Etude fonctionnelle du promoteur de
BI-1 chez les plantes
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l'Université Laval dans le cadre du programme de maîtrise en microbiologie
pour l'obtention du grade de maître es sciences (M.Se)
DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE, DE MICROBIOLOGIE ET DE BIO-INFORMATIQUE
FACULTÉ DES SCIENCES ET DE GÉNIE UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2012
Résumé
La mort cellulaire programmée (MCP) est un phénomène physiologique essentiel constaté chez les organismes vivants. Cette mort peut être induite par plusieurs stimuli comme les stress biotiques, abiotiques ou physiologiques. Une panoplie de molécules est impliquée dans la réception et la transduction des stimuli ainsi que dans la régulation et dans les activités associées à la mort cellulaire. Les régulateurs de la MCP chez les plantes sont moins connus que chez les animaux. Des travaux de recherches antécédents ont toutefois montré, chez plusieurs espèces végétales, l'existence de la protéine antiapoptotique BI-1 (abréviation anglaise pour Bax Inhibitor-1). Cette protéine inhibe ou restreint la mort cellulaire induite par la protéine Bax, une protéine, surtout connue dans le règne animal pour favoriser le suicide cellulaire. Localisée principalement au reticulum endoplasmique (RE), l'action de BI-1 pourrait se situer à ce niveau. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons, tout d'abord, identifié la séquence ERSE dans le promoteur de BI-1.Cette séquence, est connue comme étant un motif présent au niveau des promoteurs de plusieurs gènes notamment ceux liés aux stress du RE avec un rôle important dans l'expression de ces gènes lors d'un stress du RE. Nous avons aussi entrepris des études pour vérifier l'effet de la tunicamycine (TM), substance inductrice d'un stress du RE, et des UV-C, traitement pour l'expression de BI-1, dans les plantes de tabac et d'Arabidopsis transformées avec le promoteur intact et le promoteur muté. La mutation a été réalisée en supprimant le motif ERSE du promoteur. Les résultats montrent l'effet néfaste des traitements sur la croissance et la teneur en chlorophylle d'Arabidopsis et une augmentation du niveau d'expression de BI-1 et d'autres protéines de réponse au stress au niveau des plantes stressées. Nous avons également signalé une diminution de l'activité du promoteur de BI-1, voire même son inexistence en l'absence du motif ERSE. L'ensemble des résultats présentés conforte l'hypothèse d'une action de BI-1 au sein de la réponse au stress du RE.
Avant-Propos
Je tiens tout d'abord à remercier vivement ma directrice de recherche, la professeure Louise Brisson, pour sa méthodologie de travail et sa disponibilité malgré un emploi de temps fort chargé. Le déroulement de mon projet de recherche a été sagement guidé par des réunions régulières au cours desquelles elle a su combiner sympathie et sérieux afin de me faire profiter de son expertise pour évaluer mes travaux de recherche et de ses conseils enrichissants pour diriger l'évolution de mon cursus académique ainsi celle de mon projet de recherche.
Mon projet de maîtrise est effectué sous la codirection de Mme Nathalie Beaudoin de l'université de Sherbrooke dont les conseils étaient précis et efficaces pour l'avancement de mes recherches.
Je remercie aussi Mr François Belzile de m'avoir accueillie dans son laboratoire ainsi que tous les membres de son laboratoire. J'adresse un remerciement spécial à Martine Jean, professionnelle de recherche du laboratoire François Belzile qui n'a jamais hésité à consacrer son temps pour se pencher pleinement avec moi sur ces questions et à me faire part de toute son expertise.
J'adresse ensuite mes remerciements à tous les étudiants et amis à l'institut de biologie integrative et des écosystèmes et tout le corps enseignant et administratif qui ont fait en sorte que le cadre de travail soit instructif, propice et agréable.
Finalement, je remercie spécialement tous les membres de ma famille pour la patience qu'ils m'ont accordée et les énormes sacrifices qu'ils ont faits pour que je sois là où je n'aurais jamais pu être sans eux.
Résumé iii Avant-Propos iv Table des matières v Liste des abréviations 1 Liste des tableaux 3 Liste des figures 4 Introduction 5
1.1 La mort cellulaire 5 1.1.1 La nécrose 5 1.1.2 La mort cellulaire programmée 6
1.1.2.1 L'Apoptose 6 1.1.2.2 L'Autophagic 7 1.1.2.3 La Sénescence 7 1.2 La régulation de la mort cellulaire programmée chez les animaux 7
1.3 La mort cellulaire programmée chez les végétaux 8
1.3.1 La protéine BI-1 9 1.3.1.1 Fonction biologique de BI-1 12
1.3.1.2 L'action de BI-1 au reticulum endoplasmique 14
1.3.1.2.1 Action de BI-1 16 1.3.1.2.2 BI-1 et la régulation des flux calciques 18
1.3.1.2.3 BI-1 et la régulation des radicaux libres et du métabolisme oxydatif.. 19
1.3.1.3 La glycosylation des protéines et la tunicamycine 20
1.3.1.4 Les UV-C 23 1.4 Objectifs 24 Matériel et méthodes 26 1.1 Matériel végétal 26 1.2 Bactéries 26 1.2.1 Souches bactériennes 26 1.3 Les plasmides ...27 1.4 Méthodologie 27 1.4.1 Analyses bio-informatiques 27 1.4.1.1 Expression des gènes BI-1, BIP, bZIP60 et actine 2 29
1.4.1.2 Séquençage 30 1.4.2. Manipulations génétiques et moléculaires 32
1.4.2.1 Préparation d'ADN plasmidique 32
1.4.2.2 Synthèse d'ADNc 33 1.4.2.3 Amplification par PCR 33
1.4.2.3.1 Purification et dosage 34 1.4.2.3.2 RT-PCR semi-quantitative 34 1.4.2.3.3 Mutation du promoteur de BI-1 34
1.4.2.4 Clonage du promoteur 36 1.4.2.5 Les transformations 38
1.4.2.5.1 Transformation des bactéries 38 1.4.2.5.2 Transformation des plantes 38 1.4.2.6 Traitement des plantes et des feuilles de tabac 39
1.4.2.6.1 Traitement à la tunicamycine et aux UV-C 40
1.4.3 Détection de l'activité P-glucuronidase 41
Résultats 42 1.1 Le promoteur de BI-1 42
1.1.1 Identification de l'élément ERSE 42
1.1.2 Mutation du promoteur 43 1.2 Étude du stress du reticulum endoplasmique 46
1.3 Effet de la tunicamycine et des UV-C sur des plantes d'Arabidopsis 46
1.4 Expression du gène BI-1 50 1.5 Importance du motif ERSE pour l'induction de BI-1 54
Discussion et perspectives 57 1.1 Expression de BI-1 58 1.2 L'élément ERSE, une clé dans la régulation de BI-1 60
1.3 Conclusion 61 Bibliographie 62 Annexe 1 : Protocole d'agroinfiltration 74
aa Acide aminé
ADN Acide désoxyribonucléique ADNc ADN complémentaire ADNg ADN génomique ARN Acide ribonucléique ATG Autophagy-related gene ATP Adénosine-5' -triphosphate Bcl-2 8-cell lymphoma leukemia 2 gene BI-1 Bax Inhibitor-1
BIP Binding protein bZIP28 Basic leucine zipper 28 bZIP60 Basic leucine zipper 60 CAM Calmoduline
CDRE Calcineurin-dependent response element cm Centimètre
DEPC Diethyl dicarbonate
ddH20 H20 double distillée
cyt Cytochrome
ERK1/2 Extracellular-Regulated Kinase 1/2 ERSE Endoplasmic Reticulum Stress Elements ERSE-II ER stress response elements II
FAH Fatty acid hydroxylase GlcNAc N-acétylglucosamine
GPT N-acétylglucosamine phosphotransferase IRE la inositol-requiring 1 a
IRE lb inositol-requiring 1 b MCP Mort cellulaire programmée
NPR Oxydoreductase NADPH dépendante P-UPRE Plant unfolded protein response PBA 4-phenyl butyric acid
PR-1 Pathogenesis-related 1 gene RE Reticulum Endoplasmique
ROS Reactive Oxygen Species SAG Senescence Associated Gene SEP3 Sepallata 3
TM Tunicamycine Tm Température de fusion tm Domaine transmembranaire TUDCA Taurousodeoxycholic acid TIN1 Tunicamycin induced 1 UPR Unfolded Protein Response
UPRE Unfolded Protein Response Element UV ultra-violet
XBP1 x-box-binding protein 1
Tableau 1 : Listes des protéines étudiées pour les études bio-informatiques d'expression
comparée 28 Tableau 2 : Amorces utilisées avec la température de fusion (Tm) pour le séquençage et les
réactions de PCR 30 Tableau 3 : Critère de sélection des bactéries transformées en fonction des plasmides
insérés. 32 Tableau 4: Effet de la tunicamycine sur la croissance, la chlorophylle et le taux de
mortalité chez Arabidopsis. 48 Tableau 5: Effet des UV-C sur la croissance, la chlorophylle et le taux de mortalité chez
Figure 1 : Modèles transmembranaires de la protéine BI-1 proposés dans l'étude de Geert (
2011) 12 Figure 2 : Interférence de BI-1 dans la réponse du stress duRE 16
Figure 3 : Structure d'une glycoprotéine liée enN 21 Figure 4 : Structure d'un dolichol lié au premier ose par un groupement phosphate 21
Figure 5 : Structure chimique de la tunicamycine 22 Figure 6 : Sentier de biosynthèse de la tunicamycine d'après Tsvetanova et al., 2002 23
Figure 7 : Stratégie d'amplification utilisée pour l'obtention du promoteur muté (686 pb).36
Figure 8 : Le vecteur pCAMBIA-1391Z et ses sites de restriction 37 Figure 9 : Transformation transitoire des plantes d'Arabidopsis par infiltration sous vide .39
Figure 10 : Transformation transitoire des feuilles de tabac par une infiltration de la
solution bactérienne à l'aide d'une seringue. (Figure prise sur internet) 39 Figure 11 : A) Localisation du promoteur de BI-1 sur le chromosome 5, B) séquence
nucléotidique du promoteur de BI-1 obtenu du laboratoire du Dre Beaudoin
(Université de Sherbrooke) 43 Figure 12 : PCR du promoteur de BI-1 44 Figure 13 : Séquences du promoteur intact (A et B) et muté (C) de BI-1 d'Arabidopsis 45
Figure 14: Effet de la tunicamycine sur la croissance et le contenu en chlorophylle des
plantes d'Arabidopsis 47 Figure 15 : Effet des UV-C sur la croissance et le contenu en chlorophylle des plantes 49
Figure 16 : Profils d'expression des gènes Bl-1 et BZIP28 lors du développement des
plantes d'Arabidopsis thaliana 51 Figure 17 : Classification comparée des profils d'expression, au niveau des tissus, de BI-1
et de gène impliqués dans les réponses de stress (autophagic, défense, stress du RE,
sénescence) 52 Figure 18: Effet des traitements à la tunicamycine et aux UV-C sur l'expression des gènes
de stress du RE : bZIP60 et BIP et sur BI-1 53 Figure 19 : Effet de la mutation sur l'inductjon de l'expression de BI-1 à la suite d'un
traitement à la tunicamycine ou aux UV-C 55 Figure 20 : Expression de GUS dans les feuilles de tabac traitées à la tunicamycine et aux
Durant sa vie, un être vivant passe par plusieurs étapes fondamentales, nécessaires à son développement. L'acquisition d'un bon développement permet de maintenir sa survie dans un écosystème rempli de dangers, et quelquefois néfaste. Pour résister à ces dangers, et survivre dans cet environnement, tout être vivant dispose de mécanismes de défense naturelle. Ces mécanismes diffèrent selon la nature du danger et la nature de l'être lui-même. Cependant, le but reste le même : la survie. Les premiers travaux de recherche relatifs à ce volet portaient sur le règne animal. Des années plus tard, les scientifiques ont commencé à porter une attention particulière au règne végétal. Jour après jour, on constata que ce monde est très riche en informations et il pourrait être très utile pour l'être humain, afin d'élargir ses connaissances scientifiques et bâtir un pont entre ces deux grands règnes. Parmi ces travaux, une grande partie portait sur la mort cellulaire, ses mécanismes, ses effecteurs et son mode d'action.
1.1 La mort cellulaire
La mort cellulaire est un processus très important dans les deux règnes, animal et végétal. La mort d'une cellule peut être accidentelle ou encore physiologique afin de survenir soit à des besoins de croissance et de développement ou soit à la nécessité de se défendre. Dans la littérature, les morts accidentelles sont souvent qualifiées de nécrose alors que les autres types de mort, celles qui nécessitent l'intervention de molécules clés pour l'exécution cellulaire sont identifiées comme de la mort cellulaire programmée. Dans ce dernier cas, l'élimination des cellules surnuméraires, endommagées ou dysfonctionnelles peut permettre la survie de l'organisme.
1.1.1 La nécrose
La nécrose est une mort accidentelle, aléatoire, qui dépend d'un événement extérieur. Pour l'organisme, la nécrose apparaît comme un processus dégénératif passif. En termes morphologiques, une cellule en nécrose est gonflée dans son ensemble et au niveau de ses organites parmi lesquels la mitochondrie et le noyau sont plus affectés. La chromatine à l'intérieur de ce noyau gonflé devient fragmentée et se présente comme des amas compacts
intracellulaire.
Dans la littérature, le terme nécrose lorsqu'il est utilisé pour décrire une lésion à un site d'infection, peut apporter une certaine confusion terminologique. Phénotypiquement, une telle nécrose peut être localisée ou au contraire très étendue. Dans certains de ces cas, le symptôme de nécrose peut correspondre à de la mort cellulaire programmée. Cette situation survient lors de la réaction hypersensible provoquée par un agent pathogène. Dans ce pathosystème, il est admis que la nécrose circonscrit l'agent pathogène et entrave sa dissémination dans la plante (Lam et al, 2001).
1.1.2 La mort cellulaire programmée
1.1.2.1 L'ApoptoseLa mort cellulaire programmée (MCP) qualifiée d'apoptose chez le règne animal est un mécanisme intracellulaire nécessitant une panoplie de molécules impliquées dans la réception et la signalisation du message et dans la régulation de l'action de la cellule. Contrairement à la nécrose, la MCP affecte généralement quelques cellules isolées afin d'éliminer des cellules potentiellement dangereuses, endommagées, ou inutiles dans l'organisme. Chez les cellules animales, l'apoptose a d'abord été décrite par des caractéristiques morphologiques typiques telles la compaction et la marginalisation de la chromatine, la condensation du cytoplasme, le bourgeonnement de la membrane plasmique, la fragmentation de l'ADN en segments de 160 à 200 pb et finalement la fragmentation de la cellule pour former des corps apoptotiques. Aujourd'hui, le terme apoptose associé à des changements cellulaires et ultrastructuraux précis est trop restrictif pour englober l'ensemble des processus associés à une mort cellulaire qui nécessite l'intervention de molécules clés pour être exécutoire. Dans la littérature concernée, les chercheurs en biologie végétale font généralement référence à des phénomènes de mort cellulaire programmée au sens large ou encore à des mécanismes d'autophagie ou des phénomènes de sénescence.
L'autophagic représente un processus qui permet aux cellules de survivre en réponse à une carence nutritionnelle. Ce processus permet aussi d'éliminer les organites endommagés et les constituants cellulaires par leur séquestration et leur dégradation dans les lysosomes. (Sir et al, 2010). Ce processus par lequel la cellule s'autodigère assure ainsi la survie cellulaire en fournissant l'énergie et les nutriments nécessaires à la cellule. Au niveau morphologique, on reconnaît ce phénomène par la formation de plusieurs vacuoles et de vésicules autophagiques. Ces vésicules fusionnent avec les lysosomes et forment ainsi des autolysosomes. Ces derniers ont pour effet de dégrader le contenu par des enzymes catalytiques. Ce phénomène fait intervenir plusieurs gènes, une trentaine qui sont souvent dits gènes ATG pour « autophagy related gene ».
1.1.2.3 La Sénescence
Le terme sénescence est généralement utilisé pour décrire la lente dégradation des fonctions de l'organisme, généralement associée au vieillissement d'une cellule, d'un tissu, d'un organe ou d'un organisme. Elle est considérée comme une forme de MCP particulière affectant généralement un organe au complet. Contrairement à la MCP, la sénescence permet le recyclage des nutriments (Hanaoka et al, 2002 ; Doelling et al, 2002). Selon le type de sénescence, les auteurs ont décrit divers changements morphologiques et fonctionnels au niveau cellulaire ou tissulaire tels l'usure des telomeres, l'activation des oncogenes ou encore le dommage de l'ADN (Chen et Goligorsky, 2006).
1.2 La régulation de la mort cellulaire programmée chez les
animaux
La mort cellulaire programmée (MCP) chez les animaux fait intervenir plusieurs molécules. Parmi les régulateurs les plus étudiés figurent ceux la famille de Bcl-2 (6-cell lymphoma leukemia 2 gene). Cette famille, regroupe des membres qui induisent l'apoptose ou au contraire l'inhibent. Ainsi, on reconnaît trois sous-familles : la sous-famille Bcl-2 (antiapoptotique Bcl-2, Bel-XL, Bcl-w, Mcl-1 et Al), la sous-famille Bax (proapoptotique Bax, Bak et Bok) et la sous-famille BH3 (proapoptotique Bad, Bid, Bik, Blk, Hrk, BNIP3 et BimL) (Watanabe et Lam, 2009). Outre les membres de la famille de Bcl-2, plusieurs
Bcl-2 modulant ainsi la réponse cellulaire et son intensité. À cet effet, on peut citer la protéine BI-1 (Bax Inhibitor-1), protéine qui fait l'objet de cette étude.
Les effecteurs de l'apoptose sont des protéines qui conduisent à la réaction apoptotique. On y distingue entre autres les nucleases et les caspases. Les nucleases sont des enzymes qui coupent les liaisons phosphodiester des brins d'acides nucléiques (Watanabe et Lam, 2006). Les caspases, sont des proteinases qui présentent un domaine peptidique conservé de cinq acides aminés au niveau du site actif de type QACXG (Gin (Glutamine)-Ala (Alanine)-Cys (Cystéine)-X-Gly (Glycine)) ou X correspond à R (Arg (Arginine), Q ou G (Eamshaw et al., 1999). Ce domaine est essentiel à l'activité catalytique de ces enzymes (Cryns et Yuan, 1998 ; Kidd, 1998). Généralement, les gènes des caspases se trouvent sous une forme inactive dans la cellule. L'activation des proteases nécessite un clivage protéolytique du prodomaine ou l'enlèvement de la substance inhibitrice (Cryns et Yuan, 1998). Cette activation se fait, soit par une autre caspase, soit par la granzyme B (Kidd, 1998). La première caspase identifiée fut ced-3, isolé de C. elegans, connu sous le nom de caspase 1, et depuis plusieurs années, le nombre de caspases identifiées a augmenté et on compte maintenant 13 caspases de 1 à 10 chez l'humain, caspase 13 chez C. elegans et deux homologues murins (caspases 11 et 12) (Kidd, 1998; Thornberry et Lazebnik, 1998). La contribution des caspases dans la MCP a été démontrée par des études de deletion sur des souris déficientes pour une caspase spécifique et leur importance se manifeste dès les inductions apoptotiques par une expression transitoire de la caspase 1 (Miura et al, 1993).
1.3 La mort cellulaire programmée chez les végétaux
Chez les végétaux, la mort cellulaire programmée intervient aussi dans toutes les étapes de la vie et du développement. Au niveau du développement, la MCP s'établit notamment lors de l'embryogenèse (DeLong et al, 1993) tel le cas de la disparition des cellules à aleurone au niveau des graines, la vascularisation (Jones et Dangl, 1996) au niveau de la formation du xylème et son extension, l'exfoliation de la coiffe par le renouvellement des cellules subérifiées et la sénescence (Dion, 1998; Pontier et al, 1998; Pennell et Lamb, 1997). Elle peut être aussi déclenchée suite à un stress abiotique tel que la
(Watanabe et Lam, 2009) ou biotique (organisme pathogène) particulièrement lors de la réponse hypersensible RH ( Bolduc et al, 2007; Heath 1998; Pontier et al, 1998; ), ce qui permet à certaines cellules de s'autoéliminer pour favoriser la survie de l'organisme (Kimchi, 2007). La réponse hypersensible (RH) illustre, d'ailleurs, ce phénomène où la plante attaquée réagit avec l'apparition de petites taches nécrotiques, ce qui limite le développement de la propagation de l'agent pathogène.
Au niveau moléculaire, les études chez les cellules animales ont guidé les recherches vers des homologues chez les plantes. Ces recherches et la connaissance des génomes de plusieurs espèces végétales indiquent maintenant une différence au niveau moléculaire de la mise en place de la mort cellulaire. Les protéines impliquées dans la mort des cellules végétales sont, pour la plupart, différentes de celles identifiées chez les autres formes vivantes, et ce, même si les fonctions sont conservées. Ainsi, on a identifié comme effecteurs chez les végétaux, des proteases identifiées comme étant des Caspases-like homologues aux caspases animales et des nucleases pour la dégradation de l'ADN ( Watanabe et Lam, 2009; Gilchrist, 1998; White, 1996; Larsen, 1994; Wyllie et al, 1980 ). Pour les régulateurs, il semble que le mécanisme fasse intervenir d'autres molécules régulatrices que celles identifiées chez les animaux. Certaines protéines sont tout de même, conservées entre les deux règnes dont la protéine antiapoptotique BI-1. Cette protéine est connue comme étant une protéine régulatrice protégeant les cellules de la mort causée par Bax, une protéine régulatrice importante dans les cellules animales, mais absente dans les cellules végétales.
1.3.1 La protéine BI-1
Chez les organismes vivants, le développement et les réponses aux stress sont intimement liés à l'équilibre entre la prolifération et la mort cellulaire. Ainsi, l'ensemble des régulateurs impliqués joue un rôle important dans le devenir de l'organisme. Le gène BI-1 a pu, dès les travaux de Xu et Reed en 1998, être associé à une protéine impliquée dans la protection de la mort cellulaire. Leurs travaux consistaient à cribler une banque d'ADNc d'humain chez des cellules de levure transformées pour qu'elles puissent exprimer, sous certaines conditions, le gène BAX, responsable d'une mort cellulaire. C'est ainsi qu'ils ont
associé la survie de certaines cellules à l'expression d'un gène identifié comme BI-1, pour Bax Inhibitor-1. L'analyse de séquences de ce gène a montré qu'il avait déjà été identifié auparavant comme étant le gène TEGT (testis enhanced gene transcript) alors que sa fonction protéique dans la cellule n'était pas encore déterminée (Walter et al, 1995). Aujourd'hui, la protéine BI-1 est aussi appelée TMBIM6 du fait de son appartenance à la famille de protéines transmembranaires TMBIM pour « Transmembrane Bax Inhibitor containing Motif TMBIM ». Depuis la découverte de BI-1 comme protecteur cellulaire de l'expression de Bax, une masse considérable de travaux a été publiée eu égard à son expression et à son mode d'action. De ces travaux, il est fascinant de remarquer que contrairement aux membres de la famille de Bcl2, régulateurs de l'apoptose les mieux étudiés chez les cellules animales mais absents chez les plantes, BI-1 est présent aussi chez les cellules végétales, et ce, malgré l'absence de Bax, un membre de la famille de Bcl2. En effet, plusieurs travaux mettent en relief la conservation du gène dans différents règnes. Cette protéine semble présente dans toutes les formes vivantes et même chez les virus (Chae et al, 2003). Elle a été étudiée notamment chez les procaryotes (Huckelhoven, 2004 ; Chae et al, 2003), les eucaryotes tel les parasites Plasmodium.falciparum et Cryptosporidium parvum (Chae et al, 2003), les drosophiles, les souris, les nematodes, les levures (Bai et al, 2009 ; Bailly-Maitre et al, 2007 ; Chae et al, 2004 ; Chae et al, 2003 ; Xu et Reed, 1998), les plantes et les hommes (Yu et al, 2002). Chez les plantes, Bl-I a été identifié chez l'Arabidopsis {Arabidopsis thaliana), le tabac {Nicotiana tabacum), le riz {Oryza sativa), la carotte {Daucus carota ssp.sativus), le piment {Capsicum annuum), le colza {Brassica napus) et l'orge {Hordeum vulgaré) (Imani et al, 2006 ; Bolduc et al, 2003; Kawai-Yamada et al, 1999; Xu et Reed, 1998). L'alignement des séquences protéiques déduites des homologues végétaux connus de BI-1 et de quelques BI-1 animaux a révélé que les protéines sont très similaires entre elles. Tous les BI-1 végétaux analysés dans l'étude de Mario Ouellet dans notre laboratoire montrent que les protéines végétales sont identiques à 38-42 %. La similarité est retrouvée sur toute la longueur de la séquence, sauf pour l'extrémité N-terminale qui est moins bien conservée (notamment, les protéines animales sont plus courtes de plusieurs acides aminés) (Ouellet, 2004).
La protéine BI-1 est transmembranaire (Guia et al, 2012 ; Bolduc et al, 2003). Constituée de 237 acides aminés chez l'humain et 247 acides aminés chez Arabidopsis thaliana, cette protéine de 25 à 27 KDa (Xu et Reed, 2008) se caractérise principalement par son caractère hydrophobe (Bolduc et al, 2003 ; Xu et Reed 1998). Les premières études d'analyse structurale conduites à partir des séquences du gène isolé indiquaient d'ailleurs la présence de 5 à 7 domaines transmembranaires avec le domaine N-terminal au niveau du lumen du RE et un domaine C-terminal à caractère hydrophile, du côté de cytosol (Ouellet, 2004 ; Bolduc et al, 2003). Aujourd'hui, les caractéristiques structurales de la protéine au sein de la membrane font toujours l'objet d'études. Selon le programme utilisé pour prédire la structure de la protéine, le laboratoire de Geert, en 2011, a présenté BI-1 sous deux formes (Figure 1). Selon la première forme, la protéine serait constituée de 7 domaines transmembranaires avec le N-terminal du côté du lumen du RE. La seconde proposition, quant à elle, présente BI-1 comme étant une protéine avec six domaines transmembranaires avec le N-terminal du côté du cytosol et un C-terminal en forme de boucle constituée de résidus chargés (Guia et al, 2012; Bultynck et al, 2012 ; Geert et al, 2011). Le groupe de Carrara (2012) préconise une structure de six domaines transmembranaires avec l'extrémité C-terminale exposée au cytosol (Carrara et al, 2012). La région C-terminale se distingue par la présence en résidus d'acides aminés hydrophiles. Chez les végétaux, cette région est constituée de résidus DKEDKKKRRR (Bolduc et al, 2003), avec une forte proportion de lysine (K), d'arginine (R) et d'acide glutamique (E), trois acides aminés à chaîne latérale polaire chargée. L'importance de la région C-terminale a été démontrée sur la fonction de BI-1, entre autres, en remplaçant la lysine et l'arginine par des acides aminés neutres, mutation qui a supprimé la fonction de BI-1 (Kawai-Yamada et al, 2004). Ces acides aminés à l'extrémité C-terminale contribueraient particulièrement à l'adhésion cellulaire, à la régulation du métabolisme calcique et aux associations de la protéine BI-1 avec d'autres protéines (Guia et al, 2012 ; Lee et al, 2010 ; Kim et al, 2008 ; Chae et al, 2003).
ER lumen
Figure 1 : Modèles transmembranaires de la protéine BI-1 proposés dans l'étude de Geert (2011).
Le trait en rouge indique le domaine C-terminal et le trait en bleu indique un site d'homologie avec le domaine de la boucle de la chaîne de sodium SCN5A voltage-dépendante (figure tirée de Geert et al, 2011).
1.3.1.1 Fonction biologique de BI-1
L'évaluation de la fonction de BI-1 repose sur des études de localisation et d'expression. BI-1 est présente dans différents organes et tissus de la plante tels que les feuilles, les racines ou encore les méristèmes (Haiyun et al, 2012 ; Bolduc et al, 2007 ; Watanabe et Lam., 2006 ; Ouellet, 2004). Les études de localisation, effectuées principalement avec la protéine de fusion GFP, ont démontré une forte association avec la membrane du RE et à un niveau plus faible avec l'enveloppe nucléaire (Bolduc et al, 2003). Ces résultats ont été récemment confirmés par l'équipe de Chae (Lee et al, 2010) qui a, en plus, signalé une association de BI-1 avec la membrane plasmique. Cette association, comparativement à sa concentration au niveau du RE, peut paraître insignifiante quoiqu'elle demeure importante pour expliquer ses effets possibles au niveau de l'adhésion cellulaire par l'intermédiaire de l'actine (Lee étal, 2010).
Jusqu'à présent les études fonctionnelles de BI-1 ont été réalisées en étudiant son expression au cours de diverses conditions développementales ou environnementales avec des plantes normales, transgéniques ou mutantes. Ces études suggèrent une participation de BI-1 au niveau des réactions de défense de la plante et pendant la sénescence des feuilles.
Généralement, une expression plus élevée de BI-1 a été notée lorsque les plantes réagissent à des blessures ou à d'autres types de stress de toute sorte qu'il soit environnemental, thermique, hydrique, nutritionnel, salin, hormonal ou encore pathogénique (Isbat et al, 2009 ; Kawai-Yamada et al, 2004 ; Coupe et al, 2004 ; Matsumara et al, 2003 ; Bolduc et al, 2002 ;Sanchez et al. 2000). Plusieurs de ces études ont montré une corrélation entre la surexpression de la BI-1 et la diminution de la mort cellulaire ou des effets néfastes apportés par ces stress ou encore entre une sous-expression et des dommages plus intenses. À titre d'exemple, au sein de notre laboratoire, le rôle protecteur de BI-1 a été suggéré par des études de sous-expression avec des constructions antisens, pour des cellules de tabac soumises à un stress nutritionnel (Bolduc et al, 2002). D'un autre côté, les travaux entrepris dans le laboratoire du Dre Beaudoin, notre collaboratrice, semblent aussi indiquer un rôle de protecteur de BI-1, mais contre la mort cellulaire induite par des UV-C (Chaîné, 2011 ; Djoumad, 2010). Ils ont observé un niveau d'expression de BI-1 beaucoup plus important lorsque les plantes sont exposées à des doses élevées de 40 et de 50 KJ/m . De plus, ces auteurs rapportent une hypersensibilité des plantes mutantes d'Arabidopsis aux UV-C. Les mutants utilisés dans ces travaux, sont atbi-1-1 (mutant avec une extrémité C-terminale non fonctionnelle) et atbil-2 (mutant nul), identifiés et caractérisés par Watanabe et Lam en 2006 (Watanabe et Lam, 2006). Il est aussi intéressant de noter que ces deux mutants ne présentent aucun phénotype anormal lorsque les plantes d'Arabidopsis croissent en conditions normales. En présence d'une toxine fongique (la fumonisine qui inhibe la biosynthèse des sphingolipides) ou de methyljasmonate, ces plantes mutées présentent une sénescence accélérée, phénomène qui est renversé par une surexpression de BI-1 (Haiyun et al, 2012; Watanabe et Lam, 2006).
Pour les relations de défense et de résistance face aux agents pathogènes, les effets de la protéine BI-1 dépendraient du mode d'infection des pathogènes. Dans certaines interactions plante-pathogène, comme celles de la carotte et le pathogène Botrytis cinerea ou Chalara elegans, une surexpression de la protéine BI-1 est associée à une augmentation de la résistance de la plante (Imani et al, 2006). L'importance de BI-1 dans les réactions de défense a aussi été soulignée pour l'orge face aux champignons Phakopsopa pachyrhizi responsable de la rouille (Hoefle et al, 2009) ou du Blumeria graminis responsable du mildiou poudreux (Eichmann et al, 2010 ; Babaeizad et al, 2009). Au contraire, pour
d'autres types d'interactions, comme celles où la virulence du pathogène est associée à la pénétration des tissus sains, la surexpression de BI-1 favoriserait une survie cellulaire qui avantagerait la pénétration de l'agent pathogène. Ceci a d'ailleurs été démontré chez l'orge par les travaux du groupe de Hiickelhoven (Eichmann et al, 2010, 2004; Huckelhoven et al, 2003). Ils ont montré, par des études d'ARNi, que les plantes transgéniques d'orge qui sous expriment BI-1 sont plus résistantes au pathogène Blumeria graminis (Eichmann et al, 2010).
En résumé, jusqu'à maintenant les travaux portant sur la fonction de BI-1 indiquent son activité protectrice contre les effets néfastes de stress qui peuvent conduire à une mort cellulaire programmée. BI-1 pourrait ainsi servir de rhéostat cellulaire pour contrecarrer la machinerie intracellulaire déployée pendant la mort cellulaire programmée. Or, au niveau cellulaire, plusieurs voies de signalisation conduisent à la mort cellulaire. Pour élucider le mode d'action de BI-1, les chercheurs ont, tout d'abord, étudié son interaction avec les membres de la famille de Bcl-2 dont le Bax fait partie. Xu et Reed, en 1998, ont montré que la protéine BI-1 peut interagir directement avec Bcl-2, mais non avec la protéine Bax. Aujourd'hui encore, le rôle de cette interaction potentielle entre le BI-1 et le Bcl-2 demeure toujours incompris (Watanabe et Lam, 2009), d'autant plus que les membres de la famille du Bcl-2 sont absents chez les cellules végétales.
1.3.1.2 L'action de BI-1 au reticulum endoplasmique
Par sa localisation au reticulum endoplasmique, il est plausible de supposer que l'action de la protéine BI-1 se situe au niveau de ce complexe membranaire. Ce compartiment assure plusieurs fonctions notamment celles d'une detoxification, d'une régulation du flux calcique, d'une sécrétion de protéines. Les protéines qui transitent par cet organite y sont repliées et subissent un certain nombre de modifications post-traductionnelles. Un excès de protéines mal repliées ou non glycosylées dans une cellule, causé par certains stress cellulaires, peut être néfaste et peut entraîner la mort de la cellule. Pour éviter le pire, la cellule déclenche une voie de survie appelée la voie UPR de l'abréviation « unfolded protein response » ou le stress du reticulum. Cette réponse du stress du reticulum est conservée chez les organismes vivants. La réponse du stress au reticulum vise donc à
protéger la cellule d'une mort en arrêtant la synthèse de protéines et en augmentant la synthèse de protéines impliquées dans le repliement des protéines (molécules chaperons). Dans la littérature, il est connu que le stress du reticulum peut être induit expérimentalement avec certains traitements comme la tunicamycine, la thapsigargine, la bréfeldine A (Chae et al, 2004 ; Patil et Walter, 2001 ; Berridge et al, 2000). Les travaux du groupe de Chae, en 2004, ont montré que des cellules de souris mutées bil -/- sont, comparativement à des cellules sauvages, hypersensibles à ces traitements. À l'opposé, une surexpression de BI-1 semble protéger les cellules d'un stress trop sévère du reticulum (Chae et al, 2004). Chez les végétaux, ces substances ont aussi été fréquemment utilisées pour étudier le stress du reticulum (Iwata et al, 2010). Ainsi il a été démontré que les cellules de sycamore (Crosti et al, 2001) ou des plantules d'Arabidopsis (Watanabe et Lam, 2008) traitées à la tunicamycine présentent, en plus d'un stress du reticulum, des caractéristiques morphologiques nucléaires et une fragmentation d'ADN typiques aux changements associés à une mort cellulaire programmée. L'étude de Watanabe et Lam (2008) est particulièrement intéressante puisqu'ils ont étudié la relation entre le stress du reticulum et la protéine BI-1 chez des plantes d'Arabidopsis sauvages et mutées, les atbi-1 et atbi-2. Tout comme pour un stress à la fumonisine (Watanabe et Lam, 2006) les plantes mutées pour ATBI-1 présentent, comparativement aux plantes sauvages, une hypersensibilité au stress du reticulum et une accélération de la mort cellulaire. De plus, ils ont montré que la surexpression de BI-1, par l'introduction d'un transgène (promoteur fort 35S-BI-1) dans ces plantes sauvages et mutées, a rendu les plantes plus résistantes à la tunicamycine. Dans leurs travaux, ces auteurs ont signalé que l'expression de BI-1 induite par la tunicamycine coïncide avec celles de quatre gènes associés au stress du reticulum dans des plantes sauvages et des plantes mutantes atbi-1-2. Le niveau de l'expression des gènes associés au stress du reticulum étant similaire chez les plantes sauvages et mutées, les auteurs ont proposé que l'action de BI-1 sur la mort cellulaire soit différente de celle sur le stress du reticulum.
Le mécanisme d'action de la protéine BI-1 au sein du reticulum demeure encore sans réponse définitive. Les connaissances acquises jusqu'à maintenant montrent que la protéine BI-1 pourrait interagir directement ou indirectement à plusieurs niveaux du stress du
reticulum incluant la perception intracellulaire, la signalisation intracellulaire (voie du calcium, voie des ROS), l'activation au sein des machineries transcriptionnelles et post-transcriptionnelles. À ce sujet, Watanabe et Lam (2009) ont présenté une figure, reproduite ci-dessous (Figure 2), qui résume les interactions potentielles de la protéine avec diverses molécules.
Nucleus
TM.CPA.AZC Str»*» fetoMut eu ablodqu»
Ctt» (C»M)
Figure 2 : Interférence de BI-1 dans la réponse du stress du RE.
Figure adaptée de Watanabe et Lam, 2009.
1.3.1.2.1 Action de BI-1
Afin de comprendre comment BI-1 agit au sein de la réponse du stress du reticulum, il est bon de résumer les principales composantes de cette réponse. Chez les cellules animales, il est connu que pendant la réponse du stress du reticulum, l'accumulation de protéines mal structurées conduit à une perception par des molécules chaperons comme BIP qui amène une dimérisation d'IREl, une protéine transmembranaire qui possède une activité enzymatique de sérine/thréonine kinase et une activité endoribonucléasique. Cette dimérisation induit son autotransphophorylation et son activité de ribonucléase. Ceci est
suivi d'un épissage de l'ARNm d'un facteur de transcription XBP-1 ou de bZIP60 et le rend apte à être traduit en une protéine qui se lie sur les séquences des promoteurs de plusieurs gènes qualifiés de gènes-UPR pour en induire leur transcription. Les gènes-UPR activés pendant le stress du reticulum, incluant le gène BI-1, possèdent au sein de leur promoteur divers éléments Cis identifiés comme UPRE, ERSE ou ERSEII des abréviations anglaises pour « unfolded protein response element (UPRE) ou endoplasmic reticulum stress response (ERSE)». Chez les végétaux, quoique le mécanisme soit moins connu, il semble que la protéine BIP agisse sur l'orthologue d'IREl et sur le facteur de transcription bZIP60, permettant à son domaine N-terminal (bZIP) de se diriger vers le noyau (Urade, 2007). Dans le noyau, le domaine N-terminal de transcription bZIP60 se lierait aux éléments-C.-- au niveau des promoteurs de plusieurs gènes pour en activer leur transcription. Les études de transcriptomique ont démontré des effets considérables d'un stress du reticulum au niveau de la transcription. À titre d'exemple, il est mentionné qu'environ 400 gènes du génome de la levure sont induits pendant un stress du reticulum (Jaspard
:http://ead.univangers.fr/piaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/7UnfoldedProtResp/l l nrold-dPiPtR-sp.htm). Chez l'Arabidopsis, Kamauchi et ses collaborateurs ont montré, en utilisant des puces d'ADN, que la transcription de près de 240 gènes est affectée pendant le stress du reticulum (provoqué par un traitement à la tunicamycine) dont 215 sont activés (Urade, 2007; Kamauchi et al, 2005 ). Il est intéressant de noter que le BI-1 figure parmi les gènes activés. Outre BI-1, les gènes induits codent généralement des protéines chaperons ou des protéines associées à la glycosylation ou à la dégradation.
Chez les cellules animales, certains chercheurs ont montré une intervention de BI-1 au tout début du processus au niveau d'un senseur du stress via la protéine ERE la (Castillo et al, 2011 ; Lisbona et al, 2009). Leurs résultats ont indiqué une interaction de BI-1, via son extrémité C-terminale, au senseur du stress IRE la. Dans leurs études, une surexpression de BI-1 correspond à une suppression de l'activité de la protéine IREla. À l'opposé, une hyperactivité de la protéine IREla a été observée dans des cellules déficientes en BI-1 pour lesquelles l'expression de plusieurs gènes-UPR est « up-régulée ». Outre ces études, les évidences expérimentales associant la protéine BI-1 au stress du reticulum, les chercheurs
ont surtout étudié la relation au niveau de la régulation des flux du calcium et des espèces oxygénées réactives.
1.3.1.2.2 BI-1 et la régulation des flux calciques
Plusieurs travaux soulignent une implication possible de BI-1 au niveau de la régulation des flux calciques. En 2004, le groupe de Reed a démontré qu'en l'occurrence d'un stress du reticulum, les souris qui surexpriment le BI-1 libèrent peu du calcium alors que le flux calcique augmente chez des souris déficientes en BI-1 (Chae et al, 2004). Des effets similaires de BI-1 sur l'homéostasie calcique ont aussi été observés dans d'autres travaux avec des cellules de levure (Cebulski et al, 2011), de souris (Hunsberger et al, 2011) de hamster (Westphalen et al, 2005) et de l'homme (Xu et al, 2008) avec des organismes transgéniques soumis à des stress du reticulum. Chez les plantes, les travaux de Nathalie Bolduc dans notre laboratoire ont démontré que l'augmentation de l'expression de BI-1 coïncide avec un influx du Ca2+ externe (Bolduc et al, 2007). L'ensemble de ces travaux conforte l'hypothèse que la protéine BI-1 puisse agir au niveau de l'homéostasie calcique, mais son mode d'action n'est pas encore élucidé. Tel que présenté précédemment dans l'introduction, la topologie de la protéine BI-1 présente une structure avec plusieurs domaines transmembranaires. Cette structure rappelle celle d'un pore ou un canal ionique qui permettrait les entrées et les sorties du Ca + au niveau du RE. En introduisant la protéine BI-1 à l'intérieur de protéoliposomes reconstitués à l'intérieur desquels du calcium était encapsulé, le groupe de Chae a montré le relâchement du calcium à l'extérieur des protéoliposomes modulé par un changement de pH (Ann et al, 2009 ; Kim et al, 2008). En criblant un ensemble de peptides correspondants à l'extrémité C-terminale de diverses protéines BI-1, le groupe de Bultynck a aussi observé cette activité modulatrice du flux calcique, mais seulement pour les orthologues de BI-1 du règne animal et non pour ceux de la levure, du riz, de la tomate et d'Arabidopsis (Bultynck et al, 2012). Ces résultats confortent l'idée que la protéine BI-1 possède une activité associée à un canal calcique ou à un échangeur ionique, du moins chez les cellules animales. Les mouvements du calcium au travers la membrane pourraient aussi s'expliquer par la formation d'oligomères de B1-1 qui rendrait la membrane plus poreuse et plus perméable au calcium ou par l'intermédiaire de certains récepteurs (Kim et al, 2008 ; Xu et al, 2008). La régulation du flux calcique pourrait aussi faire intervenir des pompes moléculaires et de protéines qui lient le calcium
(calmoduline, calréticuline et calnexine). À cet effet, l'association de la protéine BI-1 d'Arabidopsis à la calmoduline7 a été démontrée en utilisant, entre autres, la technologie des deux hybrides chez la levure (Ihara-Ohari et al, 2007). La région C-terminale de la protéine BI-1 semble aussi être impliquée dans cette liaison. Le groupe de Kawai-Yamada a aussi démontré que le BI-1 des plantes mutantes atbi-1 ne peut pas s'associer au complexe calmoduline-hydroxylase et que ceci pourrait influencer la réponse de la plante mutée à une infection au Pseudomonas (Kawai-Yamada et al, 2009) puisque l'absence d'une liaison entre les molécules est corrélée à une réduction de la protection (apportée par BI-1) des plantes infectées. D'un autre côté, en exploitant les ressources électroniques de la banque de données à Toronto, une analyse de type « e-Northern » indique une corrélation de l'expression de BI-1 et celle de la calmoduline (Ishikawa et al, 2011).
1.3.1.2.3 BI-1 et la régulation des radicaux libres et du métabolisme oxydatif
Une production d'espèces activées de l'oxygène (ROS) est aussi associée au stress du reticulum. Jusqu'à ce jour, peu d'études traitent du rôle de BI-1 au niveau des ROS. Les groupes de Chae et de Kawai-Yamada ont étudié l'intervention possible de BI-1 dans la réduction de l'accumulation toxique des ROS dans le reticulum (Lee et al, 2012; Nagano et al, 2009; Lee et al., 2007) et dans les mitochondries (Kim et al, 2012). Dans leurs études, l'action de BI-1 fait toujours intervenir une autre protéine. Chez les cellules animales, cette activité de BI-1 impliquerait l'intervention soit d'une heme oxygenase (Lee et al, 2007) soit du cytochrome P450 ( Lee et al, 2012; Kim et al, 2009 ). Par leurs travaux de deletion, Kim et al, en 2009, ont mis en évidence l'importance du C-terminal dans les interactions de BI-1 avec le cytP450 2E1.
Chez les cellules d'Arabidopsis, les membres de l'équipe de Kawai-Yamada (Nagano et al, 2009) ont proposé que l'action de BI-1 au niveau du système d'oxydoréduction dépendrait de son association avec le complexe formé par le cytochrome b5 (protéine membranaire composante de la chaîne du transfert d'électrons) et par une hydroxylase d'acides gras, la FAH (pour fatty acid hydroxylase). Cette activité serait dépendante de Phydroxylation des acides gras comme les sphingolipides.
Avec des lignées cellulaires qui surexpriment le BI-1 et qui sont soumises à un stress du reticulum, l'effet de la protéine BI-1 associée au cytochrome P450 pourrait moduler l'activité des lysosomes (Lee et al, 2012). Cette activité au sein des lysosomes serait importante pour expliquer l'effet de la protéine BI-1 durant l'autophagie cellulaire. À ce sujet, Reed et ses collaborateurs proposent qu'en contrôlant le calcium du reticulum via le récepteur d'inositol triphosphate ryanosine, la protéine BI-1 influencerait le bilan bioénergétique de la mitochondrie (ROS et ATP) et stimulerait ainsi les voies de l'autophagie (Sano et al, 2012). Chez les cellules d'Arabidopsis, les membres de l'équipe de Kawai-Yamada (Nagano et al, 2009) ont proposé que l'action de BI-1 au niveau du système d'oxydoréduction dépendrait de son association avec le cytochrome b5, protéine membranaire composante de la chaîne du transfert d'électrons. Cette activité serait dépendante de l'hydroxylation des acides gras comme les sphingolipides.
Outre l'interaction avec les ROS produits au sein du reticulum, il semble que la protéine BI-1 puisse affecter la production de ROS dans les mitochondries en activant une MAP kinase, la ERK1/2 (extracellular-regulated kinase 1/2) (Kim et al, 2012). Ainsi, la voie d'activation de BI-l/ERK peut être voie importante dans la signalisation des effets antiapoptotiques de BI-1 (Kim étal, 2012).
1.3.1.3 La glycosylation des protéines et la tunicamycine
Le reticulum endoplasmique est connu comme étant un organite dans lequel s'effectue la glycosylation des protéines. Ainsi, on retrouve des glycoprotéines constituées de protéines et de sucres liés de façon covalente. Cette liaison va contribuer à la stabilité, la solubilité et l'acquisition d'une structure des glycoprotéines. Parmi ces glycosylations, on retrouve la N-glycosylation (Figure 3) qui se fait au niveau du reticulum endoplasmique rugueux (REG). Dans ce type de glycosylation, les sucres s'attachent au groupement amide de l'aspargine. Ce type de sucre est le N-acetylglucosamine (GlcNAc) (d'après le cours de Emmanuel Jaspard :
http//ead.univ-an-;ers.fr/~iaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/2Modif POSTtraduc/8Glycosylation/l Glycosylation.htm).
Ce type de glycosylation nécessite le dolichol phosphate comme intermédiaire (Figure 4). Ce polymère hydrophobe membranaire, est relié au premier ose de l'arborescence par un groupement diphosphate.
N-acétyl glucosamine (GlcNAc)
CH2OH CH2OH O N - i - C — ( H H L Asparagine Protéine
Figure 3 : Structure d'une glycoprotéine liée en N. Figure prise du cours de E. Jaspard en 2005 sur internet
0 0
,Man
, Man-Man CH3-C=CH-CH2 • CH2-C=CH-CH2 • CH2-CH-CH2-CH2-0 ■ P-O-P-0- GlcNAc-GlcNAcW 'Man-Man
C H3 CH3 CH3 r j Q" Man-Man-Man-GIc-GIc-GIc
(15-18 fois)
Figure 4 : Structure d'un dolichol lié au premier ose par un groupement phosphate
Figure 5 : Structure chimique de la tunicamycine (http://www.scbt.com/fr/datasheet-3506-tunicamycin.html page accessible le 21-10-2012).
La tunicamycine (Figure 5) est un antibiotique naturel produit par les Streptomyces (Tsvetanova et al, 2002; Tsvetanova et Price, 2001) inhibiteur de la N-glycosylation des protéines (Tsyetanova et al, 2002) à travers l'inhibition de l'enzyme N-acétylglucosamine (GlcNAc) phosphotransferase (GPT) ou encore le dolichol phosphate, polymère hydrophobe se situant au niveau de la membrane (Adrian et al. 2012) (Urade, 2007) (Watanabe et Lam 2007). Il résulte cette inhibition une accumulation de protéines mal structurées, autrement dit un stress du reticulum endoplasmique qui peut entraîner une apoptose (Fujita et al, 2002).
Cet antibiotique possède une structure composée de GlcNAC, d'un sucre unique dialose appelé tunicamycine, d'un acide gras lié par un groupement amide d'uracile (Tsvetanova et Price, 2001). La figure 6 illustre le sentier de biosynthèse de la tunicamycine (Tsvetanova et al, 2002).
Uridine/Ribose UDP-GlcNAc
t
V <
n^-vs
A 1*1 w sp ' H O O H uridine-5-aldehyde UDP-4-keto-GlcNAc-5,6-ene /°S.r
i n LCP-N-acetyituricamine-urscilJo W
Ni-acetyltunioami ne-utacil /-UDP-GlcNAc - * ^ — UDP TUNICAMYCINS GlcNAcFigure 6 : Sentier de biosynthèse de la tunicamycine d'après Tsvetanova et al., 2002
1.3.1.4 Les UV-C
Les rayonnements ultraviolets (UV) sont composés d'ondes électromagnétiques de longueurs comprises entre 200 et 400 nm. Avec des longueurs d'onde plus courtes que celles de la lumière visible, les rayonnements ultraviolets sont plus énergétiques que ceux compris dans le spectre du visible et sont, par conséquent, beaucoup plus nocifs pour les
êtres vivants. Les UV se divisent en trois catégories en fonction de leur position dans le spectre; UV-A (315-400 nm), les UV-B (280-315 nm) et les UV-C (200-280 nm). Le niveau énergétique associé à ces rayonnements est plus élevé pour les UV-C. Il en résulte une nocivité accrue qui peut se traduire par des dommages importants. Chez les plantes, les effets des UV-C n'ont pas été très étudiés puisque celles-ci sont rarement exposées à ces rayonnements dans la nature notamment grâce à la couche d'ozone.
Une irradiation aux UV-C affecte la croissance et le développement des plantes (Hosseini Sarghein et al, 2011, Rahimzadeh et al, 2011). Les dommages causés par des irradiations aux UV-C dépendent de leurs intensités et de la durée du traitement. Selon les travaux de Piacentini et ses collaborateurs, une exposition aux UV-C peut provoquer des dommages similaires à ceux du peroxyde d'hydrogène (Piacentini et al, 1999). Une production d'espèces activées de l'oxygène (ROS) a d'ailleurs été associée aux effets des irradiations UV (Gill et Tuteja, 2010; Gao et al, 2008). Il est aussi connu que les UV-C peuvent induire une peroxydation des lipides qui, éventuellement, peut diminuer les échanges ioniques au niveau membranaire et/ou endommager les protéines transmembranaires (Gill et Tuteja, 2010). Au niveau moléculaire, tout comme pour les cellules animales, l'énergie associée aux UV-C est suffisante pour briser plusieurs liens chimiques dont ceux de l'ADN, effet pouvant expliquer les mutations associées aux UV. D'un autre côté, la fragmentation de l'ADN nucléaire en fragments dont la dimension est un multiple de 160-200 pb, échelle typique d'une cellule animale en apoptose, a été observée des plantes d'Arabidopsis exposées aux UV-C (Djoumad 2010; Danon et Gallois, 1999). Outre l'échelle d'ADN, l'induction de proteases similaires aux caspases (Danon et al, 2004) et l'induction de l'expression du gène BI-1 indiquent que les changements cellulaires causés par l'exposition aux UV-C s'apparentent à ceux d'une mort cellulaire programmée.
1.4 Objectifs
Comme plusieurs travaux le suggèrent, BI-1 pourrait être impliquée au niveau de la réponse au stress du RE. L'analyse de l'expression de BI-1 en relation avec le stress et l'importance du motif ERSE au niveau de son promoteur contribuent à la vérification de
cette hypothèse. Ainsi, partant de cette hypothèse, les objectifs de ce projet sont divisés comme suit :
1) Vérifier l'effet d'un stress du RE induit par la tunicamycine et aux UV-C sur des plantes d'Arabidopsis ;
2) Déterminer l'effet d'un stress sur les paramètres de croissance des plantes d'Arabidopsis et sur l'expression de BI-1 ;
3) Déterminer les effets de la deletion du motif ERSE sur l'expression de BI-1 chez des plantes d'Arabidopsis et de tabac ;
4) Vérifier du niveau d'expression du gène GUS régulé par le promoteur de BI-1 (intact et muté) à travers la méthode colorimétrique et l'étude de l'expression de l'ADNc de ce même gène rapporteur.
Ces objectifs visent à mieux comprendre le rôle de BI-1 dans la mort cellulaire programmée et l'importance de l'élément ERSE dans l'expression de ce gène.
1.1 Matériel végétal
Les graines d'Arabidopsis d'écotype Columbia (Col 0) nous ont été gracieusement données par la professeure Nathalie Beaudoin de l'Université de Sherbrooke et les graines de tabac (N. tabacum cv Xanthi) proviennent de notre laboratoire (laboratoire Louise Brisson). Les graines d'Arabidopsis et de tabac ont été stérilisées, sous agitation avec 1 ml d'éthanol 70 % pendant une minute et avec 1 ml d'une solution de stérilisation (5 ml javel 10 %, 400 pi SDS 5 % et 45 ml H2O distillée) pendant 10 minutes. Au terme de ce traitement, les graines sont rincées cinq fois avec du ddH2Û pour une période totale de 10 min.
Les graines d'Arabidopsis sont déposées dans un milieu de germination contenant les macronutriments et les micronutriments du milieu Murashige et Skoog (MS) solide (1962) supplémenté avec 1 % saccharose, 0,5 % bacto agar et d'un apport en vitamines selon la formulation proposée par Gamborg (1968) à titre de 20 graines par boîte de Pétri. Les graines de tabac sont déposées sur un milieu solide MS à pH 5.7 supplémenté avec 3 % de saccharose, 0,5 bacto agar, d'un apport en vitamines (kinétine (10 ug/1), thiamine-HCl (1,3 mg/1)) et de 2,4D (0,2 pg/1) à titre de 20 graines par boîte de Pétri. Toutes les opérations sont effectuées sous la hotte à flux laminaire pour diminuer le risque de contamination. Pour lever la dormance embryonnaire des graines d'Arabidopsis, les boîtes de Pétri sont déposées à l'obscurité à 4 °C pendant deux jours. Pour la germination, les graines d'Arabidopsis et de tabac sont incubées dans une chambre de croissance à 22 °C sous un éclairage artificiel (18 heures par jour). Les boîtes sont placées à la verticale pour faciliter l'estimation de l'élongation racinaire et la mesure de la croissance des plantules.
1.2 Bactéries
1.2.1 Souches bactériennes
Les souches d'E. coli DH5a, JM109 et DH1013 ont été utilisées pour les clonages et les sous-clonages. Ces souches bactériennes ont poussé dans un milieu LB (10 g/l NaCl, 10 g/l tryptone, 5 g/l extrait de levure) avec l'antibiotique approprié (DH5a et DH106 : 50 pg/ml de kanamycine ; JM109 : 10mg/ml d'ampicilline) à 37 ° C avec agitation de 200 à 300 rpm
pendant 24 heures. La souche d'Agrobacterium (GV3101) a aussi été cultivée sur un milieu LB à 28 °C pendant 48 heures. Les souches d'Agrobacterium transformées avec le plasmide pCAMBIA-1391Z et le plasmide pCAMBIA-1301 ont été étalées sur un milieu LB en présence de kanamycine (50 pg/ml) (Tableau 3).
1.3 Les plasmides
Le clone du promoteur de BI-1 dans le plasmide pBinl9, contenant les gènes LacZ et kanamycine résistant, a été fourni par la Dre Nathalie Beaudoin de l'Université de Sherbrooke. Il a été utilisé pour le clonage du promoteur intact de BI-1 dans la souche E. coli DH5a. Le plasmide pGEMT-easy (Promega), contenant le gène LacZ et ayant une résistance à l'ampicilline, a été utilisé pour le clonage du promoteur de BI-1 intact ou muté dans E. coli JM109. Le troisième plasmide pCAMBIA-1391Z, ayant une résistance à la kanamycine, offert par le Dr Armand Séguin, a été utilisé pour le clonage du promoteur intact ou muté dans E. coli DH1013 et dans Agrobacterium et le plasmide pCAMBIA-1301, utilisé comme contrôle positif pour l'expression du gène GUS et gracieusement offert par le laboratoire du Dr François Belzile, a aussi été transformé dans E. coli DH10B et Agrobacterium.
1.4 Méthodologie
1.4.1 Analyses bio-informatiques
Pour nos études, les séquences connues du promoteur de BI-1 ont été obtenues par Marie-Andrée Chaîné (du laboratoire de la professeure Nathalie Beaudoin) et des banques de données du NCBI et Athamap aux adresses internet suivantes : http://www.athamap.de/search.php et http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/. Ces séquences ont été comparées avec celles qui ont été amplifiées au cours de cette présente étude.
L'élément ERSE, constitué de 19 pb (5' CGT GGA TGA TTC TTA TTGG 3'), décrit dans la littérature, a été recherché dans les séquences des promoteurs des locus At5g47130, At4gl7180 et At5g47120 d'Arabidopsis. Les analyses de restriction ont été réalisées avec le logiciel NebCutter V2.0.
La localisation chromosomique du gène BI-1 a été réalisée en exploitant les ressources électroniques d'Arabidopsis en utilisant les ressources des sites d'Athamap. Pour les analyses bio-informatiques d'expression comparée, les numéros d'accession de plusieurs gènes (voir le tableau 1) ont été identifiés par la banque génomique d'Arabidopsis thaliana située à l'adresse électronique http://www.Arabidopsis.org/ et traités avec les logiciels de navigation [e-Northerns W. Expression Browser, Arabidopsis eFP Browser (tissùe-specific expression et stress expression), Cell eFP Browser] des ressources du site bar de l'Université de Toronto à l'adresse http://bar.utoronto.ca/welcome.htm.
Tableau 1 : Listes de gènes étudiées pour les études bio-informatiques d'expression comparée
GENE LOCUS NUMERO FONCTION
Symbole (nom) D'ACCESSION
Bl-1 (Bax-inhibitor) AT5G47120 2151977 Inhibition mort cellulaire BZIP60 AT1G42990 2009874 Facteur de transcription BZIP28 AT3G10800 2103192 Facteur de transcription SEP3 (sepallata) AT1G24260 2032372 Facteur de transcription
ATG8C AT1G62040 2036853 Autophagic
ATG8D AT2G05630 2058939 Autophagic
ATG8H AT3G15580 2092560 Autophagic
ATG8G AT3G60640 2101816 Autophagie
ATG8F AT4G16520 2130759 Autophagic
ATG12A AT1G54210 2020098 Autophagie
ATG18 AT1G03380 2020852 Autophagie
ATG18D AT3G56440 2102614 Autophagie
ATG18A AT3G62770 2081705 Autophagie
CB5-A (Cytochrome AT1G26340 2028721 Transfert
d'élecrons-b5) métabolisme
d'oxydoréduction Cytochrome b5 AT1G60660 2036536
Cytochrome b5 AT2G32720 2046417 Cytochrome b5 AT5G53560 2168666
BIP\ AT5G28540 2182783 chaperon
BIP AT5G20730 2180469
TUNICAMYCINE AT5G64510 2174749 fonction inconnue INDUCED 1(TIN1)
IRE1 IRE1 1005452069
IRE1 AT2G17520 2053928 endoribonuclease/protein kinase
IRE1 AT3G11870 2081551
IRE1 AT5G24360 2152886
PRI AT2G14610 2064294 pathogenèse des cellules végétales
PEROXIDASE AT1G05250 2207215 peroxydase
PEROXIDASE AT1G05240 2817952
PEROXIDASE AT1G05260 2207210
PEROXIDASE AT1G07890 2026616
CHALCONE AT5G13930 2159098 stress
SYNTHASE
SENESCENCE AT1G17020 2020407 sénescence
RELATED GENE
SENESCENCE AT1G20620 2034357 sénescence
RELATED GENE
SENESCENCE AT1G66580 2195155 Sénescence
ASSOCIATED GENE 24 (SAG24)
SAG 18 AT1G71190 2026281
SAG 13 AT2G29350 2043177
CALMODULINE-1 AT5G37780 2156045 Protéine liant le calcium CALMODULINE AT2G41100 2063230 CALMODULINE-3 AT3G56800 2103600 CALMODULINE-4 AT1G66410 2029007 CALMODULINE-5 AT2G27030 2059324 CALMODULINE-7 AT3G43810 2101049 CALMODULINE-9 AT3G51920 2083700 CYTOCHROME AT5G05690 2166439 P450
1.4.1.1 Expression des gènes BI-1, BIP, bZIP60 et actine 2
L'étude du niveau d'expression des gènes utilisés chez Arabidopsis dans ce travail a été réalisée via le site http://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi. À l'aide de ce site, on a pu
établir un schéma général du niveau d'expression de chaque gène. Cette expression a été étudiée dans chaque organite de la plante durant sa croissance et son développement.
1.4.1.2 Séquençage
Les promoteurs intact et muté de BI-1 ainsi que toutes les constructions établies dans les vecteurs pBIN19, pGEMT-easy et pCAMBIA-1391Z ont été séquences par le service de séquençage de l'Institut de biologie integrative et des systèmes (IBIS) de l'Université Laval.
Tableau 2 : Amorces utilisées avec la température de fusion (Tm) pour le séquençage et les réactions de PCR
Type d'ADN Amorces Séquençage PCR Tm _!Ç__
Promoteur intact pBI-l-{S\ : 5'CTGCAG TTG CAG AGT TAG X TTTGAATG3'
X 46
pBI-1-02: 5' GGATCC AGTT AGA AAA
TAAAGACTTTCG3' X X 46
promoteur muté pBI-1-01, pBI-1-02
pBI-1-03 : 5' TGA AAT ATC TAA ATC GTC ATC TAA TGGA TTTTT CACT TAG TTTAC3'
pi?/-/-04 : 5' TTA GAT GAC GAT TTA GAT ATT TCA TTT GC TTA GAT GAC GAT TTA GAT ATT TCA TTT GCT TC 3 '
X 45 X 65 pBIN19 pGEMT-easy pCAMBIA-1391Z pBI-1-01, pBI-1-02 pBI-1-01, pBI-1-02 pBI-1-01, pBI-1-02 X X X X X X BI-1 BI-1-F : 5'GCG TTC TCT TCC TTC TTC GAT TCT CAA CCT GG 3' X 64
BI-l-R : 5' CCG AAC AAA CAC AGC TAC AAA GTC AGT GAA AAG GG 3'
BI-l-FOR :5'CTG CAG TTG CAG AGT TAG TTT GAA TG 3' Ml 3-47:5' CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC 3' X 64 56 63 BIP
BIP-F : 5' GGG TGG CGA GAA GAA TAT CC3'
BIP-R : 5' GGC QTC CAC TTC GAA TGT G 3'
X 54
X 53
bZIPÔO
BZIP60-F : 5' CGA TGA GAA TCA TCA AGAGG3'
Bzip60-R : 5' CTC CGA CTA ACG CCG G 3'
X 50 X 51
Actine 2
Actine2-F : 5' CTG GGG TTT TAT GAA TGG GAT CAA AG 3'
Actine2-R : 5' GTA AGT AAA AAC CCA GAG AGT TTG TCA C 3'
X 56
X 57
GUS
M13-48 Rev : 5' AGC GGA TAA CAA TTT CACACAGGA3'
GUS Rev2 : 5' CAG TTC AAC GCT GAC ATC ACC ATTG 3'
GUS int : 5' CAT GGT AGA TCT GAGGAACCGAC 3'
X 54
X 58 X 57
Les nucleotides soulignés représentent un site de restriction pour une enzyme ou un site d'homologie avec une autre amorce.
Pour des fins de séquençage, la concentration des promoteurs de BI-1 et des gènes BI-1, BIP, bZIPÔO, l'actine 2 et GUS a été fixée à 2 ng/pl et celle des plasmides à 100 ng/pl pour un volume final de 10 pi. Les amorces utilisées pour les différents séquençages, à une concentration de 1.5 pM, sont présentées dans le tableau 2.
1.4.2. Manipulations génétiques et moléculaires
Cette section résume une méthodologie conventionnelle de biologie moléculaire, utilisée pour les constructions des plasmides et la transformation dans des bactéries et les plantes. Pour plus de détails, consulter Sambrook et al. (1989).
1.4.2.1 Préparation d'ADN plasmidique
L'ADN plasmidique destiné au clonage bactérien, au séquençage automatique et à la transformation d''Agrobacterium et des plantes a été isolé suivant la méthodologie standard à l'aide de la trousse « QIAprep Spin Miniprep Kit (50) » de QIAGEN, selon les recommandations du fabricant. Brièvement, les bactéries ont été lysées et précipitées. L'ADN plasmidique extrait a été récupéré par centrifugation a été solubilisé dans 50 pi du tampon EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5). Par la suite, le dosage de l'ADN a été effectué par spectrophotométrie en utilisant le nannodrop 2000c (Thermo Scientific). La qualité de l'ADN a été estimée par le ratio DO260/DO280 et sur gel d'agarose (1,8%). Toutes les constructions ont été, par la suite, vérifiées par un séquençage (voir partie séquençage).
Tableau 3 : Critère de sélection des bactéries transformées en fonction des plasmides insérés.
Bactérie Plasmide Critère de sélection
E. coli DH5a pBIN19 Lac Z* - kanamycine'
E. coli JM109 pGEMT-easy Lac Z* - ampicilliner
E.coliDH \0li pCAMBIA-1391Z kanamyciner
Agrobacterium tumefaciens pCAMBIA-1391Z kanamyciner
pCAMBIA-1301 kanamycine'
1.4.2.2 Synthèse d'ADNc
Pour chaque extraction d'ARN, le matériel végétal initial était constitué de 20 plantes d'Arabidopsis. L'ARN a été extrait de ces « pools » de racines et de parties foliaires des plantes d'Arabidopsis trois jours post traitement. Le protocole utilisé pour cette extraction est celui utilisé à l'Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) de France. Brièvement, environ 100 mg de matériel végétal a été broyé dans de l'azote liquide et gardé à -80 °C jusqu'à l'analyse. Lors de l'analyse, le broyât cellulaire est homogénéisé dans 1 ml de trizol (solution commerciale d'Invitrogen composé de guanidinium thiocyanate et de phénol) et incubé pendant 5 min à température pièce. Dans chaque échantillon, 0.2 ml de chloroforme est ajouté pendant 2 à 3 minutes à température pièce. Les échantillons sont centrifugés à 12 000 x g pendant 15 min à une température de 4 °C. L'ARN de la phase supérieure est récupéré par une précipitation à l'isopropanol pendant 10 minutes suivie d'une centrifugation à 12 000 x g pendant 15 min, à 4 °C. L'ARN est lavé avec l'éthanol 75 % traité au DEPC et dissout dans 50 pi de ddH20 DEPC.
1.4.2.3 Amplification par PCR
Des amplifications à la PCR ont été réalisées pour l'amplification du promoteur intact et muté et pour vérifier le site, le sens et le nombre d'insertion dans pCAMBIA-1391Z. D'un autre coté, cette technique a été utilisée pour amplifier l'ADNc des gènes BI-1, BIP, bZIPÔO l'actine 2 et GUS pour des fins de sondes moléculaires. Pour toutes les réactions d'amplification, les conditions de la PCR sont généralement les mêmes. L'ADN, à une concentration de lOOng, est mis en présence d'une Taq polymerase (2.6 U/réaction), du tampon avec Mgcl2 (tris-HCl pH 9, 15 nM MgCl2) 500 mM KC1, 1 % Triton X100, 0,1 % gélatine (m/v) (IX)), du dNTP (200 pM) et les amorces (500 nM) fournies par la compagnie ROCHE. La dénaturation initiale et la phase de dénaturation sont effectuées à 95 °C pendant une minute et pendant 45 secondes respectivement. La phase d'hybridation correspondant à l'appariement des amorces est réalisée à une température égale à la température de fusion moins 2 °C, selon les amorces utilisées, pendant une minute. Par la suite la l'élongation permettant la synthèse du brin complémentaire est réalisée à 72 °C pendant une minute suivie d'une période de 10 minutes. Les PCRs sont effectuées avec
TProfessional Basic Thermocycler avec 30 cycles correspondants aux phases de dénaturation, d'hybridation et d'élongation initiale. Les produits d'amplification ont été séparés par électrophorèse sur un gel d'agarose 1.8 % et visualisé (Molecular Imager V.3 (Bio Rad)) grâce au bromure d'éthidium.
1.4.2.3.1 Purification et dosage
Les fragments d'ADN ont été purifiés suite à une migration sur gel d'agarose 1,8%, exposition aux UV-C et en découpant les bandes désirées. L'extraction de l'ADN a été établie avec la trousse QIAquick Gel extraction kit (QIAGEN) selon les recommandations du fabricant. La concentration des fragments purifiés a été évaluée par le nannodrop (voir section 1.4.2.1).
1.4.2.3.2 RT-PCR semi-quantitative
Les réactions de RT-PCR semi-quantitative ont été effectuées avec la trousse commerciale de QIAGEN en suivant les recommandations du fabricant. La réaction de transcription « reverse » s'est faite à 60 °C pendant une heure. Le mélange réactionnel était composé de 1 ng d'ARN, le tampon RT (IX), 0,5 mM dNTPs, 1 pM oligo-dT, 10 Unitées d'inhibiteur d'ARNase 4 Unitées Omniscript Reverse Transcriptase. Une fois l'ADNc synthétisé, plusieurs PCRs sont effectuées pour amplifier les gènes BI-1 (amorces : BI-l-F et BI-l-R), BZIPÔO (amorces : BZIP60-Y et BZIP60-R), BIP (amorces : BIP-F et BIP-R), l'actine 2 (amorces : actine2-F et actine2-R) et GUS (trois amorces: M13-48 Rev, GUS Rev 2 et GUS int). Les amorces M13-48 Rev et GUS Rev 2 ont été utilisées pour vérifier l'existence d'un intron au sein de GUS. Par contre l'utilisation des amorces GUS Rev 2 et GUS int avait pour but d'amplifier l'ADNc du gène GUS. Les séquences des amorces utilisées sont présentées au tableau 2.
1.4.2.3.3 Mutation du promoteur de BI-1
La stratégie pour obtenir un promoteur dépourvu du motif ERSE est illustrée à la figure 7. Le fragment de 705 nucleotides correspondant à la région promotrice du locus At5g47120 a été obtenu par PCR telle que décrit précédemment en utilisant p.67-7-01 et pBI-1-02 qui comporte les séquences reconnues par Pstl et BamHl, respectivement. Les fragments de
705 nucleotides correspondant à la région promotrice du gène a été obtenu par PCR tel que décrit précédemment (section 1.4.2.3) en utilisant les amorces pBI-1-01 et pBI-1-02.
Les régions voisines du motif ERSE ont par la suite été amplifiées de façon indépendante. La région en amont de ERSE a été amplifiée avec les amorces p5/-/-01 et pBI-1-03 alors que la région en aval l'a été avec les amorces pBI-1-04 et pBI-1-02. L'amorce pBI-1-03 a été conçue pour qu'elle contienne, à son extrémité 5', 24 nucleotides complémentaires aux 24 nucleotides de l'extrémité 5' de l'amorce pBI-1-04. De cette façon, l'amplicon Pro-Amont (amplifié par pBI-1-01 et pBI-1-03) possède une queue supplémentaire de 24 nucleotides à son extrémité 3' qui peut s'apparier avec l'amplicon Po-Aval, amplifié avec les amorces pBI-1-04 et pBI-1-02. Ces amplicons ont été purifiés d'un gel d'agarose tel que décrit précédemment. Une dernière réaction PCR, avec 50 ng de chaque amplicon, a été ensuite effectuée pour obtenir le promoteur dépourvu de ERSE. Les résultats de l'amplification ont été vérifiés sur gel d'agarose (1,8 %) et par séquençage.
Pro-A»«*t(456$ib) fto-Av^tliljiV) 7 0 5
-48
< €
pBI-1-03 pBI-1-04 pBI-1-02
PCR1 PCR2
PCR.3
" ^ _ pBI-1-02
pBI-1-01
Amorces ^ site de restriction de PstI Site d'homologie A Site de restriction de BamHI
Figure 7 : Stratégie d'amplification utilisée pour l'obtention du promoteur muté (686 pb).
Les boîtes vertes correspondent au site d'homologie entre l'amorce pBI-1-03 et pBI-1-04, les ronds rouge et orange correspondent aux sites de restriction de Pstl et BamHl
respectivement et les flèches bleues correspondent à l'emplacement des amorces au niveau du promoteur.
1.4.2.4 Clonage du promoteur
- Clonage dans pGEMT-easy
Le clonage a été effectué à l'aide de la trousse de pGEM-T easy Vector System (Promega). Ce plasmide a été choisi pour sa facilité de clonage d'amplicons, qui contiennent une adenine à leur extrémité. Le mélange réactionnel est constitué du plasmide et du fragment comprenant le promoteur intact ou muté selon un ratio 1:3, d'un tampon de ligation fourni
