3) (Kamoun 2006). Cette cible peut être localisée soit dans l’espace extracellulaire, et dans ce cas l’effecteur est sécrété au niveau de l’apoplasme, ou bien dans le cytoplasme ce qui nécessite la translocation de l'effecteur dans le cytoplasme de la cellule hôte. Les effecteurs d’oomycètes peuvent être également classés sur la base de leur fonction biologique. Le tableau 3 présente les effecteurs identifiés et validés expérimentalement (Tyler 2008)

2.2.2 Effecteurs cytoplasmiques

2.2.2.1 Les protéines à motif RxLR-dEER

Pour une espèce végétale donnée, certaines variétés peuvent être résistantes à une souche ou une race d'une espèce de microorganisme pathogène, alors que d’autres sont qualifiées de

sensibles. Les travaux de Flor sur le pathosystème Lin-Melampsora lin i ont montré que la

résistance dépend de la présence d'un gène de résistance chez la plante (R) et d'un gène dit « d'avirulence » (Avr) chez le microorganisme (Flor 1941). Chez les oomycètes, plusieurs gènes d'avirulence ont été caractérisés par des approches génétiques. Il s'agit des gènes

AvrATR1 et AvrATR13 de H. parasitica (Rentel et al. 2008; Sohn et al. 2007), Avr1b-1 chez

P. sojae (Dou, Kale, Wang, Chen et al. 2008; Shan et al. 2004), Avr4 et Avr3a chez P. infestans (Armstrong et al. 2005; Bos et al. 2006; Dou et al. 2008; Whisson et al. 2007; van

Poppel et al. 2008). Les gènes de résistance correspondant ont également été isolés chez les plantes hôtes. Ces derniers codent des protéines prédites pour être localisées à l'intérieur du cytoplasme suggérant que la perception du produit du gène d'avirulence intervient à l'intérieur

de la cellule végétale. La comparaison in silico des protéines Avr d’oomycètes a montré que

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N-Figure 4 : Mode d’action de deux types d’effecteurs (Tyler et al., 2008). A partir de

l'haustorium de Phtophthora, structure cellulaire spécialisée qui s'invagine dans la cellule végétale, des effecteurs microbiens sont produits et transloqués à l'intérieur de la cellule infectée. Deux types d'effecteurs ont été identifiés : les effecteurs à domaines RxLR-DEER (R-D) et les Crinkle and Necrosis (CRNs) protéines. Un des rôle de ces effecteurs est de supprimer les réactions de défense de l'hôte, en particulier la mort cellulaire de type hypersensible (PCD). En réponse à la production des effecteurs, certaines plantes ont acquis la capacité de détecter ces protéines grâce à des récepteurs spécifiques (R) et d'induire une résistance.

Figure 4 : Mode d’action de deux types d’effecteurs (Tyler et al., 2008). A partir de

l'haustorium de Phtophthora, structure cellulaire spécialisée qui s'invagine dans la cellule végétale, des effecteurs microbiens sont produits et transloqués à l'intérieur de la cellule infectée. Deux types d'effecteurs ont été identifiés : les effecteurs à domaines RxLR-DEER (R-D) et les Crinkle and Necrosis (CRNs) protéines. Un des rôle de ces effecteurs est de supprimer les réactions de défense de l'hôte, en particulier la mort cellulaire de type hypersensible (PCD). En réponse à la production des effecteurs, certaines plantes ont acquis la capacité de détecter ces protéines grâce à des récepteurs spécifiques (R) et d'induire une résistance.

(27)

est similaire à celui détecté chez certaines protéines de parasite humains du genre

Plasmodium, agents du paludisme. Ces pathogènes intracellulaires sécrètent des protéines

dans les érythrocytes humains pendant l’infection et le motif proche de RxLR (RxLxE) permettrait le transport des protéines du parasite au travers de la membrane des érythrocytes infectés (Bhattacharjee et al. 2006). Il est à noter que les organismes appartenant au phylum

des Apicomplexes comme ceux du genre Plasmodium sont des Chromalvéolés au même titre

que les oomycètes. Dans ce contexte l’hypothèse a été émise que le motif RxLR-dEER était un signal de translocation de l'effecteur depuis l’haustorium du parasite vers l'intérieur de la cellule végétale (Birch et al. 2008; Dou et al. 2008). Le rôle du motif RxLR-dEER dans la translocation des protéines effectrices a été évalué notamment par la construction de souches de P. sojae exprimant des versions mutées sur le motif RxLR de la séquence du gène d’avirulence Avr1b. L’infection de plants de soja exprimant le gène de résitance Rps1 correspondant, a révélé une augmentation de la virulence des souches exprimant une version mutée d’Avr1b. De plus, des expériences d’expression transitoire sur feuille de soja, ont révélé que le motif RxLR est fonctionnel indépendemment du parasite, et permettrait la translocation de molécules depuis le parasite vers le cytosol de l’hôte (Dou et al. 2008). Une recherche exhaustive de protéines RxLR a été entreprise chez les oomycètes dont le génome

était séquencé par des approches in silico . Plus de 370 candidats ont été identifiés chez

P. sojae et P. ramorum (Dou et al. 2008). Ces gènes semblent provenir d’un même ancêtre

commun qui se serait dupliqué plusieurs fois dans le génome et aurait évolué. Par ailleurs, plus de la moitié des candidats identifiés possèdent trois motifs conservés appelés K, Y et W (Dou et al. 2008).

Le rôle des protéines RxLR au cours de l’interaction a été recherché via différentes approches. Ainsi, l'expression transitoire de la protéine Avr1b de P. sojae dans des tissus végétaux inhibe

(28)

la mort cellulaire induite par la protéine de souris, pro apoptotique Bax1 (Dou et al. 2008). Ce

résultat est également obtenu chez Saccharomyces cer evisae, suggérant que les cibles

d’Avr1b, conduisant à la mort cellulaire, sont conservées chez ces deux eucaryotes. De façon similaire la translocation de la protéine d'avirulence ATR13 de H. parasitica via le système de

sécrétion de type III de la bactérie P. syringae entraîne une inhibition du dépôt de callose

induite par l'interaction (Sohn et al. 2007). Ces deux exemples suggèrent qu'une fonction importante des protéines RxLR est de bloquer les systèmes de défense de la plante comme la mort cellulaire programmée, permettant à l’agent pathogène de se développer (Tyler 2008). 2.2.2.3 Les protéines crinkling and necrosis (CRN)

Les protéines de la famille des CRN (CRinkling and Necrosis) constituent un autre type d’effecteurs cytoplasmiques qui ne possèdent pas de motif RxLR. Cette famille de protéine a

été initialement identifiée chez P. infestans et a été détecté chez tous les oomycètes pour

lesquels des programmes de séquençage ont été engagés. Des expériences d’expression transitoire via le virus X de la pomme de terre (PVX), suggèrent une localisation cytosolique de ces effecteurs, capables d’induire une réponse hypersensible chez le tabac (Torto et al. 2003) (Figure 4). De façon surprenante cette famille de protéine, se caractérise par la présence d’un motif en aval du peptide signal du type LxLFLAK. Le rôle de ce motif ainsi que la fonction des protéines CRN au cours de l’interaction ne sont pas encore établis.

2.2.3 Effecteurs apoplastiques

2.2.3.1 Les protéines à domaines kazals

Parmi les effecteurs apoplasmiques d’oomycète, des protéines inhibitrices de protéases à sérines ont été identifiées chez P.infestans (Tian et al. 2004). Ces protéines possèdent un ou

(29)

plusieurs domaines de type kazal responsables de l’activité inhibitrice de protéase. Le rôle de ces protéines serait d’inhiber des protéases de la plante hôte. C’est le cas d’EPI1 qui interagit avec la protéase P69 (de type subtilisine) de la tomate et dont l’expression est fortement induite au cours de l’interaction (Tian et al. 2004).

2.2.3.2 Les protéines CBEL et CBEL-like

La protéine CBEL de P. parasitica a été initialement caractérisée sur sa capacité d’induire une réponse hypersensible chez le tabac (Gaulin et al. 2006). Le rôle de CBEL pour le parasite a été étudié par une approche de silencing transcriptionnel en construisant des souches modifiées pour l'expression du gène CBEL (Gaulin et al. 2002). Les mutants ainsi obtenus ne sont plus capables d'adhérer sur des substrats cellulosiques et de différencier des structures infectieuses. Une analyse par microscopique électronique des transformants, a révélé que

CBEL est impliquée dans l’organisation des parois des hyphes de P. parasitica . La capacité

d’induction de réponse de défense chez le tabac ou A. thaliana par CBEL est liée à la

présence dans la protéine de domaines de liaison à la cellulose (CBD ; Cellulose Binding Domain) (Gaulin et al. 2002) (Gaulin et al. 2006). Ces motifs sont à eux seuls suffisants pour induire l’expression de gènes de défense. Les protéines CBEL-like sont rencontrées dans l’ensemble des oomycètes dont des données de séquences sont disponibles.

2.2.3.3 Les élicitines et les élicitines-like

Les élicitines sont des protéines produites par les oomycètes qui induisent des réactions de défense chez diverses espèces végétales. La famille des élicitines comporte 128 protéines

différentes chez Phytophthora et Pythium (Ponchet et al. 1999). Les Phytophthora sont

connus pour être incapables de synthétiser des stérols mais cependant ils les requièrent pour

leur reproduction. L’hypothèse est admise que les Phytophthora utilisent les élicitines comme

transporteurs de stérols (Blein et al. 2002; Mikes et al. 1998). Celles-ci leurs permettent de récupérer les stérols de la plante hôte afin de les utiliser pour réaliser leur cycle sexuel

(30)

(Hendrix 1964). La réponse nécrotique induite chez la plante par les élicitines est due à la reconnaissance d’un complexe élicitine-stérols et non l’élicitine seule (Ponchet et al. 1999).

(31)

3. Aphanomyces euteiches, un parasite des légumineuses

3.1 La pourriture racinaire précoce du pois

3.1.1 A. euteiches , Un membre du complexe parasitaire

Il existe différents microorganismes vivant dans le sol et capables de provoquer des maladies racinaires chez le pois. Ces maladies ont été étudiées et classées en quatre grandes catégories (Hagedorn 1984; Wicker, Hulle, and Rouxel 2001). Ces catégories ont été crées en fonction du stade de développement du pois lors de l’infection par l’agent pathogène.

Chronologiquement, le pois est la cible de la fonte des semis causé par Pythium spp,

Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea et Sclerotinia sclerotiorum. En second lieu, le pois est la

cible de la pourriture racinaire précoce se déclarant généralement un mois après le semis dans

des conditions pédoclimatiques favorables au développement d’A. euteiches. En troisième

lieu, le pois est sujet à un flétrissement précoce dû à Fusarium oxysporum ainsi qu’à

Sclerotinia sclero tinium. En fin de cycle, le pois est aussi la cible de nécroses racinaires

provoquées par des complexes parasitaires (Didelot, Maumene, and Carrouee 1994) composés

essentiellement de Phoma medicaginis , Fusarium solani , Fusarium oxysporum et Chalara

elegans.

La pourriture racinaire causée par Aphanomyces euteiches est la maladie d’origine

microbienne qui cause le plus de dégâts dans la culture française de pois fourrager. A ce jour, il n’existe pas de traitement efficace, ni de variété de pois résistante à A. euteiches. Décrite pour la première fois par Jones et Drechsler en 1920 dans la région du Midwest aux Etats-

(32)

Figure 5 : Carte de la répartition spatiale des zones contaminées par A. euteiches, élaboré en 2000 par l’UNIP et l’INRA de rennes (Muel 2007). Les zones quadrillées en vert correspondent aux zones oùA. euteiches est très

peu présent. En rouge figurent les départements qui sont régulièrement contaminés par A. eutei ches. Les départements colorés en noir représentent les zones très atteintes, le Bassin Parisien et la Bretagne.

Figure 5 : Carte de la répartition spatiale des zones contaminées par A. euteiches, élaboré en 2000 par l’UNIP et l’INRA de rennes (Muel 2007). Les zones quadrillées en vert correspondent aux zones oùA. euteiches est très

peu présent. En rouge figurent les départements qui sont régulièrement contaminés par A. eutei ches. Les départements colorés en noir représentent les zones très atteintes, le Bassin Parisien et la Bretagne.

Tableau 4 : Classification et efficacité des différentes méthodes de lutte contre A. euteiches. Les différentes méthodes de lutte contre A. euteiches sont décrites dans la première colonne. Les moyens utilisés par ces méthodes sont décrits dans la deuxième colonne. La troisième colonne présente une évaluation de cette méthode et la quatrième colonne les inconvénients liés à cette méthode.

(Pilet-Nayel, Muehlbauer et al. 2002) Résistance partielle

en cours Séléction assistée par marqueur

Génétique Moyenne Trichoderma harzianum Moyenne G. mossae Moyenne Glomus fasciculatum Moyenne Bacillus subtilis Moyenne Pseudomonas fluorescens

(Heungens and Parke 2000) (Rosendahl 1985; Dandurand and Knudsen

1993) Moyenne

Burkholderia cepacia

Biologique

(Fritz, Allmaras et al. 1995; Williams-Woodward, Pfleger et al.

1997) (Papavizas and Ayers 1974; Smolinska,

Knudsen et al. 1997) Moyenne

Crucifère ou avoine en précédent cutural

Itinéraire technique

Couteuse Moyenne

Trifluraline et oryzaline

(Grau and Reiling 1977; Jacobsen and Hopen 1981) Couteuse

Moyenne Tachigaren

Chimique

Ne décontamine pas la parcelle Bonne

Test PCR et RT-PCR

(Vandemark, Kraft et al. 2000; Vandemark, Barker

et al. 2002) Ne décontamine pas la parcelle

Moyenne Mesure de l'Indice de Nécrose Racinaire

Prophylactique Références Inconvénient Efficacité Moyens utilisés Méthode de lutte

Tableau 4 : Classification et efficacité des différentes méthodes de lutte contre A. euteiches. Les différentes méthodes de lutte contre A. euteiches sont décrites dans la première colonne. Les moyens utilisés par ces méthodes sont décrits dans la deuxième colonne. La troisième colonne présente une évaluation de cette méthode et la quatrième colonne les inconvénients liés à cette méthode.

(Pilet-Nayel, Muehlbauer et al. 2002) Résistance partielle

en cours Séléction assistée par marqueur

Génétique Moyenne Trichoderma harzianum Moyenne G. mossae Moyenne Glomus fasciculatum Moyenne Bacillus subtilis Moyenne Pseudomonas fluorescens

(Heungens and Parke 2000) (Rosendahl 1985; Dandurand and Knudsen

1993) Moyenne

Burkholderia cepacia

Biologique

(Fritz, Allmaras et al. 1995; Williams-Woodward, Pfleger et al.

1997) (Papavizas and Ayers 1974; Smolinska,

Knudsen et al. 1997) Moyenne

Crucifère ou avoine en précédent cutural

Itinéraire technique

Couteuse Moyenne

Trifluraline et oryzaline

(Grau and Reiling 1977; Jacobsen and Hopen 1981) Couteuse

Moyenne Tachigaren

Chimique

Ne décontamine pas la parcelle Bonne

Test PCR et RT-PCR

(Vandemark, Kraft et al. 2000; Vandemark, Barker

et al. 2002) Ne décontamine pas la parcelle

Moyenne Mesure de l'Indice de Nécrose Racinaire

Prophylactique Références Inconvénient Efficacité Moyens utilisés Méthode de lutte

(33)

Unis, la pourriture racinaire du pois s’est ensuite étendue à toutes les régions américaines productrices de pois (Papavizas and Ayers 1974). Le micro-organisme affectant les zones de culture intensive du pois dans des régions humides et à climat doux, la maladie se rencontre dans d’autres pays producteurs de pois tel que la France (Labrousse 1933), l’Australie et le Japon (Yokozawa, Kuninaga, and Teranaka 1974).

3.1.2 Symptômes de la pourriture racinaire

Les symptômes se manifestent généralement dès le stade 3-4 feuilles. Sur la partie racinaire, on peut observer les symptômes primaires de la maladie. Des lésions molles et translucides apparaissent une semaine après infection et sont suivis d’un brunissement des radicelles. Au

début de la floraison, les micro-organismes du complexe parasitaires (majoritairement Phoma

medicaginis et Fusarium solani) viennent assombrir les nécroses, il s’ensuit un dessèchement

des racines. Les symptômes secondaires sont observables environ 15 jours après infection dès le stade 5-6 feuilles sur les parties aériennes de la plante. La maladie racinaire provoque des chloroses, le nanisme ainsi qu’un dessèchement de la plante. La plante ne produit alors que très peu de gousses qui ne contiennent parfois qu’une seule graine.

3.1.3 Répartition, impact et lutte contre la maladie en France

La zone majeure où se localise la maladie coïncide avec les zones de production intensive du pois, comme le Bassin Parisien et la partie Ouest de la Bretagne. Les zones mineures d’infection sont la région Rhône-Alpes, la Charente-Maritime, les Pyrénées Atlantiques (Figure 5). En 2000, la surface totale de parcelles infectées était estimée à 4% des surfaces cultivées en pois selon les données Union Nationale de l’Interprofession des Protéagineux.

Les dégâts occasionnés par A. euteiches peuvent engendrer des pertes de rendement pouvant

(34)

Figure 6 : Arbre phylogénique des oomycètes constuit à partir de trois

arbres phulogénique maximum de vraissemblance (ML), maximum de

parsimonie (MP), et distance (NJ) de la protéines mitochondriales cox2. Les

valeurs de bootstrapp supérieur à 50% sont figurés en dessus de chaque nœud dans l’ordre suivant ML (500), MP (1000), NJ (1000). L’arbre est enraciné sur l’espèce Hyphochytrium catenoides

Figure 6 : Arbre phylogénique des oomycètes constuit à partir de trois

arbres phulogénique maximum de vraissemblance (ML), maximum de

parsimonie (MP), et distance (NJ) de la protéines mitochondriales cox2. Les

valeurs de bootstrapp supérieur à 50% sont figurés en dessus de chaque nœud dans l’ordre suivant ML (500), MP (1000), NJ (1000). L’arbre est enraciné sur l’espèce Hyphochytrium catenoides

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L’ensemble des méthodes de lutte effectué jusqu’à présent contre A. euteiches sont rassemblées dans le tableau 4. Qu’elles soient chimiques, biologiques, prophylactiques ou culturales, aucune des méthodes élaborées n’est assez satisfaisante pour garantir des récoltes de pois à un coût de production raisonnable. La stratégie qui semble la plus prometteuse, concerne la création de lignées de pois tolérantes par sélection assistée par marqueur. Par

ailleurs, la mise au point d’un agent chimique anti-Aphanomyces serait également une

alternative envisageable.

3.2 Biologie d’A. euteiches

3.2.1 Classification d’A. euteiches

L’analyse phylogénique de la sous unité II de la cytochrome oxydase mitochondriale (cox2) a permis de construire une classification des oomycètes selon des critères moléculaires (Figure 6). Le phylum des oomycètes contient deux sous-classes principales celle des

Peronosporomycetidae dont fait parti les Phytophthora, et celle des Saprolegniomycetidae

auquel le genre Aphanomyces appartient. Aphanomyces est subdivisé en trois sous-genres

construit à partir de caractéristiques morphologiques déterminées à partir de l’ornementation des parois de l’oogone (Scott 1961). Cette méthode permet de distinguer les sous-genres

Axyromyces et Aspiromyces qui comprennent la plupart des organismes aquatiques, et le

sous-genre Aphanomyces qui comprend 10 espèces (Tableau 5) phytopathogènes sur 32 espèces

(Gaulin et al. 2007).

3.2.2 Cycle de vie d’A. euteiches.

Le mycélium d’A. euteiches est siphonné. Les hyphes ont un diamètre allant de 4 μm à 10 μm,

hyalines et faiblement ramifiés avec des ramifications à angle droit (Figure 7.A). Les jeunes hyphes qui deviennent des zoosporanges contiennent des vacuoles irrégulièrement réparties

(36)

Tableau 5 : Liste des espèces d’Aphanomyces phytopathogènes (Gaulin, et al. 2007). La première colonne correspond

aux espèces et la deuxième au nom latin de la plante hôte. La dernière colonne correspond aux références bibliographiques

Cutter (1941) Nitella sp. Aphanomyces sparrowii Kendr (1927) Raphanus sativus Aphanomyces raphani de Barry (1860)

Spirogyra, Zygnema, Mougeotia Aphanomyces phycophilus

Wille (1899)

Spirogyra, Zygnema, Mougeotia Aphanomyces norvegicus

Ichitani et al. (1986)

Iris hollandica Aphanomyces iridis

Pfender and Hageedorn (1982)

Trifolium sp., Medicago sp.

Jones and Drechsler (1925)

Pisum sativum, Phaseolus vulgaris, Aphanomyces euteiches

Drechsler (1929)

Beta vulgari, Spinacia oleacea Aphanomyces cocchlioides Drechsler (1929) Lycopersicum esculentum Aphanomyces cladogamus Drechsler (1929) Avena sativa Aphanomyces camptostylus

B. rapa Singh and Pavgi (1977)

Brassica oleracae Aphanomyces brassicae

Publications Plantes hôtes

Espèces

Tableau 5 : Liste des espèces d’Aphanomyces phytopathogènes (Gaulin, et al. 2007). La première colonne correspond

aux espèces et la deuxième au nom latin de la plante hôte. La dernière colonne correspond aux références bibliographiques

Cutter (1941) Nitella sp. Aphanomyces sparrowii Kendr (1927) Raphanus sativus Aphanomyces raphani de Barry (1860)

Spirogyra, Zygnema, Mougeotia Aphanomyces phycophilus

Wille (1899)

Spirogyra, Zygnema, Mougeotia Aphanomyces norvegicus

Ichitani et al. (1986)

Iris hollandica Aphanomyces iridis

Pfender and Hageedorn (1982)

Trifolium sp., Medicago sp.

Jones and Drechsler (1925)

Pisum sativum, Phaseolus vulgaris, Aphanomyces euteiches

Drechsler (1929)

Beta vulgari, Spinacia oleacea Aphanomyces cocchlioides Drechsler (1929) Lycopersicum esculentum Aphanomyces cladogamus Drechsler (1929) Avena sativa Aphanomyces camptostylus

B. rapa Singh and Pavgi (1977)

Brassica oleracae Aphanomyces brassicae

Publications Plantes hôtes

Espèces

Figure 7 : Observations microscopiques d’A. euteiches. A. Mycélium d’Aphanomyces

euteiches coloré à la WGA FITC observé au microscope inversé par épifluorescence

(Badreddine et al 2008) B. Coupe de racine de M. t runcatula infectée par A. e uteiches, permettant de visualiser une oospore du parasite.

A B

Figure 7 : Observations microscopiques d’A. euteiches. A. Mycélium d’Aphanomyces

euteiches coloré à la WGA FITC observé au microscope inversé par épifluorescence

(Badreddine et al 2008) B. Coupe de racine de M. t runcatula infectée par A. e uteiches, permettant de visualiser une oospore du parasite.

A B

(37)

dans le mycélium et possèdent un cytoplasme granuleux. Les zoosporanges sont de types filamenteux et sont longs de 1 ou 2 mm. A l’intérieur se différencient les spores asexuées aussi appelées zoospores. En 1961, Scott décrit la présence de deux types de zoospores, à ce

titre A. euteiches est appelé dimorphique ou diplanétique. Les zoospores primaires migrent et

s’accumulent à l’extrémité du zoosporange où elles s’enkystent. A partir des zoospores primaires enkystées se forment les zoospores secondaires biflagellées à l’aspect réniforme (7 à 8 μm de diamètre et 13 μm de long).

Les organes de reproduction sexués sont l’oogone (organe femelle) et l’anthéridie (organe mâle). Les organes sexuels se développent à partir du mycélium avec un rapport de 5 anthéridies pour 1 oogone. Les anthéridies ont un diamètre compris entre 5 et 10 μm, une longueur de 10 à 15 μm et possèdent des tubes de fertilisation visibles. L’oogone se forme à partir d’une courte ramification d’un hyphe, elles ont une forme sphérique et une taille comprise entre 20 et 35 μm. A maturité, la paroi de l’oogone s’épaissie pour atteindre 1,5 μm. L’oosphère est contenu dans l’oogone et contient en son centre un globule huileux, elle donne l’oospore (Figure 7.B) après fertilisation.

Les cellules d'A. euteiches sont diploïdes, exceptées dans la phase de reproduction sexuée. La

phase haploïde est réduite aux gamètes (anthéridies et oospores). D’autre part, A. euteiches est

homothallique. Cependant des croisements ont été observés entre une souche d’A. euteiches

isolée à partir du pois et une souche isolée à partir du haricot (Shang, Grau, and Peters 2000) ce qui semble rendre un hétérothallisme possible, tout au moins en conditions artificielles. Une représentation du cycle de vie d’A. euteiches est représenté sur la figure 8.

Les hyphes sont naturellement lysés et détruits dans le sol (Lockwood 1960; Papavizas and Ayers 1974), pour cette raison, le mycélium joue un rôle peu important dans la constitution de l’inoculum primaire. La viabilité des zoospores est estimée de l’ordre de 5 à 6 jours en

(38)

Figure 8 : Schéma de la reproduction sexuée et asexuée d’A. euteiches (Gaulin et al. 2007).

L’hyphe peut soit former des sporanges qui vont libérer les zoospores qui s’enkystent et germent pour reformer un hyphe soit former des oogonies et des anthéridies qui fusionnent pour générer une oospore

Figure 8 : Schéma de la reproduction sexuée et asexuée d’A. euteiches (Gaulin et al. 2007).

L’hyphe peut soit former des sporanges qui vont libérer les zoospores qui s’enkystent et germent pour reformer un hyphe soit former des oogonies et des anthéridies qui fusionnent pour générer une oospore

Figure 8 : Schéma de la reproduction sexuée et asexuée d’A. euteiches (Gaulin et al. 2007).

L’hyphe peut soit former des sporanges qui vont libérer les zoospores qui s’enkystent et germent pour reformer un hyphe soit former des oogonies et des anthéridies qui fusionnent pour générer une oospore

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essentiellement composé d’oospores présent dans les racines infectées ou bien à l’état libre dans le sol. Les oospores ont la particularité de rester dans le sol pendant une période allant de 10 à 20 ans (Maufras 1997) et peuvent résister à des températures de -20°C. Ces infections secondaires permettraient aussi la constitution d’un inoculum primaire en persistant dans le sol pendant la période d’interculture et qui viendrait s’ajouter à l’inoculum constitué par les oospores.

En fonction des conditions du milieu, l’oospore germe pour générer soit un hyphe mycélien soit un sporange filamenteux. La composition des exsudats racinaires va conditionner le type de développement de l’oospore (Shang, Grau, and Peters 2000). D’autre part, les isolats de haricots produisent des oospores qui germent préférentiellement sur le haricot alors que les isolats de pois germent aussi bien sur pois que sur haricot. Le sporange différencié libère entre 300 et 400 zoospores biflagellées capables de nager dans un milieu aqueux. C’est la zoospore qui représente l’agent infectieux de la pourriture racinaire (Malvick and Percich 1998). Cette étape de l’infection est très hautement tributaire de l’hygrométrie et ne peut avoir lieu que dans un sol saturé en eau, même ponctuellement. A ce titre l’infection des racines a lieu généralement après des précipitations abondantes.

La zoospore peut s’enkyster lorsqu’elle ne trouve pas de site d’infection ou lorsqu’elle subit un choc mécanique. Mais elle peut, une fois enkystée, régénérer une nouvelle spore nageuse. Ce phénomène peut ainsi se répéter à 3 reprises jusqu’à l’établissement de l’infection (Cerenius and Soderhall 1985; Deacon 1996).

Le déplacement de la spore vers la racine se fait par chimiotactisme des composés végétaux racinaires. La spore, attirée par la racine, s’enkyste à son contact, perd alors ses flagelles et forme très rapidement une paroi. Il semble que la spore s’enkyste préférentiellement sur la zone située juste au dessus de la coiffe racinaire, au niveau de la zone d’élongation de la

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forme un hyphe mycélien qui pénètre dans la racine de manière intercellulaire en assimilant les nutriments. Après plusieurs heures, la croissance du mycélium devient inter et intracellulaire. Les hyphes progressent alors rapidement dans la racine et environ 60 heures après inoculation, l’ensemble du cortex racinaire est infecté. Les observations macroscopiques de la racine de pois infectée montrent des macérations des tissus de la plante. Cela suggère qu’A. euteiches induit une lyse des tissus de la plante hôte. Les travaux menés par Ayers en

1969 (Ayers, Papavizas, and Lumsden 1969) montre l’activité in vitro et in planta d’enzymes

polygalacturonase et cellulase. Ces activités enzymatiques mettent en évidence la dégradation de la paroi végétale lors de l’infection du cortex.

Des études ont montré que la durée de vie du mycélium à l’intérieur de la racine est inversement corrélée à la quantité d’inoculum primaire. Cette courte durée de vie du mycélium peut aussi être la cause de l’inefficacité des traitements classiques, tels que les antifongiques et des antagonistes microbiens (Kjøller and Rosendahl 1998). Ainsi, cela suppose que la lutte chimique contre A. euteiches serait efficace à des stades plus précoces de la maladie, lors de la germination des zoospores ou des oospores par exemple.

Bien que la dissémination par contact de racine à racine soit la plus commune, une dissémination par sporulation secondaire sur des tissus fraîchement atteints peut être observée. Dans le cas d’une telle dissémination, la distance parcourue par la zoospore n’excède pas 15 cm (Pfender and Hagedorn 1983).

3.3 Variabilité du pouvoir pathogène

La spécificité d’hôte d’A. euteiches est difficile à déterminer dans la mesure où il a été montré qu’A. euteiches est capable d’infecter en conditions artificielles 19 familles botaniques différentes comprenant les légumineuses, les graminées, les crucifères et les solanacées (Papavizas and Ayers 1974). Pour les légumineuses, A. euteiches a été isolé à partir de culture

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Figure 9 : Pathogénicité des souches d’A. euteiches sur différentes légumineuses en fonction de leur pathotype (Wicker, et al. 2001). L’indice de pathogénicité de la souche est indexé de 0 à 5. Les

isolats sont classés par pathotype i.e par spécificité d’hôte. Les 4 pathotypes d’A. euteiches identifiés sont représentés.

Figure 9 : Pathogénicité des souches d’A. euteiches sur différentes légumineuses en fonction de leur pathotype (Wicker, et al. 2001). L’indice de pathogénicité de la souche est indexé de 0 à 5. Les

isolats sont classés par pathotype i.e par spécificité d’hôte. Les 4 pathotypes d’A. euteiches identifiés sont représentés.

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de pois, de haricot (Pfender and Hagedorn 1983), de luzerne (Delwiche et al. 1987), de trèfle rouge (Tofte, Smith, and Grau 1992), de trèfles souterrains en Australie (Greenhalgh, Merriman, and Keane 1985) et de féverole au Canada.

Les études menées par Malvick en 1998 ont permis de caractériser les différents pathotypes américains au niveau phénotypique et moléculaire. Il ressort de ces études que le pathotype "haricot" est éloigné des pathotypes luzerne et pois qui sont confondus. Une étude plus importante menée par Wicker (Wicker, Hulle, and Rouxel 2001) a porté sur l’analyse de 91 isolats de pois provenant de différentes régions françaises contaminées. Ces isolats ont été comparés à 18 isolats provenant de pays et d’hôtes variés. Les isolats français ont pu être classés en 4 pathotypes (Figure 9). Le premier pathotype correspond aux isolats infectants une large gamme d’hôtes, le deuxième pathotype infecte plus particulièrement le pois et la luzerne mais aussi le haricot, le troisième pathotype infecte uniquement le pois et la vesce, le quatrième pathotype n’infecte que le pois, la vesse et la luzerne.

4 Objectifs de la thèse

Il ressort de cette analyse bibliographique que l’étude d’A. euteiches a été réalisée

essentiellement par des approches agronomiques. De plus sa position phylogénétique distincte

par rapport aux Phytophthora dans les oomycètes suggère la possibilité de mécanismes

propres aux Saprolégniales en termes d’infection et de métabolisme. En vue d’enrichir les connaissances sur cet oomycète, il semblait donc important de développer une ressource génomique dédiée à ce parasite. L’identification des gènes, des transcrits et des voies métaboliques spécifiques de ce micro-organisme est une première étape de recherche qui

permet d’apporter de nouvelles connaissances sur la biologie d’A. euteiches, sa pathogénicité

et les mécanismes moléculaires nécessaires à l’infection de la plante.

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d’analyse bioinformatique élaborés pour traiter 18 684 ESTs issue du séquençage de 20 000

ADNc d’A. euteiches. Dans cette partie, la construction d’une base de données en libre accès,

AphanoDB, est présentée en détails. Ces travaux sont présentés sous la forme d’un article publié en 2007 dans BMC Genomics (Madoui et al. 2007).

La deuxième partie de mon travail de thèse a consisté à analyser les données déposées dans AphanoDB afin d’identifier d’une part les effecteurs putatifs du pouvoir pathogène d’A. euteiches et d’autre part des gènes originaux (i.e absents chez les autres oomycètes étudiés). Cette étude a permis la mise en évidence d’effecteurs du pouvoir pathogène ainsi que la présence de gènes codant les enzymes intervenant dans des voies de synthèse absentes chez les Phytophthora. Ces travaux sont présentés sous la forme d’un article qui a été publié en 2008 dans PlosOne (Gaulin et al. 2008).

La troisième partie de la thèse s’est focalisée sur le métabolisme des stérols propres à

A. euteiches identifié par les analyses in silico au cours de la deuxième partie de mon travail

thèse. Une caractérisation biochimique et moléculaire de la voie de synthèse des stérols chez

A. euteiches a été réalisée. Une analyse des gènes intervenant dans la synthèse de ces stérols

chez les oomycètes est effectuée. Cette dernière partie montre que la biosynthèse des stérols par A. euteiches peut être la cible de fongicides efficaces dans la lutte phytosanitaire. Ces travaux sont présentés sous forme d’un article publié en 2009 dans New Phytologist (Madoui et al. 2009).

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Chapitre 2 : AphanoDB: une

ressource génomique pour

Aphanomyces

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Figure

Figure 1 : Arbre phylogénique des eucaryotes inféré par maximum de vraissemblance et analyse bayesienne de 16  protéines codées par le noyau
Tableau 1 : Classification des oomycètes parasites de plantes ou d'animaux les plus étudiés selon la classification taxonomique  disponible sur le site NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy)
Figure 2 : Illustration des principaux oomycètes pathogènes et de leurs hôtes. A.  Phytophthora infestans
Tableau 2 : Données de génomiques d’oomycètes disponibles. Les données d’EST sont celles disponibles sur le NCBI.
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