Étude de l’effet de solutions électro-activées
combinées avec des traitements thermiques
modérés et de nisine sur l’inactivation des spores de
Clostridium sporogenes PA 3679
Thèse
Omar El Jaam
Doctorat en Sciences et technologies des aliments
Philosophiæ Doctor (Ph. D.)
Québec, Canada
Étude de l’effet de solutions électro-activées
combinées avec des traitements thermiques
modérés et de nisine sur l’inactivation des spores de
Clostridium sporogenes PA 3679
Thèse
Omar El Jaam
Sous la direction de :
Mohammed Aider, directeur de recherche
Ismail Fliss, codirecteur de recherche
iii
RÉSUMÉ
Les inconvénients associés à l’application des traitements thermiques élevés lors de la conservation des aliments sont nombreux, allant des coûts énergétiques élevés jusqu’à la détérioration de la valeur nutritive et organoleptique des aliments transformés. La tendance des consommateurs se dirige de plus en plus vers la consommation des aliments peu transformés, salubres et de haute valeur nutritive et sensorielle. Ainsi, afin de répondre à leurs besoins et pour minimiser les effets néfastes dus aux traitements thermiques élevés, le recours à de nouvelles techniques de conservation des aliments est devenu nécessaire. Ainsi, l’objectif principal de ce projet de doctorat était de trouver une nouvelle alternative aux traitements thermiques élevés afin de produire des aliments peu transformés ayant deux caractéristiques : une haute valeur nutritionnelle et organoleptique tout en étant salubre.
Pour atteindre cet objectif, la technologie de l’électro-activation en solution, en combinaison avec des traitements thermiques modérés et de la nisine, a été mise à l’étude dans ce projet. Pour cela, huit solutions aqueuses (acétate et citrate de potassium avec et sans KCl) ont été électro-activées dans un réacteur d’électro-activation modulé avec des membranes échangeuses d’anions et de cations. Une fois électro-activées, ces solutions ont été combinées avec des températures modérées, entre 25 et 95 °C, et d’une bactériocine de source naturelle, la nisine. Ainsi, l’activité synergique de différentes combinaisons impliquant ces trois facteurs a été testée dans des conditions modèles, ainsi qu’avec une matrice alimentaire végétale, sur l’inactivation des spores de
Clostridium sporogenes PA 3679 utilisé comme un substitut non pathogène de
Clostridium botulinum.
Dans un premier temps, des solutions aqueuses d’acétate de potassium et de citrate de potassium, avec ou sans ajout de chlorure de potassium dans les deux cas, ont été électro-activées sous différentes intensités de courant électrique (100, 200, 300 et 400 mA) pendant une heure. Pour chaque type de solution, seules celles qui avaient le plus bas pH et le plus haut potentiel d’oxydoréduction (POR) ont été retenues pour la suite du projet. Par la suite, les solutions électro-activées retenues ont été testées, seules et combinées avec différents traitements thermiques modérés, pour leur effet
iv
d’inactivation des spores de C. sporogenes PA 3679 dans des conditions modèles. L’effet sporicide détecté a été validé par observation sous microscope électronique à transmission. Également, l’efficacité des traitements avec des solutions électro-activées, combinées avec la nisine à différentes concentrations, a été testée contre les spores de C. sporogenes PA 3679 dans une purée des haricots verts. Il a été démontré que ces solutions électro-activées induisaient une réduction significative des populations de spores de C. sporogenes PA 3679, mais le pouvoir tampon du milieu, induit par les matières organiques des haricots verts, a provoqué une baisse significative du degré d’inactivation des spores de C. sporogenes PA 3679 par rapport à celui détecté dans des conditions modèles. La combinaison de la nisine avec les solutions électro-activées et les traitements thermiques modérés était capable de récupérer une partie de l’activité sporicide initiale (obtenues dans des conditions modèles). L’activité sporicide finale obtenue a été validée par observation sous microscope électronique à transmission. Finalement, testée dans un milieu contenant des tiges intactes (entières) des haricots verts, une augmentation significative de l’activité sporicide a été détectée en combinant les solutions électro-activées d’acétate de potassium et de citrate de potassium avec la nisine et un traitement thermique modéré représentant le barème thermique utilisé pour le blanchiment des légumes (95 °C). Ainsi, le pouvoir protecteur de la purée des haricots pour les spores de C.
sporogenes PA 3679 a été mis en évidence.
En conclusion, deux combinaisons permettant un traitement efficace contre les spores de C. sporogenes PA 3679 ont été suggérées. La première est une combinaison d’une solution d'acétate de potassium électro-activée à 400 mA pendant 60 minutes combinée avec de la nisine à une concentration de 1000 UI/mL et un traitement thermique modéré de 95 °C pendant 15 minutes. La seconde consiste à combiner une solution de citrate de potassium électro-activée à 400 mA pendant 60 minutes avec la nisine à une concentration de 1000 UI/ml et un traitement thermique de 115 °C pendant 15 minutes.
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ABSTRACT
The severe heat treatments used for the preservation of foods, especially the canned, is associated with different disadvantages ranging from high energy costs of the process to the deterioration of the nutritional and organoleptic value of the processed foods. Currently, consumers are increasingly turning their attention to the consumption of safe, low-processed foods with high nutritional value and organoleptic value. Thus, in order to meet their needs (requirements) and to minimize the negative effects of the processing technologies, due to the high heat treatments, the search of new food preservation techniques is necessary. Thus, the main aim of this work was to find an alternative method of food preservation in order to produce low-processed foods with respect to two main characteristics: high nutritional value and microbial safety.
To reach this objective, four aqueous solutions; namely potassium acetate and potassium citrate with or without KCl added, were activated in an electro-activation reactor composed of three section separated by anion and cation exchange membranes. Once electro-activated, these solutions were combined with moderate heat treatments and nisin at different concentrations. The synergistic activity of all these factors (hurdles) was tested under model conditions and in a food matrix on the inactivation of Clostridium sporogenes PA 3679 spores, used as a non-pathogenic surrogate of Clostridium botulinum.
First, the selected aqueous solutions were electro-activated at different current intensities (100, 200, 300 and 400 mA) during one hour. For each type of solution, only solutions with the lowest pH and highest oxido-reduction potential (ORP) were selected to be used in the present study. After that, the selected electro-activated solutions were tested, alone and in combination with moderate heat treatments, for their inactivation effect towards C. sporogenes PA 3679 spores under model conditions (direct contact between the electro-activated solutions and the spores). The obtained results showed high effectiveness of these solutions and the detected sporicidal effect was validated by observation under transmission electron microscope. Finally, the efficacy of the combined treatments was tested against C. sporogenes PA 3679 spores
vi
in a green bean puree. The obtained results showed some buffering capacity induced by the organic matter of the puree which was able to significantly decrease the degree of inactivation of C. sporogenes PA 3679 spores compared to the effect we detected in the model conditions. The combination of nisin with the electro-activated solutions and moderate heat treatments was able to recover the initial sporicidal activity which was obtained under the model conditions. The final sporicidal activity detected was validated under transmission electron microscopy. Moreover, this study showed that when tested in intact stems of green beans, the sporicidal activity was very high. These results permitted to validate the protective effect induced by the bean puree to the C.
sporogenes PA 3679 spores.
In conclusion, two combinations that can be successfully used as effective hurdle were selected. The first one is a combination of an electro-activated potassium acetate solution under 400 mA during 60 min, nisin at a concentration of 1000 IU/mL and a moderate heat treatment of 95 °C applied during 15 minutes. The second hurdle consists of combining an electro-activated solution of potassium citrate under 400 mA during 60 min with 1000 IU/ ml of nisin and a heat treatment of 115 °C applied during 15 minutes. Thus, according to the obtained results, it can be suggested that under appropriate canning conditions, the process can be limited to the blanching step which be conducted at 95 °C.
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Table des matières
RÉSUMÉ ... III ABSTRACT ... V TABLE DES MATIÈRES ... VII LISTE DES TABLEAUX ... X LISTE DES FIGURES ... XI LISTE DES ANNEXES ... XIV LISTE DES ABRÉVIATIONS ... XV DÉDICACES ... XVII REMERCIEMENTS ... XVIII AVANT-PROPOS ... XX
INTROCUTION ... 1
CHAPITRE 1: REVUE DE LITTÉRATURE ... 3
1.1 CONSERVATION DES ALIMENTS ... 3
1.1.1 Histoire de la mise en conserve des aliments ... 3
1.1.2 Principe de conservation des aliments ... 4
1.1.3 Relation aliments-consommateurs ... 5
1.1.4 Problème rencontrés dans les boites de conserve ... 6
1.1.5 Méthodes de conservation classiques ... 27
1.2 MÉTHODES DE CONSERVATION ALTERNATIVES ET EFFET BARRIÈRE... 33
1.2.1 Principe de base de la technologie de barrière ... 35
1.2.2 Application des technologies de barrières ... 39
1.3 ÉLECTRO-ACTIVATION EN SOLUTION : MISE EN CONTEXTE GÉNÉRAL ... 45
1.3.1 Principes de base de l’électro-activation en solution ... 46
1.3.2 Application des solutions électro-activées (SEA) ... 48
CHAPITRE 2: PROBLÉMATIQUE, HYPOTHÈSES ET OBJECTIFS DE RECHERCHE ... 52
1.4 PROBLÉMATIQUE DE RECHERCHE ... 52
1.5 HYPOTHÈSES DE RECHERCHE ... 52
1.6 OBJECTIF GÉNÉRAL ... 53
1.7 OBJECTIFS SPÉCIFIQUES ... 53
CHAPITRE 3: ACIDIFICATION OF POTASSIUM ACETATE AND POTASSIUM CITRATE WITH/WITHOUT KCL BY ELECTRO-ACTIVATION AND IMPACT OF THE SOLUTION ON SPORES OF CLOSTRIDIUM SPOROGENES PA 3679 AT AMBIENT TEMPERATURE ... 54
viii
RÉSUMÉ ... 55
ABSTRACT ... 56
3.1. INTRODCUTION ... 57
3.2. MATERIALSANDMETHODS ... 59
3.2.1. Chemicals and materials ... 59
3.2.2. Electro-activation reactor and preparation of electro-activated solutions ... 59
3.2.3. Evaluation of the sporicidal effect of the electro-activated solutions ... 61
3.2.4. Statistical analysis: ... 62
3.3. RESULTSANDDISCUSSION ... 62
3.3.1. Effect of the electro-activation pH and ORP of the solutions ... 62
3.3.2. Effect of the activation intensity on the titratable acidity... 66
3.3.3. Effect of the electro-activated solutions on spores of C. sporogenes PA 3679 69 3.4. CONCLUSION... 74
CHAPITRE 4: APPLICATION OF ELECTRO-ACTIVATED POTASSIUM ACETATE AND POTASSIUM CITRATE SOLUTIONS COMBINED WITH MODERATE HEAT TREATMENT ON THE INACTIVATION OF CLOSTRIDIUM SPOROGENES PA 3679 SPORES ... 75
RÉSUMÉ ... 76
ABSTRACT ... 77
4.1. INTRODCUTION ... 78
4.2. 2.MATERIALSANDMETHODS ... 80
4.2.1. Spores production ... 80
4.2.2. Preparation of acidic electro-activated solutions (EAS) ... 81
4.2.3. Mixture preparation of electro-activated solutions (EAS) with spores... 81
4.2.4. Evaluation of the sporicidal effect of the EAS ... 82
4.2.5. Transmission electron microscopy of C. sporogenes spores ... 82
4.2.6. Measurement of spore structural components ... 82
4.2.7. Measurement of D-value... 83
4.2.8. Enumeration of survival spores ... 83
4.2.9. Statistical analysis ... 84
4.3. RESULTSANDDISCUSSION ... 84
4.3.1. Inactivation of C. sporogenes PA 3679 spores by EAS ... 84
4.3.2. Morphological analysis of treated C. sporogenes spores ... 88
4.4. CONCLUSION... 93
ix
CHAPITRE 5: EFFECT OF ELECTRO-ACTIVATED AQUEOUS SOLUTIONS, NISIN AND MODERATE HEAT TREATMENT ON THE INACTIVATION OF CLOSTRIDIUM SPOROGENES PA
3679 SPORES IN GREEN BEANS PUREE AND WHOLE STEMS... 95
RÉSUMÉ ... 96
ABSTRACT ... 97
5.1. INTRODUCTION ... 98
5.2. MATERIALSANDMETHODS ... 103
5.2.1. Production of spores of C. sporogenes PA 3679 ... 103
5.2.2. Nisin preparation ... 104
5.2.3. Electro-activated solutions preparation ... 104
5.2.4. Sample preparation and inoculation procedure... 105
5.2.5. Evaluation of the sporicidal effect of proposed hurdle technology in green beans puree and whole stems ... 105
5.2.6. Spores enumeration ... 106
5.2.7. Electron microscopy analysis... 107
5.2.8. Statistical analysis ... 107
5.3. RESULTSANDDISCUSSION ... 108
5.3.1. Sporicidal effect of electro-activated solution combined with temperature in green beans puree ... 108
5.3.2. Sporicidal effect of electro-activated solutions combined with temperature and nisin in green beans puree ... 112
5.3.3. Transmission electron microscopy (TEM) analysis ... 116
5.3.4. Evaluation of the hurdle concept with whole green bean stems ... 120
5.4. CONCLUSION... 123
5.5. ACKNOWLEDGMENTS ... 123
CHAPITRE 6 : CONCLUSION GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES ... 124
x
LISTE DES TABLEAUX
Table 1-1 : Composition nutritionnelle des légumes - valeur pour 100 g de produit. Reproduit de (Fabbri & Crosby, 2016). ... 7 Table 1-2: Pathogènes alimentaires inclus dans les systèmes de surveillance
nationaux. Reproduit de : (McCabe-Sellers & Beattie, 2004). ... 10 Table 1-3 : Classification des souches de Clostridium selon le type de neurotoxine. 11 Table 1-4: Épidémies de botulisme d'origine alimentaire associées à des souches de
C. botulinum. ... 13 Table 1-5: Poids sec initial (g/100 g) et teneur en caroténoïdes et en chlorophylle
(mg/100 g) de certains légumes crus. ... 32 Table 1-6 : Différents types de réponses homéostatiques de micro-organismes envers
divers facteurs de stress. ... 36 Table 1-7 : Différentes obstacles utilisés dans les industrie alimentaire. ... 38 Table 1-8 : Aperçu des différents types de produits alimentaires traités par la
technologie des barrières. ... 40 Table 3-1: Four electro-activator reactor design combination. ... 61 Table 4-1: Surviving populations of spores treated with electro-activated solutions
(EAS) combined with moderate heat treatment ant different exposure time. ... 85 Table 4-2: Comparison of structural component sizes of intact and heat-treated spores at 121 °°°°C during 5 min (negative control ``NC``) of C. sporogenes PA 3679. .. 89 Table 5-1: Surviving populations of C. sporogenes PA 3679 spores treated with EAS
xi
LISTE DES FIGURES
Figure 1-1: Facteurs contribuant aux épidémies d'origine alimentaire de 1993 à 1997. ... 9 Figure 1-2: Principaux causes des maladies alimentaires. ... 9 Figure 1-3 : Micrographe pris par microscopie électronique à balayage des cellules
végétatives de C. botulinum. ... 12 Figure 1-4: Structure et composition d’une spore de C. botulinum (Setlow, 2006a).. 14 Figure 1-5: Micrographe d’une spore de Clostridium sporogenes pris par microscopie
électronique à transmission. ... 15 Figure 1-6: Structure de l'acide dipicolinique. ... 17 Figure 1-7: Modèle de transmission de E. coli O157: H7 à l'humain (Gansheroff &
O'Brien, 2000). ... 20 Figure 1-8: Schéma de la pathogenèse de salmonella. ... 23 Figure 1-9: Apport moyen habituel, au Canada, en sodium pour divers groupes d'âges
et de sexes. AMT (apport maximal tolérable); AS (apport suffisant). ... 27 Figure 1-10: Techniques traditionnelles de transformation des aliments utilisées
principalement dans les industries alimentaires. Reproduit de : (Khan, Tango, Miskeen, Lee, & Oh, 2017). ... 29 Figure 1-11: Nouvelles techniques de transformation alimentaire adoptées récemment par l'industrie alimentaire. Reproduit de : (Khan et al., 2017). ... 34 Figure 1-12 : Exemple de technologie de barrière. Tratitement thermique (t); Activité
de l'eau (aw); pH; Potentiel redox (Eh); Agent de preservation (pres). ... 35 Figure 1-13: Structure de la nisine. Aba: acide aminobutyrique; Dha:
déshydroalanine; Dhb: déshydrobutyrine (β-méthyldéhydroalanine); Ala-S-Ala: lanthionine; Aba-S-Ala: β-méthylanthionine. ... 43 Figure 1-14: Représentation schématique d’un réacteur d'électro-activation. AEM:
Membrane échangeuse d'anions. CEM: Membrane échangeuse de cations. A: Ampèremètre. DC: Source de courant continu. ... 47
xii
Figure 3-1: Schematic representation of the electro-activation reactor. AEM: Anion exchange membrane. CEM: Cation exchange membrane. A: Ammeter. DC: Direct current source. ... 60 Figure 3-2: Influence of time and intensity activation on the pH and the ORP of the
electro-activated solutions of potassium citrate at 0.0625 M. ... 65 Figure 3-3: Variation of percentage of formed acid (%) as a function of the activation
intensity (mA) of four activated solutions. ... 67 Figure 3-4: Destruction level of spores treated with activated aqueous solutions
produced at 400 mA for 60 min. ... 70 Figure 3.5: Transmission electron micrographs of sectioned spores of C. sporogenes
PA 3679 at 12,000 magnification. Micrographs of intact spores (a), spores treated with activated potassium acetate (5 min) (b, c, d, e), spores treated with activated potassium acetate + KCl. ... 73 Figure 4-1: Survival curves of C. sporogenes PA 3679 spores in 0.1 % peptone water
with thermal treatment at different times. ... 88 Figure 4-2: Transmission electron micrographs of sectioned spores of C. sporogenes
PA 3679 at 12,000 magnification. A: micrographs of intact spores (a) and heat inactivated spores (b). B: micrographs of spores treated with activated potassium acetate (a), activated potassium acetate combined with heat treatment (95 °C, 5 min) (b), activated potassium acetate + KCl (c) and activated potassium acetate + KCl combined with heat treatment (95 °C, 20 min) (d). Same micrographs were observed in spores treated with activated potassium citrate (e), activated potassium citrate combined with heat treatment (95 °C, 5 min) (f), activated potassium citrate + KCl (g) and activated potassium citrate + KCl combined with heat treatment (95 °C, 20 min) (h). ... 91 Figure 5-1: Inactivation level of C. sporogenes PA 3679 spores by hurdle technology
design constituted by electro-activated potassium acetate (APA), heat treatment and nisin solution. ... 113 Figure 5-2: Inactivation level of C. sporogenes PA 3679 spores by hurdle technology
design constituted by electro-activated potassium citrate (APC), heat treatment of 95℃ and nisin solution. ... 115
xiii
Figure 5-3: Inactivation level of C. sporogenes PA 3679 spores by hurdle technology design .constituted by electro-activated potassium citrate (APC), heat treatment of 105 and 115℃ and nisin solution. ... 116 Figure 5-4: Transmission electron micrographs of sectioned spores of C. sporogenes
PA 3679. (A): Micrographs of intact spores (a), and heat inactivated spores at 121°°°°C for 15 min (b). (B) Micrographs of spores treated with electro-activated potassium acetate (a), electro-activated potassium citrate (b), and nisin solution at 1000 IU/mL (c). Same micrographs were observed in spores treated with a combination of electro-activated potassium acetate, nisin solution and heat treatment at 95°°°°C for 5 min (d), a combination of electro-activated potassium citrate, nisin solution and heat treatment at 95°°°°C for 5 min (e), and spores treated with a moderate heat treatment (95°°°°C, 5 min) (h). ... 118 Figure 5-5: Comparison of the spore inactivation level of two combined treatment in
green beans puree and intact stem of beans. Electro-activated potassium acetate (APA), electro-activated potassium citrate (APC). ... 121 Figure 5-6: Transmission electron micrographs of sectioned spores of C. sporogenes
PA 3679 treated by a combination of electro-activated potassium acetate, heat treatment of 95°°°°C for 15 min and 1000 IU/ml of nisin. Micrographs of spores treated in puree sample (a) and micrographs of spores treated in intact stem of beans (b). ... 122
xiv
LISTE DES ANNEXES
Annexe 1: Micrographe d’une spore de Clostridium sporogenes PA 3679, traitée à
121℃ pendant 15 min, pris par microscopie électronique à transmission. ... 147
Annexe 2: Micrographe d’une spore intacte de Clostridium sporogenes PA 3679 pris
par microscopie électronique à transmission. ... 148
Annexe 3: Micrographe des spores de Clostridium sporogenes PA 3679, ayant subis
un traitement thermique à 95℃ pendant 5 min, pris par microscopie électronique à transmission. ... 149
Annexe 4: Micrographe d’une spore de Clostridium sporogenes PA 3679, traitée par
une solution d’acétate de potassium électro-activée à 400 mA pendant 60 min, pris par microscopie électronique à transmission. ... 150
Annexe 5: Micrographe d’une spore de Clostridium sporogenes PA 3679, traitée par
une solution de citrate de potassium électro-activée à 400 mA pendant 60 min, pris par microscopie électronique à transmission. ... 151
Annexe 6: Spores + nisine_ Micrographe d’une spore de Clostridium sporogenes PA
3679, traitée par une solution de nisine à 1000 IU/mL, pris par microscopie électronique à transmission. ... 152
Annexe 7: Micrographe montrant l’effet synergique d’inactivation d’une spore de
Clostridium sporogenes PA 3679, par une combinaison de traitement (une solution d’acétate de potassium électro-activée à 400 mA pendant 60 min, une solution de nisine à 1000 UI/mL et un traitement thermique modéré de 95 ℃ pendant 5 min) pris par microscopie électronique à transmission. ... 153
Annexe 8: Spores + CK + nisine + 95
°C_ Micrographe montrant l’effet synergique
d’inactivation d’une spore de Clostridium sporogenes PA 3679, par unecombinaison de traitement (une solution de citrate de potassium électro-activée à 400 mA pendant 60 min, une solution de nisine à 1000 UI/mL et un traitement thermique modéré de 95 ℃ pendant 5 min) pris par microscopie électronique à transmission. ... 154
xv
LISTE DES ABRÉVIATIONS
AMT Apport Maximale Tolérable Maximum Tolerable Intake APA Acétate de Potassium
Électro-Activée Electro-Activated Potassium Acetate
APC Citrate de Potassium
Électro-Activée Electro-Activated Potassium Citrate
AQ Aqueuse Aqueous
AS Apport Suffisant Sufficient Intake
Aw Activité De L’eau Water Activity
BHI Infusion Brain Heart Brain Heart Infusion BoNT Neurotoxines Botulinique Botulinum Neurotoxins CFU (UFC) Unité Formatrice de Colonie Colony Forming Unit
CMI Concentration minimal
inhibitrice Minimal inhibitory concentration
DPA Acide Dipicolinique Dipicolinic Acid
e- Électron Electron
EA Électro-Activation Electro-Activation
EH Potentiel Rédox Redox Potential
G Gaz Gas
HPP Pression Hydrostatique Élevées High Hydrostatic Pressure
IU Unité Internationale International Unit
L Liquide Liquid
Mg Milligramme Milligram
Mg/j Milligramme par jour Milligram per day
mL Millilitre Milliliter
NC Contrôle Négative Negative Control
PC Contrôle Positive Positive Control
xvi
PRES Agent de Conservation Preservative
TWH Tétrawattheures Tetrawatt Hours
SD Écart Type Standard Deviation
SE (ES) Solutions Élecro-lysées Electrolyzed Solutions SEA (EAS) Solutions Électro-Activées Electro-Activated Solutions TEM Microscope Électronique À
xvii
Dédicaces
xviii
REMERCIEMENTS
La présente étude n’aurait pas été possible sans le bienveillant soutien de certaines personnes. Et je ne suis pas non plus capable de dire dans les mots qui conviennent, le rôle qu’elles ont pu jouer à mes côtés pour en arriver là. Cependant, je voudrais les prier d’accueillir ici tous mes sentiments de gratitude qui viennent du fond de mon cœur, en acceptant mes remerciements.
J’adresse mes sincères remerciements à mon directeur de recherche, le professeur Mohammed Aider, de m’avoir accueilli dans son équipe et permis de réaliser cette thèse dans d’excellentes conditions financières. Je le suis reconnaissant pour le temps qu'il m'a sacrifié, ses qualités pédagogiques et scientifiques ainsi que sa franchise et sa sympathie. Je te remercie grandement pour l'aide que tu m'as apportée pour finir ce travail pénible. Avec toi, tout semble plus facile. J'ai beaucoup appris à tes côtés et j’adresse pour vous toute ma gratitude.
Je tiens à remercier mon codirecteur, le professeur Ismail Fliss, pour sa contribution appréciable dans ma thèse, pour toutes nos réunions fructueuses et pour tous les conseils qui ont contribué à la réalisation de cette thèse.
Je remercie également tous les professionnels de recherche et mes collègues sans qui mon travail n'aurait eu aucune chance d'être mis en œuvre. Merci pour votre aide. Une chose est sure, je n'aurais rien pu faire sans vous tous. Merci pour : Riadh Hammami, Benoit Fernandez, Marine Béguin, Diane Gagnon, Alseny Balde et Ourdia Kareb.
Je tiens aussi à remercier monsieur Richard Janvier pour ses conseils et sa disponibilité qui m’ont permis d’apprendre la microscopie électronique à transmission. A travers l’océan, je tiens à remercier monsieur Monzer Hamze, professeur de l’Université Libanaise pour ses encouragements et son sens de l’humour légendaire.
En premier lieu, je veux remercier ma merveilleuse, splendide et vertueuse épouse Rana. Ton aide à ce moment si particulier de ma vie est un véritable cadeau. Mon cœur t'en est profondément reconnaissant. Être là, présent et m'écouter...une petite chose pour toi mais crois-moi tu m'as énormément aidé et j'apprécie de tout mon cœur ton soutien. Merci pour notre meilleur cadeau de vie, mon petit bébé Amir.
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Mes plus profonds remerciements vont à mes parents. Tout au long de mon doctorat, ils m’ont toujours soutenu, encouragé et aidé. Ils ont su me donner toutes les chances pour réussir. Qu’ils trouvent, dans la réalisation de ce travail, l’aboutissement de leurs efforts ainsi que l’expression de ma plus affectueuse gratitude.
Ce projet de doctorat a été rendu possible grâce au soutien financier du
Programme de recherche en partenariat sur la préservation et l'amélioration de la valeur nutritive des aliments en lien avec la santé.
Partenaires : Fondation des maladies du cœur Québec et Visez santé. Ministère de l’Agriculture, des Pêcheries et de l’Alimentation du Québec. Ministère de la Santé et des Services sociaux. Fonds de recherche du Québec – Nature et technologies. Fonds de la recherche en santé du Québec.
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AVANT-PROPOS
Cette thèse a été soumise à la Faculté des études supérieures et postdoctorales (FESP) de l'Université Laval pour satisfaire aux exigences de l'obtention du grade de Ph. D. en Sciences et technologie des aliments (STA) de la Faculté des sciences de l’agriculture et de l'alimentation (FSAA) de l’Université Laval. Elle est composée de six chapitres; parmi lesquels trois sont présentés sous forme d'articles scientifiques, soumis ou publiés dans des revues internationales avec comité de lecture, contenant la méthodologie et les résultats obtenus lors de la réalisation du présent projet de doctorat.
Le premier chapitre est une revue de littérature détaillée portant sur les inconvénients associés aux méthodes actuelles de mise en conserve des aliments tout en mettant l’accent sur l’importance du recours vers de nouvelles alternatives de conservation des aliments. Ce chapitre traite également du principe de l’effet barrière appliqué à la conservation des aliments. Le rôle de l’électro-activation en solution dans les technologies émergentes de conservation a fait aussi l’objet de ce premier chapitre.
Le deuxième chapitre est consacré pour énoncer les hypothèses de recherche en lien avec la problématique traitée dans ce projet de doctorat, l’objectif principal du projet et les objectifs spécifiques en lien avec chaque volet du projet.
Le troisième chapitre est dédié à premier objectif spécifique du présent projet et a été présenté sous forme d’un article scientifique intitulé ``Acidification of potassium acetate and potassium citrate with/without KCl by electro activation and impact of the solution on spores of Clostridium sporogenes PA 3679 at ambient temperature``. Le candidat a réalisé l’ensemble des expériences, le traitement des résultats et a rédigé l’article. La contribution du directeur de recherche à ce travail est hautement significative tant au niveau de la planification du travail, de la discussion des résultats et du processus de publication de l’article. Cet article a fait l’objet d’une publication dans ``LWT-Food Science and Technology`` dont la référence est : El Jaam, O., Fliss, I., Ben-Ounis, W., & Aïder, M. (2017). Acidification of potassium acetate and potassium citrate with/without KCl by electro-activation and impact of the solution on spores of Clostridium sporogenes PA 3679 at ambient temperature. LWT - Food
xxi
Le quatrième chapitre est dédié au deuxième objectif spécifique de ce projet et est intitulé ``Application of electro-activated potassium acetate and potassium citrate solutions combined with moderate heat treatment on the inactivation of Clostridium
sporogenes PA 3679 spores``. Le candidat a réalisé l’ensemble des expériences, le traitement des résultats et a rédigé l’article. La contribution du directeur de recherche à ce travail est hautement significative. L’article a été publié dans ``Innovative Food
Science & Emerging Technologies`` avec la référence suivant : El Jaam, O., Fliss, I., & Aider, M. (2016). Application of electro-activated potassium acetate and potassium citrate solutions combined with moderate heat treatment on the inactivation of Clostridium sporogenes PA 3679 spores. Innovative Food Science & Emerging
Technologies, 33, 483-488.
Le cinquième chapitre est dédié au troisième objectif spécifique du projet et est intitulé ``Effect of electro-activated aqueous solutions, nisin and moderate heat treatment on the inactivation of Clostridium sporogenes PA 3679 spores in green beans puree and whole stems``. Le candidat a réalisé l’ensemble des expériences, le traitement des résultats et a rédigé l’article. La contribution du directeur de recherche à ce travail est hautement significative. L’article est soumis pour publication dans ``Anaerobe``. Auteurs : Omar El Jaam, Ismail Fliss et Mohammed Aïder.
Le sixième chapitre est une conclusion générale avec des recommandations spécifiques pour une meilleure valorisation des résultats obtenus dans cette thèse de doctorat. En se basant sur les résultats obtenus, il est évident que l’hypothèse de recherche énoncée au début de ce projet est confirmée.
Finalement, une liste complète des références utilisées pour la réalisation de cette thèse de doctorat est dressée à la fin du document. Toutes les références utilisées dans chaque chapitre sont regroupées dans la présente section.
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INTROCUTION
La conservation des légumes est nécessaire pour assurer la continuité de l’approvisionnement. Différentes bactéries sont à l’origine de la détérioration des conserves alimentaires et de maladies graves d’origine alimentaires. Parmi ces bactéries, on trouve Clostridium botulinum (C. botulinum), une bactérie productrice de spores et à anaérobie stricte. La capacité de C. botulinum à croître dans les aliments est fortement influencée par la présence d'oxygène, les traitements thermiques appliqués lors de la fabrication des conserves (la stérilisation) et à la présence d’autres barrières de conservation comme l’acidité et différents agents de conservation. Les spores de C.
botulinum sont hautement résistantes à la chaleur. Elles peuvent survivre dans les aliments traités thermiquement et peuvent aussi germer et se développer dans des emballages fermés où les conditions d’anaérobioses s’appliquent. En raison de leur grande résistance thermique, le processus d’élimination des spores nécessite un traitement thermique élevé avec une température de références de 121 °C. Pour les aliments peu acides, qui sont propices au développement de spores de C. botulinum, le procédé de conservation le plus couramment utilisé est le 12-D (réduction décimale de 12 Log) qui, généralement, satisfait l'exigence de santé publique en lien avec la salubrité des aliments. Cependant, les traitements thermiques élevés sont à l’origine de la détérioration de la valeur nutritive (vitamines, anthocyanes, etc.) et des propriétés sensorielles (couleur, arôme et changements de texture) des aliments.
Dans certains produits, le chlorure de sodium (sel de table) est utilisé pour deux objectifs; à savoir son action comme agent de conservation et son action pour accentuer le goût du produit. Ainsi, beaucoup d’aliments transformés (conservés) sont une source potentielle de sodium qui est devenu une préoccupation majeure de la santé publique. En effet, les problèmes de santé liés à la consommation excessive de sodium, comme l’hypertension artérielle, les maladies cardiovasculaires et l’asthme, ont forcé les pays développés à promulguer des règlementations qui obligent les industries alimentaires à réduire ou minimiser l’utilisation du sodium lors de la transformation des aliments. Durant les dernières décennies, la tendance des consommateurs se dirige de plus en plus vers la consommation d’aliments peu transformés, salubres et de haute valeur
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nutritive et organoleptique. Ainsi, afin de répondre aux exigences des consommateurs, les industries alimentaires cherchent de nouvelles alternatives de conservation des aliments visant à minimiser l’utilisation du sodium sans compromettre la salubrité des produits. Dans ce contexte, l’approche privilégiée est basée sur l'application simultanée et synergique de différents traitements de conservation de faibles intensités, communément appelée l'effet barrière. Bien que chaque traitement soit à lui seul insuffisant pour stabiliser le produit, la résultante d’une combinaison de plusieurs barrières aide à produire des aliments salubres sans affecter leur valeur nutritive.
L’électro-activation de certaines solutions aqueuses exemptes de sodium permet de produire des solutions anolytes ayant un pouvoir antibactérien très élevé grâce à leur potentiel Redox élevé (POR), pH acide et teneur en O2 du milieu supérieure aux saumures traditionnelles. L’utilisation de solutions électro-activées est apparue comme une voie prometteuse pouvant être incluse dans les technologies de barrières afin de stabiliser les légumes en conserve. Dans la présente thèse de doctorat, l’effet synergique de la combinaison des solutions électro-activées d’acétate et de citrate de potassium, avec ou sans ajout de KCl, de la nisine et de traitements thermiques modérés a été étudié pour évaluer son effet d'inactivation des spores de C. sporogenes PA 3679, un substitut non pathogène de C. botulinum. Les expériences ont été réalisées dans des conditions modèles, dans une purée des haricots verts et dans des contenants avec des tiges intactes des haricots verts. La conformité des résultats a été validée par des méthodes microbiologiques et par observation en microscopie électronique à transmission.
L’objectif principal de ce travail est d’étudier et comprendre les mécanismes d’action de solutions aqueuses électro-activées, combinées avec de la nisine et des traitements thermiques modérés, sur l’inactivation des spores de C. sporogenes PA 3679.
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Chapitre 1: Revue de littérature
1.1 Conservation des aliments
1.1.1 Histoire de la mise en conserve des aliments
Les XVIe et XVIIe siècles ont été un moment de grand progrès scientifiques dans les domaines de la chimie, des mathématiques et de la physique. Cela a été connu comme la révolution scientifique, une période où la science est devenue populaire avec la personne ordinaire devenue de plus en plus lettrée (Featherstone, 2012). En 1795, un défi pour le gouvernement français était de trouver un moyen pour combattre les maladies résultantes de la malnutrition. Ils ont offert un prix de 12000 francs français à toute personne qui pourrait trouver un moyen de conserver en toute sécurité la nourriture (Featherstone, 2012). Cette offre a attiré l’attention de Nicolas Appert, un inventeur scientifique français. En 1810, Nicolas Appert, nommé le père de conservation, a présenté avec succès une variété de produits alimentaires conservés par traitement thermiques dans des bocaux en verre (Stumbo, 1965). Nicolas Appert a rédigé un livre portant sur les détails du processus de conservation des aliments tels qu’ils sont encore les même aujourd’hui. Il a décrit le processus de la manière suivante: ``Mettre les aliments à conserver dans des bouteilles, boucher les bouteilles
soigneusement, faire bouillir les bouteilles dans l'eau pendant une période de temps (dépendamment des aliments) et enfin retirer les bouteilles et les refroidir`` (Featherstone, 2012). En examinant ce concept décrit par Nicolas Appert, on s’aperçoit que, sur le fond, la technique de conservation des aliments est restée la même.
Bien que la méthode de conservation des aliments proposée par Nicoals Appert a fonctionné, personne à l'époque ne comprenait pourquoi. Appert pensait que c'était dû au chauffage et à l'exclusion de l'air. En effet, à cette époque, les gens croyaient que l'air lui-même était la cause de la détérioration des aliments (Featherstone, 2012; Lopez, 1987). C’est en 1862 que Louis Pasteur a prouvé, par démonstration expérimentale scientifique, que la fermentation est causée par la croissance de micro-organismes et non pas par une simple exposition à l'air (Lopez, 1987). En 1870, Pasteur préconise que le public avait le droit de savoir ce qui est mis dans l'aliment et il a
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déclaré que tous les additifs doivent être déclarés sur l'étiquette. Ainsi, le lien entre la détérioration des aliments et les maladies qui y sont associées était mis en relation directe avec la croissance et l’activité de microorganismes, ouvrant ainsi la voie sur une nouvelle discipline scientifique, la microbiologie industrielle.
1.1.2 Principe de conservation des aliments
Au cours des dernières années, de nombreuses crises d'approvisionnement alimentaire telles que la maladie de la vache folle, l'épidémie de la fièvre aphteuse et le scandale de la dioxine en Belgique ont suscité chez les consommateurs une inquiétude généralisée quant à la qualité des aliments qu'ils consomment (Miles & Frewer, 2001). De nos jours, l'accent est mis de plus en plus sur la compréhension des motivations des consommateurs pour le choix des produits alimentaires (Chen, 2007). Toutefois, il existe de nombreuses contributions scientifiques qui ont traité les comportements liés à l'achat des produits alimentaires. Parmi ces comportements, il existe l’origine, en terme de culture et d’environnement, ainsi que la sécurité alimentaire, y compris les aspects nutritionnels (Alessandro & Luisa, 2014). Les aliments sont une excellente source de nutriments pour les microorganismes, non pathogènes et, parfois, pathogènes. Les organismes pathogènes sont un groupe important dont les manipulateurs, les transformateurs, les inspecteurs et les consommateurs sont préoccupés par le fait qu'ils peuvent causer différentes intoxications alimentaires allant d’un simple malaise jusqu’à l’effet létal. Cependant, d'autres micro-organismes sont tout aussi importants en raison de leur potentiel de détérioration (Torres, Rodrigo, & Martínez, 2016).
La transformation des aliments comprend toutes les activités qui contrôlent la nourriture entre sa production et sa consommation finale. Ainsi, ce cycle inclut le transport des matières premières, leur stockage, la transformation et la fabrication du produit final (Earle & Earle, 2008). La conservation des aliments vise à préserver leur comestibilité et leurs propriétés gustatives et nutritives. Elle consiste aussi à mettre les microorganismes dans un environnement hostile, afin d'inhiber leur croissance, de raccourcir leur survie ou de provoquer leur mort (Lothar Leistner, 2000). Aussi, la conservation des aliments implique, notamment, une action visant à empêcher la
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croissance de micro-organismes et de retarder l’oxydation des graisses qui provoque le rancissement. Bien que les deux principales causes de détérioration des aliments puissent être d’origines microbiennes ou enzymatiques, les aliments sont détériorés plus souvent par les microorganismes que par tout autre facteur. Les micro-organismes causant la détérioration des aliments sont les bactéries, les levures et les moisissures. Les micro-organismes utilisent les nutriments des aliments pour maintenir leurs processus de vie et, par conséquent, provoquent la détérioration des aliments par l’effet de leurs métabolites (Torres et al., 2016).
Pour ce qui est des méthodes de conservation alimentaire, elles reposent principalement sur un transfert d’énergie ou de masse afin d’allonger la durée de vie des produits alimentaires. On utilise différentes techniques comme la pasteurisation, la stérilisation, la réfrigération et la congélation. La conservation des aliments est également basée sur d’autres principes utilisant des réactions biochimiques ou des changements d'état comme la cuisson, la fermentation ou la conversion du produit vers un état cristallin (sucre) ou vitreux (caramel). Dans ces cas, c’est principalement l’activité de l’eau (aw) du produit qui est significativement réduite.
1.1.3 Relation aliments-consommateurs
L’aliment est un besoin fondamental pour la vie. Le développement des méthodes de conservation a contribué à la production d’aliments pour un approvisionnement continu au niveau mondial et en assurer une sécurité alimentaire adéquate. Cependant, la sécurité alimentaire ne peut pas être garantie uniquement par l’augmentation de la production. L’innocuité (salubrité) de ceux-ci est également un élément primordial à la garantie de la sécurité alimentaire (Boekel, Hounhouigan, & Nout, 2003). Les exigences des consommateurs sont de plus en plus orientées vers des aliments de haute qualité, peu transformés, nutritifs et frais (Gao & Ju, 2008). Il est alors important de développer des connaissances, du savoir-faire technologique et des infrastructures industrielles adéquats pour satisfaire la demande d’aliments de haute qualité (Boekel et al., 2003).
Les fruits et les légumes sont des composantes essentielles de l'alimentation humaine vu leurs avantages sanitaires et nutritionnels associés à leur consommation.
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Au Canada, aux États-Unis, en Nouvelle-Zélande, ainsi que dans plusieurs États membres de l'Union européenne, les établissements de santé publique ont lancé des campagnes recommandant la consommation quotidienne d'au moins cinq portions de fruits et légumes (Abadias, Usall, Anguera, Solsona, & Viñas, 2008). Cela a abouti à des changements significatifs dans le mode de vie des populations et des changements majeurs dans les tendances de la consommation. Comme conséquences, les gens consacrent moins de temps à cuisiner à la maison et à manger plus souvent des aliments transformés industriellement. Ces tendances se sont traduites par l'apparition d’aliments minimalement transformés qui sont prêts à manger (Abadias et al., 2008; Chaves et al., 2016). Cependant, il n’est pas rare de trouver que la salubrité de ces aliments transformés est assurée par l’ajout de différents agents de conservation et/ou de quantités considérables de sel, contribuant ainsi à augmenter l’apport quotidien des aliments en sodium. Ainsi, il est toujours d’actualité de développer des technologies de préservation des aliments qui permettent de garantir un haut standard de salubrité sans aucun compromis sur la qualité, tant nutritionnelle qu’organoleptique.
1.1.4 Problème rencontrés dans les boites de conserve
Les légumes et les fruits en conserve sont omniprésents dans l’approvisionnement alimentaire et constituent un élément essentiel de la chaîne alimentaire. Sur le plan nutritionnel, les légumineuses fournissent une proportion élevée de protéines, glucides, gras, fibres alimentaires, vitamines du groupe B (thiamine, riboflavine, niacine) et minéraux (Prodanov, Sierra, & Vidal-Valverde, 2004). Toutefois, cette contribution (composition) peut varier selon le cultivar, l'emplacement de la croissance, le climat, les facteurs environnementaux et le type de sol dans lequel les légumineuses sont cultivées (Bishnoi & Khetarpaul, 1993). La valeur nutritionnelle est également dépendante du type de procédé utilisé pour la mise en conserve ou la transformation. Par exemple, les pois et les haricots sont des légumineuses hautement riches en amidon, protéines et minéraux. La composition nutritionnelle des légumes est résumée dans le Tableau 1-1 (Fabbri & Crosby, 2016).
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Table 1-1 : Composition nutritionnelle des légumes - valeur pour 100 g de produit.
Reproduit de (Fabbri & Crosby, 2016).
Nutriments Unité Haricot rouge Pois Pomme de terre Composition approximative Eau g 62.95 77.87 77.46 Protéines 9.01 5.36 1.71 Totale lipides 0.65 0.22 0.1 Minéraux Calcium, Ca mg 46 27 8 Fer, Fe 2.09 1.54 0.31 Magnésium, Mg 50 39 20 Potassium, K 436 271 328 Sodium, Na 1 3 5 Vitamines C mg 0.8 14.2 7.4 B6 0.054 0.216 0.269 B12 µg 0 0 0 K 0.35 25.9 2.1 D IU 0 0 0 Lipides
Acides gras saturés
g
0.136 0.039 0.026
Acides gras mono
insaturés 0.133 0.019 0.002
Acides gras
polyinsaturés 0.235 0.102 0.043
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Afin de maintenir une bonne santé, les lignes directrices diététiques pour les Américains (DGA 2010) recommandent un maintien d’équilibre calorique dans les aliments consommés. La DGA recommande également une consommation accrue d'aliments et de boissons riches en nutriments (comme les légumes, les fruits, les céréales complètes, les produits laitiers à faible teneur ou sans gras, les protéines maigres, les œufs, les haricots et les pois, les noix et les graines) tout en limitant la consommation des aliments qui fournissent une teneur élevée en sodium, graisses solides et sucres ajoutés (DGA, 2010).
De par leur contact direct avec le sol, les légumes sont potentiellement contaminés par C. botulinum. Meyer et Dubovsky (1922) ont trouvé que 6 à 33% des échantillons de légumes et fruits sont positifs pour les spores de C. botulinum (Meyer & Dubovsky, 1922). Selon le Centers for Disease Control and Prevention (CDC), environ 76 millions de personnes tombent malades aux États-Unis chaque année à cause d’intoxications alimentaires de différentes sévérités. Les micro-organismes responsables sont appelés agents pathogènes et les produits toxiques qu'ils produisent sont appelés toxines. Ces intoxications se caractérisent par l’apparition de symptômes pouvant induire des complications sévères chez l’hôte (Emmeluth, 2010). Dans ce sens,
Clostridium botulinum est l’un des pathogènes les plus redoutables (Leclair et al., 2013). La Figure 1-1 montre les facteurs contribuant aux épidémies d'origine alimentaire répertoriées de 1993 à 1997 (McCabe-Sellers & Beattie, 2004). En se basant sur les données de cette figure, il apparaît clair que les échecs dans les comportements critiques conduisent à l'incidence des maladies liées à l'alimentation et que ces incidences sont dues à un échec dans la façon de :
manutentionner et refroidir les aliments de façon appropriée, pratiquer une hygiène personnelle appropriée,
prévenir la contamination croisée,
cuire les aliments à des températures internes appropriées, procurer de la nourriture à partir de sources sûres.
Les principales causes des maladies liées aux aliments sont présentées dans la Figure
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Figure 1-1: Facteurs contribuant aux épidémies d'origine alimentaire de
1993 à 1997.
Figure 1-2: Principaux causes des maladies alimentaires.
1.1.4.1 Principaux contaminants microbiologiques des conserves alimentaires
Les produits frais peuvent être un vecteur de transmission d’agents pathogènes qui sont capables de causer des maladies aux humains (Abadias et al., 2008). Il est également important de noter que les incidences des cas d’intoxications alimentaire, causées par des fruits et légumes frais contaminés, a augmenté ces dernières années d’une manière assez importante (Mukherjee, Speh, Jones, Buesing, & Diez-Gonzalez,
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2006). Dans les produits alimentaires, les agents pathogènes les plus fréquemment rencontrés sont du genre de Clostridium, Salmonella, Escherichia coli, Listeria et
Campylobacter. Le Tableau 1-2 illustre les agents pathogènes souvent impliqués dans des intoxications alimentaires et qui sont inclus dans les systèmes de surveillance nationaux (McCabe-Sellers & Beattie, 2004).
Table 1-2: Pathogènes alimentaires inclus dans les systèmes de surveillance nationaux.
Reproduit de : (McCabe-Sellers & Beattie, 2004).
Système national de surveillance des maladies à déclaration obligatoire Maladie Agents pathogènes
Botulisme Toxine de Clostridium botulinum
Brucellose Brucella abortus
Cholera Vibrio cholerae
Entérohémorragique E. coli (EHEC) E. coli O157 :H7 Syndrome hémolytique urémique E. coli O157 :H7
Listériose Listeria monocytogenes
Salmonellose Sérotypes de Salmonella
Shigellose Espèce de Shigella
Réseau de surveillance active des maladies d'origine alimentaire (Foodnet)
Bactérie Parasites E. coli O157 :H7 Cryptosporidium parvum Cyclospora cayetanensis Camplylobacter L. monocytogenes Salmonella Shigella Vibrio parahaemolyticus Yersinia enterocolitica
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1.1.4.1.1 Clostridium botulinum
Clostridium botulinum, une bactérie bacille à Gram positive, sporulante pathogène anaérobique, responsable de graves intoxications alimentaires associées à des viandes, poissons, légumes et produits laitiers. Cette bactérie peut se développer et produire une toxine mortelle connue comme toxine botulique. Cette toxine est stable dans les aliments sur une longue période. C. botulinum se décompose en quatre groupes (I-IV) avec diverses caractéristiques physiologiques et génétiques. La toxine botulique est retrouvée dans les aliments ayant subi un traitement thermique insuffisant ou dans des conserves tels que les légumes, les viandes et les fruits de mer (Bhattacharya, 2014; Zhang, Sun, & Nie, 2010). Afin d’assurer un traitement thermique efficace, les barèmes utilisés doivent être valides pour vérifier que le taux de destruction attendu est effectif (Gao & Ju, 2008). Sept types (A, B, C, D, E, F et G) de toxines sont produits par C.
botulinum. Les types A, B et E sont les principales causes des toxi-infections chez l'humain. Le botulisme causé par les toxines de type A ou B est associé à la consommation des légumes, fruits et viandes en conserve. Par contre, le botulisme causé par la toxine de type E est associé aux poissons et divers produits marins (Odlaug & Pflug, 1987; Zhang et al., 2010). Au Canada, durant la période de 1985-2005, un total de 91 foyers de botulisme alimentaire ont été confirmés, dont 11 décès. Parmi ces foyers, 86,2 % ont été causés par la toxine de type E, 8,1% par le type A et 5,7% par le type B (Leclair et al., 2013). Le Tableau 1-3 montre les souches de C. botulinum produisant des neurotoxines (Peck, 2006).
Table 1-3 : Classification des souches de Clostridium selon le type de neurotoxine.
Clostridium Neurotoxine
C. botulinum group I (proteolytique) A, B, F
C. botulinum group II (nonproteolytique) B, E, F
C. botulinum group III C, D
C. botulinum group IV (Cl. argentinense) G
C. baratii (souche neurotoxigenique) F
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Les principaux facteurs limitants la croissance de C. botulinum dans les aliments sont: la température, le pH, l'activité de l'eau, le potentiel d'oxydo-réduction, les agents de conservation et les micro-organismes compétitifs. Tous ces facteurs sont interdépendants, ainsi une variation d'un facteur influence l'effet des autres. D’ailleurs, les interactions entre ces facteurs peuvent avoir un effet positif ou négatif sur l'inhibition de C. botulinum (Gombas, 1993). Ainsi, C. botulinum ne peut pas croître à un pH < 4,5 (aliments acides et acidifiés). Aussi, comme C. botulinum est une bactérie sporulante, les spores sont largement distribuées dans l'environnement et par conséquent elles ont été isolées à partir d'une grande variété d'aliments. Dans un environnement favorable, les spores de C. botulinum peuvent germer et se développer, conduisant ainsi à la formation de toxines qui peuvent être ingérées avec les aliments contaminés, aboutissant à une intoxication alimentaire pouvant être mortelle (Linton, Connolly, Houston, & Patterson, 2014). La production des toxines est influencée par des facteurs intrinsèques comme le pH, l’activité de l’eau (aw) et la concentration en NaCl ajouté, ainsi que par des facteurs extrinsèques comme la température et l’atmosphère du milieu; en l’occurrence la présence d’oxygène (Peck, 1997). La
Figure 1-3 montre une image de microscopie électronique à balayage de cellules
végétatives de C. botulinum (Skarin, 2015). Quelques épidémies de botulisme d'origine alimentaire, associées à des souches de C. botulinum, sont également présentées dans le Tableau 1-4.
Figure 1-3 : Micrographe pris par microscopie électronique à balayage des cellules
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Table 1-4: Épidémies de botulisme d'origine alimentaire associées à des souches de C.
botulinum.
Pays Année Neurotoxines Aliments Facteurs Références
Italie 1993 B Aubergine en conserve Traitement thermique insuffisant, acidification incorrecte (CDC, 1995) Canada 1987 A Champignons en bouteilles Sous-traitement et/ou acidification insuffisante (CDC, 1987)
Canada 1985 B Ail dans
l’huile Absence d’agent de conservation (St Louis et al., 1988) USA 1994 A Trempette de
haricots noirs Température
(M. W. Peck, 2006) Argentine 1998 A Rouleau de viande Température (Villar et al., 1999) Afrique du sud 2002 A Conserves de
Sardine Corrosion de l’étain
(Frean, Arntzen, van den Heever, & Perovic, 2004) Australie 2001 E Poulet réchauffé Contrôle de température (Mackle, Halcomb, & Parr, 2001)
Allemagne 1997 E Poisson fumé Température (M. W. Peck,
2006) UA 1993 A Sauce de fromage Température, recontamination (Townes et al., 1996) USA 1994 A Soupes de palourdes Température (M. W. Peck, 2006)
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La structure et la composition chimique des spores jouent un rôle majeur dans sa résistance au stress imposé comme la température et la composition chimique du milieu. La structure et la composition structurelle d’une spore de C. botulinum est illustré dans la Figure 1-4.
Figure 1-4: Structure et composition d’une spore de C. botulinum (Setlow, 2006a).
La résistance à la chaleur des spores de C. botulinum varie d'un type à un autre et même d'une souche à une autre au sein de chaque type. Bien que certaines souches ne survivront pas à une température supérieure à 80 °C, les spores de nombreuses souches nécessitent des températures supérieures à 100 °C pour assurer leurs destructions (Roberts, Ingram, & Skulberg, 1965). La résistance thermique des spores augmente avec l’augmentation du pH et la diminution de la teneur en sel du milieu dans lequel les spores sont mises en suspension (Zezones & Hutchings, 1965). Une faible activité d'eau (aw) inhibe la croissance de C. botulinum et une aw < 0,93 inhibe la production
de toxine. Un potentiel redox (POR) élevé, généralement dû à la présence d'O2, est un facteur défavorable pour C. botulinum. Ainsi, le POR optimal pour la croissance de C.
botulinum est faible et se situe aux alentours de -350 mV, mais la production de toxine a été observée même à +250 mV (Gombas, 1993). Un micrographe d’une spore de
Clostridium pris par microscopie électronique à transmission est présenté dans la
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Figure 1-5: Micrographe d’une spore de Clostridium sporogenes pris par microscopie
électronique à transmission.
La capacité de croissance de C. botulinum dans les aliments est fortement influencée par la présence d'oxygène. L'exclusion physique de l'oxygène et un potentiel redox (POR) négatif sont nécessaires pour permettre la croissance de Clostridia de faible inoculum (Lund, Knox, & Sims, 1984). L’excitation de glucose par l’ATP cellulaire est responsable d’un POR négatif dans les cellules de Clostridium. Une étude faite par Obereke et al. (1992) rapporte que le glucose excité par l’ATP dans les cellules de C. sporogenes PA 3679 est responsable du maintien d’un POR relativement constant de -111 mV. La ∆p constante et le pH cytoplasmique alcalin suggèrent la possession de cette bactérie d'une membrane efficace liée à un proton translocateur et une ATPase de transduction d'énergie (Okereke & Montville, 1992). Le pH minimal de croissance de C. botulinum est de 4,6 à 4,8 pour les souches protéolytiques et d’environ 5 pour les souches non protéolytiques.
La toxine produite par C. botulinum est un complexe de protéines de haut poids moléculaire qui comprend trois protéines principales:
Une toxine de 150 kDa composée de deux sous unités de 100 kDa et 50 kDa et qui sont liées par une liaison disulfure non-covalente;
Une protéine de l'hémagglutinine non toxique; Une protéine non hémagglutinine et non toxique.
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La grande sous-unité (100 kDa) renferme les domaines de liaisons des gangliosides et de translocation, tandis que la petite sous-unité (50 kDa) contient une endopeptidase, dépendante du zinc, qui favorise la dénervation chimique. Les protéines non toxiques assurent la protection du complexe protéique contre la température et la dénaturation enzymatique (Zhang et al., 2010).
Le botulisme, principale danger pour les aliments en conserve peu acide, est une maladie neuropathique résultant de l'action d'une toxine puissante produite par C.
botulinum. Le botulisme d'origine alimentaire est rare, mais il peut causer la mort rapidement et les produits contaminés peuvent affecter beaucoup de personnes. Le botulisme d'origine alimentaire est un problème de santé publique qui met l’accent sur la communication rapide et efficace entre les cliniciens et les responsables de santé publique (Shapiro, Hatheway, Becher, & Swerdlow, 1997). Le botulisme d'origine alimentaire se produit par l'ingestion de la toxine préformée et se caractérise par une paralysie flasque symétrique qui affecte d'abord les muscles de la tête et du cou. Il s’en suit une vision floue, une difficulté à parler et à avaler, des troubles de l'élocution, une sécheresse de la bouche et une faiblesse généralisée (symptômes classiques du botulisme). Dans les cas graves, cela peut progresser jusqu'à la paralysie respiratoire, nécessitant une ventilation mécanique. Des symptômes gastro-intestinaux tels que les nausées, vomissements et diarrhées surviennent dans un tiers des cas de botulisme d'origine alimentaire et sont absents dans tous les cas de botulisme par blessure (Glass, 2013). Ainsi, il paraît évident qu’il faut assurer une destruction totale des spores de C.
botulinum dans les aliments mis en conserve.
1.1.4.1.1.1 Résistance thermique des spores de Clostridium
Comme déjà cités, les spores de C. botulinum sont beaucoup plus résistantes à la chaleur humide et sèche que les bactéries non sporulantes (Brown, 1994). Généralement, les spores sont résistantes à environ 40 °C de plus que les cellules végétatives de la même souche (Setlow, 2006a). La résistance des spores à la chaleur humide est notamment corrélée au niveau d’hydratation du protoplaste. Cette résistance est directement proportionnelle à la teneur en eau. L’acide dipicolinique (acide pyridine-2,6-dicarboxylique (DPA)) joue un rôle important dans la résistance des
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spores contre la chaleur (Figure 1-6) (P. Setlow, 2006a). Les souches qui n'ont pas la capacité de synthétiser le DPA peuvent également être sporulées avec ou sans DPA dans le milieu (Loison, 2013; Paidhungat, Setlow, Driks, & Setlow, 2000). Le DPA agit positivement sur le contenu en eau des spores. Ainsi, les spores sans DPA sont beaucoup plus sensibles à la chaleur humide que celles avec DPA (Setlow, 2006a). A côté du DPA, les noyaux de spore contiennent également des niveaux élevés de cations divalents chélatés avec le DPA. Cette minéralisation du noyau est également importante dans la résistance à la chaleur humide des spores. Plus cette minéralisation est élevée, plus la résistance thermique à la chaleur des spores est plus élevée. Ainsi, les spores contenant des niveaux élevés en Ca2+ sont plus résistantes à la chaleur humide et les spores avec des niveaux élevés en Mg2+ ou Mn2+ sont moins résistantes à la chaleur (Loison, 2013; Setlow, 2006a).
Figure 1-6: Structure de l'acide dipicolinique.
Belliveau et al. (1992) considère que les protéines forment une cible majeure pour l'inactivation des spores par la chaleur (Belliveau, Beaman, Pankratz, & Gerhardt, 1992). Les protéines mal hydratées sont généralement plus résistantes à la chaleur que les protéines en solution aqueuse. L'élimination des spores par la chaleur humide n'est pas due à des lésions de l'ADN et est souvent accompagnée d'une inactivation des enzymes de noyau et de la rupture de la barrière de perméabilité de la membrane interne de la spore (Setlow, 2006a). L’inactivation des spores résulte des dommages qui apparaissent dans les protéines. La chaleur aboutit à la rupture des liaisons hydrogène et des ponts hydrophobes non polaires. Cela se produit parce que la chaleur augmente
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l'énergie cinétique et provoque une vibration rapide des molécules. Dans les spores, les enzymes sont présentes sous une forme inactive (zymogène), permettant ainsi une longue survie aux cellules. Les hautes températures dénaturent les enzymes de nature protéique par le changement de conformation de leur structure tridimensionnelle (Setlow, 1994b).
La saturation de l’ADN des spores avec des petites protéines solubles dans l'acide (SASP) de type a/ß joue un rôle important dans la résistance des spores à la chaleur humide. Ainsi, des lésions ou des dommages se produisent dans l’ADN des spores dépourvues de la majorité de leur SASP. Celles-ci sont détruites beaucoup plus rapidement par la chaleur humide que les spores de type sauvage (Setlow, 2006a). Parmi les dommages associés à l’ADN, il y a la dépurination (perte de guanine ou adénine chargée négativement) et la dépyrimidation (perte de cytosine et thymine chargée positivement) de l'ADN des spores. Également, Marquis et al. (1994) ont démontré que l'inactivation des spores par la chaleur est liée à l’oxydation, résultant de la formation de radicaux libres qui sont capables de produire des dommages irréversibles aux polymères de spores comme les protéines et l'ADN (Marquis, Sim, & Shin, 1994).
1.1.4.1.1.2 Résistance chimique des spores de Clostridium botulinum
Bien que les spores de C. botulinum sont détruites par certains traitements chimiques, elles restent extrêmement résistantes à une variété de produits chimiques, y compris les acides, les bases, les agents oxydants, les agents alkylants, les aldéhydes et les solvants organiques. Le mécanisme de destruction des spores est causé par :
Des lésions au niveau de l’ADN causées par les formaldéhydes et l’acide nitreux;
Des dommages des couches externes causés par des agents oxydants, principalement la membrane interne de la spore entraînant la mort des spores;
Des modifications irréversibles au niveau de la membrane interne causées par l’hypochlorite de sodium (eau de Javel), le dioxyde de
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chlore (ClO2), le poroxyde d’hydrogène (H2O2) et d’autres décontaminants/désinfectants commerciaux;
Par ouverture des spores suite à un traitement acide aboutissant à une perméabilité de la membrane interne de la spore (Setlow et al., 2002; Setlow, 2006a; Young & Setlow, 2003).
La résistance de C. botulinum aux agents chimiques est associée à plusieurs facteurs. L’enzyme superoxyde dismutase, qui pourrait détoxifier un produit chimique potentiellement dangereux, a été trouvée associée à l'exosporium et/ou à la couche de spores de certaines espèces. En plus, l’alkylhydroperoxydase réductase joue un rôle majeur dans la résistance cellulaire par inactivation d'agents toxiques. Cependant ces enzymes ne jouent aucun rôle dans la résistance des spores dormantes, bien qu'ils soient présents dans le noyau des spores (Setlow, 2006a). Un autre facteur important impliqué dans la résistance chimique des spores est la membrane interne de la spore qui présente une perméabilité extrêmement faible aux petites molécules hydrophiles et hydrophobes. Ainsi, une augmentation de la perméabilité de cette membrane conduit à des dommages dans l’ADN des spores (Cortezzo & Setlow, 2005). La saturation de l'ADN avec le SASP de type α/β joue un rôle important dans la résistance des spores contre certains produits chimiques. Le SASP protège également l'ADN in-vitro contre les dommages causés par le peroxyde d'hydrogène qui est un agent oxydant très puissant. Cependant, la SASP ne protège pas l'ADN des spores contre tous les produits chimiques comme, par exemple, l'éthylméthanesulfonate (Loison, 2013; Setlow, 2006a).
1.1.4.1.2 Escherichia coli O157:H7
Escherichia coli O157:H7 est une bactérie bacille à Gram négatif (Weir, 2000).
E. coli O157: H7 est apparu, la première fois, comme un pathogène d'origine alimentaire en 1982. C’est la cause de trois maladies qui sont la colite hémorragique, le syndrome urémique hémolytique et le purpura thrombotique thrombocytopénique. Un modèle pour la transmission d’E. coli O157: H7 des bétails à l'homme est présenté dans la Figure 1-7. Les épidémies causées par E. coli O157: H7 ont été reliées au bœuf haché, au lait, au cidre de pomme, à la laitue, au radis et à l'eau (Getty, Phebus,
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Marsden, Fung, & Kastner, 2000; Phillips, 1999; Saeedi et al., 2017). La gastro-entérite chez l’homme, causée par E. coli O157 :H7, se déroule en quatre étapes: adhérence à la muqueuse du petit intestin, invasion directe des cellules de la muqueuse, rupture de la bordure de la brosse microvillis et la libération de la toxine. E. coli O157: H7 cause la colite hémorragique en élaborant une ou plusieurs cytotoxines étroitement liées à la toxine de Shigella. Ces toxines, appelées Shiga toxines ou vérotoxines, endommagent l'épithélium intestinal et semblent posséder des propriétés neurotoxiques et entérotoxiques (Weir, 2000).
Figure 1-7: Modèle de transmission de E. coli O157: H7 à l'humain (Gansheroff &
