Rôles de la Dual Leucine zipper-bearing Kinase dans la
réorganisation des microtubules et la différenciation
des kératinocytes humains
Thèse
Carolyne Simard-Bisson
Doctorat en biologie cellulaire et moléculaire
Philosophiae Doctor (Ph.D.)Québec, Canada
iii
Résumé
La fonction barrière de la peau dépend en grande partie d’une différenciation appropriée des kératinocytes épidermiques. Au cours de ce processus, de nombreux changements ont lieu dans ces cellules tels que la diminution de la prolifération, le remodelage du cytosquelette, des changements dans l’expression génique, la dégradation du noyau et des organites de même que la formation d’une structure bien particulière : l’enveloppe cornée. Il est important que de tels évènements soient régulés de façon adéquate puisqu’un débalancement au sein de ces derniers peut mener à l’apparition de conditions pathologiques. La Dual Leucine zipper-bearing Kinase (DLK) est une Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase dont l’expression est très forte au niveau de la couche granuleuse, soit la dernière couche de cellules vivantes avant la couche cornée de l’épiderme. Des études précédentes ont révélé que la surexpression de la DLK dans des kératinocytes en culture avait pour effet d’induire la différenciation terminale. Toutefois, les mécanismes par lesquels la DLK régule ce processus restent encore méconnus faisant en sorte que l’objectif général de cette thèse consiste à mieux les définir. L’hypothèse à la base de ces travaux est que la DLK est requise pour la différenciation des kératinocytes et que celle-ci y participe en favorisant la stabilisation des microtubules de même que l’expression ou l’activité de facteurs de transcription impliqués dans ce processus. Dans un premier temps, un modèle de peau reconstruite in vitro dans lequel l’expression de la DLK a été réduite par interférence à l’ARN a été développé. Il a été noté que la diminution de la DLK avait pour effets d’affecter la distribution de protéines de l’enveloppe cornée telles que la filaggrine et la transglutaminase 1 de même que d’inhiber la formation des couches granuleuse et cornée. Des analyses en immunofluorescence et en microscopie électronique ont permis d’observer des défauts au niveau des jonctions serrées et des desmosomes dans les peaux sous-exprimant la DLK révélant un rôle de cette kinase dans le bon maintien de ces deux types de jonctions cellulaires. L’impact de la DLK sur les microtubules a été étudié dans des kératinocytes en culture transduits à l’aide de vecteurs adénoviraux menant à la surexpression de la DLK de même que dans les peaux reconstruites présentant une expression réduite de cette kinase. Ces études ont permis de conclure que la DLK était non seulement en mesure d’induire la réorganisation et la stabilisation des microtubules en périphérie cellulaire, mais que celle-ci était également requise à la réalisation de ces processus. Afin de mieux décrire les mécanismes par lesquels la DLK assure la réorganisation des microtubules en périphérie cellulaire, les effets de la surexpression ou de la sous-expression de la DLK sur les protéines LIS1 et HSP27 (pour Heat shock protein 27 kDa), des régulateurs de la distribution des microtubules, ont été étudiés. Ces analyses ont permis de définir la DLK en tant qu’élément nécessaire à la bonne distribution en périphérie cellulaire de LIS1 et HSP27.
iv
l’insolubilisation et la phosphorylation de cette protéine de choc thermique. Il a également été démontré que l’ensemble de ces processus dépendaient de l’activité de ERK (pour Extracellular-signal Regulated Kinase).
Dans le but de définir l’importance des microtubules dans le processus de différenciation des kératinocytes, des peaux reconstruites ont été traitées avec un agent induisant la dépolymérisation de cette composante cytosquelettique soit plus précisément le nocodazole. Un tel traitement produit un phénotype similaire à celui des peaux reconstruites sous-exprimant la DLK suggérant les microtubules comme d’importants effecteurs de la différenciation induite par la DLK. Dans la perspective de mieux définir les effets de la DLK sur la signalisation cellulaire et l’expression génique globale, nous avons eu recours à l’étude de la phosphorylation d’importants médiateurs de la signalisation moléculaire intracellulaire de même qu’à des analyses en micropuce à ADN d’échantillons provenant de peaux reconstruites sous-exprimant la DLK. Cette démarche a permis de révéler une hausse de la phosphorylation de ERK1/2, de JNK1/2/3, de GSK3 (pour Glycogene Synthase Kinase 1) et du récepteur à l’EGF (pour Epidermal Growth Factor). Les analyses en micropuce à ADN ont permis de révéler une réduction dans l’expression de nombreux gènes impliqués dans la formation de l’enveloppe cornée. Finalement, la réduction de c-Jun et de C/EBPα a pu être observée dans les noyaux de peaux reconstruites sous-exprimant la DLK révélant ainsi l’importance de cette kinase dans la régulation de ces facteurs de transcription dans un contexte de différenciation des kératinocytes. Globalement, nos travaux montrent que la DLK est requise pour la différenciation des kératinocytes et que celle-ci y contribue en assurant la réorganisation des microtubules en périphérie cellulaire, la consolidation des desmosomes et des jonctions serrées de même la régulation positive des facteurs c-Jun et C/EBPα.
v
Abstract
Skin barrier function greatly depends on proper keratinocyte differentiation in the epidermis. During this process, many changes occur within the cell such as decrease in cell proliferation, cytoskeleton reorganization, changes in gene expression, nucleus and organelles elimination as well as cornified envelope formation. Keratinocyte differentiation must be finely orchestrated since misregulation of this process may lead to pathological conditions. The Dual Leucine zipper-bearing Kinase (DLK) is a Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase showing a strong expression in the granular layer, the last layer composed of living cells before reaching the cornified layer. Previous studies revealed DLK capacity to induce keratinocyte terminal differentiation process. However, how DLK promotes such an event remains unknown. The main objective of this thesis is to identify mechanisms and potential effectors of the DLK-induced keratinocyte differentiation. Our hypothesis is that DLK is required for keratinocyte differentiation by promoting microtubule stabilization as well as the expression or the activity of transcription factors involved in this process. In order to test our hypothesis, a tissue-engineered skin (TES) model with a reduced DLK expression was produced using a RNA interference approach. Impaired distribution of cornified envelope proteins such as filaggrin and transglutaminase 1 as well as reduced granular and cornified layers were observed in TES with reduced DLK expression. In those samples, immunofluorescence and electron microscopy analyses pointed out desmosomal and tight junctional defects suggesting a role for DLK in the maintenance of these types of cell junctions. The impact of DLK expression on microtubules was also studied in TES with reduced DLK expression and in keratinocytes in culture overexpressing DLK following gene transduction using adenoviral vectors. These studies led to the conclusion that DLK not only promotes but is also required for microtubules reorganization and stabilization to cell periphery. To explain DLK capacity to induce such a process, effects of DLK depletion or overexpression on microtubule regulators such as LIS1 and HSP27 were investigated by immunofluorescence staining. These analyses revealed that DLK induces and is required for LIS1 and HSP27 relocalization to cell periphery. In additional studies, our results show that DLK expression in normal human keratinocytes in culture not only promotes HSP27 distribution to cell periphery but also induces HSP27 insolubilization and phosphorylation in an ERK-dependent manner. In order to more precisely define the role of microtubules in keratinocyte differentiation process, TES were treated with nocodazole, a microtubule depolymerizing agent. The effect of such a treatment was to reproduce the phenotype of DLK-depleted TES suggesting that microtubules are important effectors of DLK-induced keratinocyte differentiation.
vi
coding for cornified envelope proteins. Reductions of c-Jun and C/EBPα immunofluorescence staining were also noted in TES with a reduced DLK expression suggesting this kinase as a c-Jun and C/EBPα regulator in the context of keratinocyte differentiation. Globally, our works show that DLK is required for keratinocyte differentiation since it promotes microtubule reorganization to cell periphery, desmosomes and tight junction consolidation as well as c-Jun and C/EBPα localization to the nucleus.
vii
Table des matières
Résumé ... iii
Abstract ... v
Table des matières ... vii
Liste des tableaux ... x
Liste des figures ... xi
Liste des abréviations ... xiv
Remerciements ... xx
Avant-propos ... xxi
Chapitre 1 : Introduction ... 1
1.1 La peau ... 1
1.1.1 Structure et fonction de la peau ... 1
1.1.2 Structure de l’épiderme et différenciation des kératinocytes ... 2
1.1.2.1 Composition de l’enveloppe cornée ... 4
1.1.2.2 Assemblage de l’enveloppe cornée par les transglutaminases ... 7
1.1.2.3 Étapes de formation de l’enveloppe cornée ... 11
1.2 Le remodelage du cytosquelette au cours de la différenciation des kératinocytes ... 13
1.2.1 Facteurs régulant la stabilité et la localisation des microtubules ... 15
1.2.1.1 Les modifications post-traductionnelles des tubulines ... 15
1.2.1.2 Protéines régulant la stabilité et la localisation des microtubules ... 19
1.2.1.3 Les agents pharmacologiques ... 21
1.3 Les jonctions cellulaires d’adhésion dans la différenciation des kératinocytes ... 22
1.3.1 Les jonctions adhérentes ... 23
1.3.2 Les jonctions serrées ... 24
1.3.3 Les desmosomes ... 25
1.3.4 Les cornéodesmosomes ... 28
1.4 Voies de signalisation impliquées dans la différenciation des kératinocytes ... 29
1.4.1 Le calcium ... 29
1.4.2 L’acide rétinoïque, la vitamine D et les acides gras : le rôle des récepteurs hormonaux ... 31
1.4.3 Les sentiers des MAPK ... 32
1.4.4 Les facteurs de transcription ... 33
1.5 La Dual Leucine zipper-bearing Kinase (DLK) ... 37
1.5.1 Activité catalytique et régulation de la DLK ... 38
1.5.2 Expression et fonctions de la DLK ... 39
1.5.3 La DLK et la différenciation des kératinocytes humains ... 41
viii
2.1 Résumé ... 44
2.2 DLK promotes keratinocyte differentiation by inducing microtubule reorganization to cell periphery ... 45
Abstract ... 46
Introduction ... 47
Results ... 48
Discussion ... 61
Material and methods ... 64
Acknowledgements ... 68
References ... 69
Supplemental material ... 73
Chapitre 3 : La petite protéine de choc thermique HSP27 subit une phosphorylation et une redistribution au cytosquelette dépendante de la voie ERK en réponse à l’expression de la Dual Leucine zipper-bearing Kinase ... 77
3.1 Résumé ... 78
3.2 The Small Heat-Shock Protein HSP27 Undergoes ERK-Dependent Phosphorylation and Redistribution to the cytoskeleton in Response to Dual Leucine Zipper-Bearing Kinase Expression ... 79
Abstract ... 80
Introduction ... 81
Results ... 83
Discussion ... 94
Material and methods ... 97
Conflict of Interest ... 99
Acknowlegments ... 99
References ... 100
Chapitre 4 : Une baisse d’expression de la DLK dans des peaux reconstruites par génie tissulaire affecte c-Jun, C/EBPα, les voies MAPK et l’expression de gènes codant pour des protéines de l’enveloppe cornée. ... 104
4.1 Résumé ... 105
4.2 DLK depletion in tissue engineered skin affects c-Jun, C/EBPα, MAPK pathways and late cornified envelope gene expression ... 106
Abstract ... 107
Introduction ... 108
Results ... 109
Discussion ... 115
Material and methods ... 117
Conflict of interest ... 120
Acknowlegments ... 120
References ... 121
ix
Chapitre 5 : Discussion générale ... 132
5.1 La DLK et la régulation des microtubules dans la différenciation des kératinocytes ... 132
5.2 Les microtubules et la différenciation des kératinocytes ... 139
5.3 La DLK et la régulation génique ... 141
5.4 La régulation de la DLK ... 146
5.5 Conclusion générale et portées significatives ... 149
6. Bibliographie ... 150
Annexe 1: Le criblage génétique fonctionnel identifie la DLK en tant que régulateur clé dans la mort des cellules ganglionnaires de la rétine ... 189
Annexe 2 : Les fibroblastes dermiques humains irradiés sont aussi efficaces que les fibroblastes murins en tant que couche nourricière dans l’amélioration de la durée de vie des cultures de cellules épidermiques humaines ... 190
Annexe 3 : Génie tissulaire de la peau et de la cornée ... 191
Annexe 4: Identification in vitro et in vivo des cellules souches épithéliales avec la kératine 19 et le BrdU ... 192
x
Tableau 1.1 : Caractéristiques et expression des principaux constituants de l’enveloppe cornée 6 Tableau 1.2 : Appellations, activité, expression et localisation des transglutaminases chez l’humain 8 Tableau 1.3 : Expression, activation et substrats des transglutaminases épidermiques ... 9 Tableau 1.4 : Résumé de pathologies congénitales associées à la présence de mutations
ou au ciblage (maladies auto-immunes) de protéines exprimées au niveau
de l’épiderme ... 11 Tableau 1.5 : Résumé de la structure, des propriétés, de la composition et des fonctions
des différents types de cytosquelettes de la cellule ... 14 Tableau 1.6 : Tableau récapitulatif des différentes modifications post-traductionnelles des
microtubules incluant leurs caractéristiques (s’il s’agit de modifications réversibles ou spécifiques aux microtubules), le type de structure ou de cellules dans lesquelles il est possible de les observer et leurs rôles ... 17 Tableau 1.7 : Résumé des protéines interagissant avec les microtubules, de leurs propriétés
et de leurs rôles ... 20 Tableau 1.8 : Expression, activation et effets des principales isoformes de PKC dans l’épiderme 31 Tableau 1.9 : Principaux facteurs de transcription impliqués dans la différenciation épidermique 34 Tableau 1.10 : Résumé des mécanismes de régulation de la DLK et des molécules impliquées 38 Tableau supplémentaire 4.1 : Biological functions of the proteins encoded by the differentially
expressed genes in TES Empty LV, shCtl and shDLK ... 124 Tableau supplémentaire 4.2: DNA sequence of the primers for qPCR analyses ... 131
xi
Liste des figures
Figure 1.1 : Illustration de la peau et de ses différentes composantes ... 2
Figure 1.2 : Couches, composantes et caractéristiques de l’épiderme ... 4
Figure 1.3 : Schéma illustrant les principales composantes et caractéristiques de l’épiderme 5
Figure 1.4 : Illustration des étapes d’assemblage de l’enveloppe cornée ... 12
Figure 1.5 : Illustration des différentes composantes cytosquelettiques et leur localisation dans la cellule ... 13
Figure 1.6 : Schématisation du processus de polymérisation des microtubules ... 16
Figure 1.7 : Illustration des principales modifications post-traductionnelles des microtubules et des enzymes qui y sont impliquées ... 18
Figure 1.8 : Schématisation de la réorganisation des microtubules pendant la différenciation des kératinocytes ... 21
Figure 1.9 : Localisation des jonctions cellulaires à travers les différentes couches épidermiques 22 Figure 1.10 : Structure et composition générale des jonctions adhérentes ... 23
Figure 1.11 : Morphologie et structure des jonctions serrées ... 24
Figure 1.12 : Schéma de l’expression de protéines des jonctions serrées à travers les différentes couches épidermiques ... 25
Figure 1.13 : Structure et composition des desmosomes ... 26
Figure 1.14 : Expression des cadhérines desmosomales à travers les différentes couches épidermiques ... 27
Figure 1.15 : Schéma de la voie de signalisation impliquant le calcium ... 30
Figure 1.16 : Résumé des trois principales voies des MAPK (ERK, JNK et p38) ... 32
Figure 1.17 : Structure et composition du facteur de transcription AP-1 ... 35
Figure 1.18 : Expression des différentes composantes d’AP-1 en fonction du stade de différenciation des kératinocytes dans des équivalents cutanés en culture par rapport à l’épiderme normal ... 35
Figure 1.19 : Présentation schématique des domaines composant les membres de la famille des MLK ... 37
xii
Figure 2.2: MT reorganization to cell periphery and keratinocyte differentiation are altered
in TES with a reduced DLK expression ... 52
Figure 2.3: Desmosomes and tight junctions are altered in TES with a reduced DLK expression. 54 Figure 2.4: Dlk knockout mouse embryos show cornified layer fragility as well as disturbed MT and desmoplakine localization ... 55
Figure 2.5: Nocodazole treatment of TES affects MT reorganization to cell periphery and keratinocyte differentiation ... 56
Figure 2.6: Nocodazole treatment of TES affects tight junctions and desmosomes ... 57
Figure 2.7: Transglutaminase 1 colocalizes and precipitates with MT ... 59
Figure 2.8: DLK affects the distribution of proteins involved in MT reorganization ... 60
Figure 2.S1: DLK, keratin, transglutaminase activity and desmoglein 1 staining in shDLK TES . 73
Figure 2.S2: Proliferation is reduced whereas cell metabolic activity is maintained in shDLK and nocodazole treated TES ... 74
Figure 2.S3: Paclitaxel treatment of TES alters cell proliferation and organization and induces keratinocyte differentiation ... 75
Figure 2.S4: HSP27 distribution to cell periphery is altered in nocodazole treated TES. ... 76
Figure 3.1: Dynamics of HSP27 in keratinocyte differentiation ... 85
Figure 3.2: DLK expression and HSP27 distribution in human reconstructed skin ... 86
Figure 3.3: Insolubilization of HSP27 by DLK expression in normal human and HaCaT keratinocytes ... 87
Figure 3.4: Redistribution of HSP27 to the cytoskeletal fraction in DLK expressing cells is not dependent on transglutaminase activity ... 90
Figure 3.5: DLK expression induces ERK and JNK activation in normal human keratinocytes ... 91
Figure 3.6: DLK expression promotes ERK-dependent insolubilization and phosphorylation of HSP27 ... 92
Figure 3.7: DLK expression induces HSP27 relocalization to the cell periphery in an ERK- dependent manner ... 93
Figure 4.1: Reduction of DLK expression in shDLK TES ... 109
xiii
Figure 4.3: Comparative microarray analysis of empty LV, shCtl and shDLK TES ... 111
Figure 4.4: Reduction of DLK expression in TES impairs c-Jun localization to the nucleus ... 112
Figure 4.5: DLK expression in NHK induces c-Jun phosphorylation in the nucleus ... 114
Figure 4.6: shDLK TES show lower levels of C/EBPα ... 114
Figure 5.1 : JIP1, ses protéines associées DLK, MKK7 et JNK, ApoER2 et Dab-1 forment un complexe dont le transport est assuré par les kinésines ... 137
Figure 5.2 : Modèle de signalisation de Reelin ... 137
Figure 5.3 : Résumé des mécanismes par lesquels la DLK intervient dans le processus de différenciation des kératinocytes ... 145
Figure 5.4 : Résumé des facteurs régulant et régulés par la DLK et modèle de l’activité de la DLK en fonction du stade de différenciation des kératinocytes ... 147
xiv
Précisions sur la nomenclature des gènes et des protéines : les noms de gènes sont indiqués en italique alors que ceux des protéines sont écrits en lettres droites. Les noms des gènes et les acronymes ou abréviations pour identifier les protéines de souris sont en lettres minuscules alors que ceux des humains sont en majuscules.
ABCA12 : ATP binding cassette Subfamily A member 12 (Protéine à casette de fixation à l’ATP sous-famille A membre 12)
Ac : anticorps
ACER1 : Céramidase alcaline 1
ACF7: Actin cross-linking factor 7 (Facteur d’interliaison à l’actine 7) Actub : α-tubuline acétylée
AdDLK : Vecteur adénoviral contenant une séquence codant pour la DLK et la GFP. AdGFP : Vecteur adénoviral contenant une séquence codant pour la GFP.
ADN: Acide désoxyribonucléique/Deoxyribonucleic Acid A/L : Air-liquide
ALDOC : Fructose-biphosphate aldolase C AP-1 : Activator protein 1 (Protéine activatrice 1)
APC : Anaphase promoting complex (Complexe de promotion de l’anaphase) APOD : Apolipoprotéine D
ApoER2 : Apolipoprotein E receptor 2 (Récepteur à l’apolipoprotéine E 2) ARN : Acide ribonucléique
Arnt : Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (Récepteur de translocation nucléaire aryle hydrocarbone)
α-TAT: α-tubuline acétyltransférase
ATF : Activating Transcription Factor (Facteur de transcription activateur) ATP : Adénosine tri-phosphate
ATP2A2 : Calcium transporting ATPase sarcoplasmic reticulum type 2 (ATPase de transport de calcium de type réticulum sarcoplasmique 2)
ATP2C1 : Calcium transporting ATPase type 2 member 1 (ATPase de transport de calcium type 2 membre 1) ATP6/8 : ATPase protéine 6/8
BD : Binding Domain (Domaine de liaison) BLMH : Bléomycine hydrolase
BrdU : 5-bromo-2-déoxyuridine Ca : Calcium
CaR: Calcium Sensing Receptor (Récepteur sensible au calcium) CCP: Cytoplasmic Carboxypeptidase (Carboxypeptidase cytoplasmique) CDSN : Cornéodesmosine
C/EBP: CCAAT-Enhancer Binding Protein (Protéine d’amplification de la liaison au motif CCAAT)
CIF : Cytoskeleton-enriched insoluble fraction (Fraction insoluble enrichie en composantes cytosquelettiques) CLDN4 : Claudine 4
xv CREB:Cyclic adenosine monophosphate responsive element binding protein (Protéine de liaison à l’élément répondant à l’adénosine monophosphate cyclique)
CRIB: Cdc42/Rac Interactive Binding domain (Domaine de liaison interactive Cdc42/Rac) Crk : Molecule adaptatrice Crk
Ctl : Contrôle
CRISPR : Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (Courtes répétitions palindromiques regroupées et régulièrement espacées)
CYTB : Cytochrome B Dab-1 : Disabled homolog 1 DAG: Diacylglycérol
DAPL1 : Death associated protein like 1 (Protéine apparentée à la protéine associée à la mort type 1) DCX : Doublecortine
DIC : Differential interference contrast (Contraste à interférence différentielle) DLK: Dual Leucine zipper-bearing Kinase (Kinase à deux motifs leucine zipper) DMEM : Dulbecco Modified Eagle Medium (Milieu Dulbecco modifié par Eagle) DMSO : Diméthylsulfoxyde
DNA : Deoxyribonucleic Acid (Acide désoxyribonucléique) DSC: Desmocolline
DSG: Desmogléine DP: Desmoplakine
e19 : Jour 19 à l’état embryonnaire
EB : End binding protein (protéine de liaison aux extrémités) EC : Enveloppe cornée
ECL : Enhanced Chemiluminescence (Chemiluminescence augmentée)
EDC: Epidermal Differentiation Complex (Complexe de différenciation épidermique) EGF: Epidermal Growth Factor (Facteur de croissance épidermique)
EGFR: Epidermal Growth Factor Receptor (Récepteur du facteur de croissance épidermique) Egr1: Early Growth Response protein 1 (Protéine de prolifération précoce 1)
ELF3: E74-like factor 3 (Facteur 3 apparenté à E74)
ELOVL3 : Elongation of very long chain fatty acids protein 3 (Protéine d’élongation d’acides gras à chaîne très longue de type 3)
ERK: Extracellular-signal Regulated Kinase (Kinase régulée par un signal extracelllulaire) Ext : Extrémité
FI : Filaments intermédiaires Fig. : Figure
FRA: Fos Related Antigen (Antigène similaire à Fos) GAPDH: Glyceraldéhyde-3-Phosphate Déhydrogenase GDP : Guanosine diphosphate
GEO : Gene Expression Omnibus
GFP : Green Fluorescent Protein (Protéine fluorescente verte)
Grhl3 : Grainyhead like protein 3 homolog (homologue 3 de la protéine apparentée à grainyhead) GSK3 : Glycogene Synthase Kinase 3 (kinase de la glycogène synthase 3)
GTP : Guanosine Triphosphate HDAC: Histone déacétylase
xvi
IP3 : Inositol triphosphate kDa: Kilodalton
KLF4 : Krueppel-like factor 4 (Protéine 4 apparentée au facteur de Krueppel) KO : Knockout (inactivation constitutive d’un gène)
cKO : conditional knockout (inactivation conditionnelle d’un gène)
JIP: c-Jun N-terminal kinase-Interacting Protein (Protéine interagissant avec la kinase N-terminal c-Jun) JNK: c-Jun N-terminal Kinase (Kinase N-terminal c-Jun)
K: Kératine
KHC : Kinesin heavy chain (Chaîne lourde de la kinésine) KLC : Kinesin light chain (Chaîne légère de la kinésine) KRT : Gène codant pour un type de kératine
LCE : Late Cornified Envelope protein (Protéine de l’enveloppe cornée tardive) LIS1: Protéine reliée à la lissencéphalie 1
LV : Lentiviral Vector (Vecteur lentiviral) LZ: Leucine Zipper (fermeture à leucine)
LZK: Leucine Zipper-bearing Kinase (Kinase à domaine fermeture leucine) mAb : Anticorps monoclonal
MAP: Microtubule-associated protein (Protéine associée aux microtubules)
MAP1B: Microtubule-associated protein 1B (Protéine associée aux microtubules 1B) MAPK: Mitogen-Activated Protein Kinase (Protéine kinase activée par des mitogènes)
MAP3K: Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase (Protéine kinase kinase kinase activée par des mitogènes)
MCAK: Mitotic centromere associated kinesin (Kinésine associée au centromère mitotique) MEC: Matrice extracellulaire
MEK1 : MAPK/ERK kinase 1
MEKK : Autre appellation des MAP3K
MIAME: Minimal information about a microarray experiment (Information minimale à propos d’une expérience de puce à ADN)
MLK: Mixed-Lineage Kinase (Kinase d’origine variée)
MK2/3: Mitogen-activated protein kinase activated kinase 2/3 (Kinase de type 2/3 activée par une kinase induite par des mitogènes de type 2/3)
MKK: Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase (Protéine kinase kinase activée par des mitogènes) mNudE : Nuclear distribution protein NudE homolog 1 (protéine distribution nucléaire homologue à NudE 1) MOI : Multiplicity of Infection (Multiplicité d’infection)
MT: Microtubules
MTOC : Microtubule organizing center (Centre organisateur des microtubules) MTT : Bromure de méthylthiazolyldiphényl- tetrazolium
MyoD: Myoblast Determination protein 1 (Protéine de determination des myoblastes) Na+/K+ ATPase : Pompe à sodium-potassium
NADH : Nicotinamide adénine dinucléotide
NCBI : National center for biotechnology information Nck : Protéine cytoplasmique Nck
xvii ND : NADH déshydrogénase:
NDE1 : Nuclear distribution protein nudE homolog 1 (Protéine 1 de distribution nucléaire homologue à nudE) NFaT: Nuclear Factor of activated T-cells (Facteur nucléaire activé dans les cellules T)
nm: Nanomètre
NHK : Normal human keratinocytes (Kératinocytes humains normaux) noc : Nocodazole
N-WASP : neuronal Wiskott–Aldrich Syndrome protein (protéine neuronale du syndrome de Wiskott-Aldrich) PBS : Phosphate-buffered saline (Tampon phosphate salin)
PCR : Polymerase chain reaction (Réaction en chaîne par polymérase)
PDGF : Platelet-Derived Growth Factor (Facteur de croissance dérivé des plaquettes) PG : Plakoglobine
PI3K: Phosphoinositide 3-kinase
PIP2: Phosphatidylinositol-4,5-diphosphate PKC: Protéine Kinase C
PKP : Plakophiline PLC: Phospholipase C
PPAR: Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (Récepteurs activés par les proliférateurs de peroxysomes)
PS: Phosphatidyl Sérine
qRT-PCR : Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (Transcription inverse suivie d’une réaction en chaîne par polymérase quantitative)
RE : Réticulum endoplasmique
SASpase : Skin-specific retroviral-like aspartic protease (Protéase aspartique apparentée aux rétrovirus et spécifique à la peau)
SD : Standard deviation (écart-type)
SFK : SRC-family kinase (kinase de la famille SRC) shRNA : ARN interférent en tête d’épingle
rhoGEF= Rho Guanine nucleotide Exchange Factor (Facteur d’échange de guanine Rho) RMA : Robust multiarray analysis
SAM: Sterile α-Motif (Motif sterile α)
SH3: SRC Homology 3 domain (troisième domaine homologue à SRC) SIRT2: Sirtuine 2
Sp : Specificity protein (Protéine de spécificité)
SPRR: Small Proline Rich proteins (Petites protéines riches en proline)
STOP : Stable Tubule-Only Polypeptide (Polypeptide spécifique aux microtubules stables) STIM1 : Stromal interaction molecule 1 (Molécule d’interaction stromale 1)
TA : Transactivating Module
TES : Tissue Engineered Skin (Peau reconstruite par génie tissulaire) TGM: Transglutaminase
TIG3: Tazarotene-Induced Gene 3 (Gène induit par le tazarotène)
+TIP: Microtubule plus end tracking protein (Protéine de pistage des extrémités positives des microtubules) TMRC : Tétraméthylrhodamine cadavérine
TTL: Tubuline Tyrosine Ligase
xviii
VLDLR : very-low-density-lipoprotein receptor (Récepteur de lipoprotéines à très faible densité) w/o : Without (sans)
XMAP215 : Microtubule Associated Protein 215 kDa (Protéine associée aux microtubules de 215 kDa) ZAK: Zipper sterile α-motif Kinase (Kinase à motif sterile α)
xix
À la douce mémoire de Jocelyne (1959-2008)
« Parce que le plus important est de
faire ce que l’on aime dans la vie… »
xx
Plusieurs personnes ont contribué à ces travaux et je tiens à les remercier chaleureusement. Tout d’abord, merci à ma directrice de recherche, Dre Lucie Germain, de m’avoir accueillie dans son équipe et de m’avoir confié ce projet pour lequel j’ai eu beaucoup d’intérêt pendant de nombreuses années. Merci de sa patience et de sa grande compréhension face à ma situation familiale. Merci aussi à l’infatigable, perspicace et pertinente Danielle Larouche pour toutes ses heures passées à faire des extractions de kératines, à peaufiner des textes jusqu’aux moindres détails ou à discuter d’impasses ou de succès expérimentaux. Merci à vous deux pour tous vos précieux conseils si généreusement partagés.
Merci à mon co-directeur, Dr Richard Blouin pour son aide et ses précieux conseils de même qu’à ses étudiants, Gabriel Lachance et Jean-Philippe Couture, pour leur collaboration au projet. Merci aussi au Dr Rénald Gilbert et à Mehdi Bendjelloul qui m’ont accueillie et aidée lors de mon passage à l’Institut de Recherche en Biotechnologie de Montréal. Un énorme merci aussi au Dr Sylvain Guérin et à son équipe, plus particulièrement à Karine Zaniolo pour sa redoutable efficacité. Je tiens également à remercier Sébastien Larochelle qui, de par ses grandes connaissances et sa grande rigueur, m’a aidée, à plusieurs reprises, à sortir d’impasses de biologie moléculaire.
Pendant mes études doctorales, j’ai eu la chance de superviser deux merveilleuses stagiaires : Éloïse Rochefort et Julie Bidoggia. Vous avez été extraordinaires et je vous remercie pour votre dévouement à la cause de la DLK. Je salue aussi les membres passés et présents de mon équipe. Merci à Hubert Robitaille pour ton travail de défricheur et l’aide que tu m’as apportée à mes débuts. Merci Claudia Fugère, la supermaman toujours prête à aider les autres. Merci Israël Martel pour tous ces délires psycho-politico-socio-scientifico-philosophiques fort divertissants. Merci à Amélie Lavoie et Amélie Morissette, ces femmes fortes capables de tout faire! Merci à mes collègues Benjamin Goyer et Francis Bisson pour leur aide. Je salue aussi tous mes collègues loexiens en particulier Alexandre Thibodeau, Alexandre Rousseau, Véronique Racine, Lydia Touzel-Deschênes et Lorraine-Andrée Parent pour la joie qu’ils apportent quotidiennement au labo. Je profite de cette tribune pour souligner le travail de toutes ces éducatrices en garderie qui font un travail admirable à tous les jours. À toutes ces Diane, Céline, Mélanie, Danielle, Johanne, Isabelle, Véronique et Viviane : merci. Merci aussi à ma tendre moitié, Marc-André, pour sa grande patience et son support. Merci à mes parents d’avoir beaucoup investi dans mes rêves et d’y avoir cru.
Finalement, merci au Fonds Québécois en Recherche en Santé pour le précieux support qu’il m’a offert pendant de nombreuses années.
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Avant-propos
Les travaux présentés dans le cadre de cette thèse ont mené à la production de trois articles. Le premier (voir chapitre 2) est présentement en révision pour une publication dans la revue Journal of Cell Science et a pour titre DLK promotes keratinocyte differentiation by inducing microtubule reorganization to cell periphery. Le second (voir chapitre 3), intitulé The Small Heat-Shock Protein HSP27 Undergoes ERK-Dependent Phosphorylation and Redistribution to the Cytoskeleton in Response to Dual Leucine Zipper-Bearing Kinase Expression a été publié en 2010 dans la revue Journal of Investigative Dermatology. Le dernier article présenté au chapitre 4, sera quant à lui bientôt soumis à la revue Journal of Investigative Dermatology avec pour titre DLK depletion in tissue engineered skin affects c-Jun, C/EBPα, MAPK pathways and late cornified envelope gene expression.
Pendant mon parcours académique, j’ai également contribué à la réalisation de deux autres articles scientifiques publiés dans Proceedings of the National Academy of Sciences et dans l’International Journal of Molecular Sciences de même qu’à la rédaction d’une revue de littérature et d’un chapitre de livre. Les résumés de ces travaux sont présentés en annexe de cette thèse.
1
Chapitre 1 : Introduction
La barrière cutanée est une structure cruciale puisque celle-ci protège l’organisme contre les agressions extérieures. La formation d’une telle barrière nécessite la différenciation des cellules constituant principalement l’épiderme : les kératinocytes. Toutefois, dans certaines pathologies telles que le psoriasis et les ichtyoses, ce processus est altéré et affecte grandement la qualité de vie des personnes atteintes. Les causes et les traitements pour certaines de ces maladies ne sont pas encore connus. Dans ce contexte, il est nécessaire de poursuivre des études qui mèneront à une meilleure connaissance des mécanismes impliqués dans la formation de la barrière cutanée. L’objectif global des travaux de cette thèse était donc de mieux comprendre la différenciation des kératinocytes et surtout, le rôle d’une kinase épidermique encore méconnue, la DLK, au sein de ce processus. En guise d’introduction, les différentes modifications structurales qui ont lieu au sein des kératinocytes lors de leur différenciation ainsi que les connaissances actuelles sur les voies de signalisation impliquées seront brièvement décrites. Ceci sera suivi d’une synthèse des connaissances actuelles concernant les effets de la DLK sur les microtubules et sur divers facteurs de transcription qui s’avèrent avoir un potentiel d’action dans la différenciation des kératinocytes.
1.1 La peau
1.1.1 Structure et fonction de la peau
La peau, avec sa superficie allant de 1,2 à 2 m2 chez l’humain [1], est un organe crucial dans la protection de
l’organisme face à son environnement [2]. Celle-ci peut être divisée en trois principales couches : l’hypoderme, le derme et l’épiderme (voir figure 1.1). La plus profonde, l’hypoderme, est principalement constituée de cellules adipeuses lui conférant ainsi des fonctions de thermorégulation, de réserve d’énergie et de protection contre le froid et les chocs mécaniques. Le derme est un tissu conjonctif riche en matrice extracellulaire principalement produite par les fibroblastes et qui confère des propriétés de souplesse et d’élasticité à la peau [3]. Le derme renferme également de nombreuses annexes cutanées responsables des fonctions de perception (corpuscules de Meissner et de Pacini), de thermorégulation (glandes sudoripares, follicules pileux) et de protection (glandes sébacées) de la peau [3]. Il s’agit de la dernière couche de la peau à être traversée par les nerfs, les vaisseaux lymphatiques et les vaisseaux sanguins. La couche la plus superficielle, l’épiderme, est celle qui assure en grande partie la fonction barrière de la peau. Elle comprend divers types cellulaires tels que les mélanocytes, responsables de la pigmentation et de la protection de l’organisme face aux ultraviolets, les cellules de Merkel, impliquées dans la perception sensorielle, et les cellules de Langerhans, qui participent à la réponse immunitaire cutanée. Ce sont toutefois les kératinocytes qui composent à 90% l’épiderme [3].
2
Figure 1.1: Illustration de la peau et de ses différentes composantes. La peau humaine contient trois couches : l’hypoderme, le derme et l’épiderme. Alors que l’hypoderme est principalement constitué de tissu adipeux, le derme renferme de nombreuses annexes cutanées telles que les follicules pileux, les glandes sébacées et sudoripares de même que des récepteurs destinés à la perception sensorielle tels que les corpuscules de Pacini et de Meissner. L’épiderme est la couche la plus superficielle de la peau et n’est pas irriguée par les vaisseaux sanguins. Figure adaptée de [1]. Réimprimé sous la permission de Pearson Education, Inc., Upper Saddle River, NJ.
1.1.2 Structure de l’épiderme et différenciation des kératinocytes
Les kératinocytes de l’épiderme s’empilent en plusieurs couches et forment un épithélium pavimenteux stratifié qui, en dehors des zones palmo-plantaires, fait environ 50 à 100 µm d’épaisseur chez l’humain et de 10 à 15 µm chez la souris [4]. Les kératinocytes subissent un cycle constant d’auto-renouvellement d’une durée approximative de 28 jours impliquant des processus de prolifération, de différenciation et d’élimination des kératinocytes par desquamation [5]. Le renouvellement de l’épiderme est assuré par la présence de cellules souches épidermiques qui peuvent être identifiées à l’aide de la kératine 19 et du BrdU (pour 5-bromo-2-déoxyuridine) (voir annexe 4).
3 Au cours du processus de différenciation, les profils morphologique, structural et protéomique des cellules sont grandement modifiés. Ce sont entre autres ces changements au niveau de l’apparence morphologique des cellules qui ont mené à la division de l’épiderme en quatre couches : basale, épineuse, granuleuse et cornée (figure 1.2). Ces différentes couches de l’épiderme humain de même que leurs caractéristiques seront brièvement passées en revue au cours de cette section.
À la base de l’épiderme, se trouve une couche d’une cellule d’épaisseur nommée couche basale. Ces cellules se démarquent par leur capacité de prolifération et ce sont donc elles qui assurent l’auto-renouvellement constant de l’épiderme. Toutefois, certaines de ces cellules finissent par se décrocher de la membrane basilaire marquant ainsi le début du programme de différenciation [6-8]. Les cellules se détachant de la membrane basilaire entrent alors dans la couche épineuse : une couche de cinq à huit cellules d’épaisseur où débute une phase de différenciation précoce. Le nom de cette couche fait référence à l’apparence « épineuse » des cellules qui la composent provoquée par la formation de nombreux desmosomes entre celles-ci. En plus de former de nombreuses jonctions cellulaires, les cellules de la couche épineuse subissent des réarrangements cytosquelettiques importants et débutent l’expression de protéines qui seront plus tard impliquées dans la formation de l’enveloppe cornée (figure 1.3). Certaines de ces protéines, comme la filaggrine et la loricrine, sont accumulées sous forme de granules dites «de kératohyaline» dans les cellules de la couche suivante appelée couche «granuleuse» [9]. Cette couche, de deux à trois cellules d’épaisseur, est la dernière strate contenant des cellules vivantes et c’est à cet endroit qu’a lieu une phase de différenciation dite tardive. Lors de la transition entre les couches granuleuse et cornée, les cellules subissent une série de modifications drastiques telles que la formation d’une enveloppe cornée sous leur membrane plasmique de même que la dégradation de leurs organites et de leur noyau [2]. Ces processus provoquent la mort des cellules alors appelées cornéocytes. Morphologiquement parlant, un cornéocyte consiste principalement en un squelette cellulaire enrichi de filaments intermédiaires de kératine entourés d’un amalgame complexe de protéines hautement liées les unes aux autres et baignant dans une couche de lipides hydrophobes [2, 8, 10, 11]. Au sein de la couche cornée, les cornéocytes sont solidement reliés les uns aux autres par des structures spécialisées appelées cornéodesmosomes (voir section 1.3.4) [2]. La couche cornée est fréquemment comparée à un mur où les cornéocytes sont représentés par les briques et les lipides intercellulaires par le mortier [12]. Cette comparaison s’applique également d’un point de vue fonctionnel puisque la couche cornée représente une barrière étanche séparant l’organisme de son environnement.
4
1.1.2.1 Composition de l’enveloppe cornée
La formation de la couche cornée est un processus qui requiert l’assemblage de l’enveloppe cornée : une structure protéique solide et hautement insoluble de 15 nm d’épaisseur élaborée sous la membrane plasmique des kératinocytes. À cette enveloppe sont également incorporés des lipides menant à la formation d’une enveloppe hydrophobe autour des cornéocytes [13]. Alors que la composition plus détaillée de l’enveloppe cornée fera l’objet de ce segment, les enzymes impliquées dans l’assemblage et les différentes étapes de la formation de l’enveloppe cornée seront abordées au cours des sections suivantes.
Figure 1.2 : Couches, composantes et caractéristiques de l’épiderme. L’épiderme est divisé en quatre couches : les couches basale, épineuse, granuleuse et cornée. Alors que la couche basale renferme des cellules prolifératrices assurant l’auto-renouvellement de l’épiderme, les cellules des couches épineuses et granuleuses entrent dans un processus de différenciation qui mène à la formation de la couche cornée : une couche de cellules mortes ayant une grande importance dans la protection de l’organisme face à son environnement. À droite de la figure sont indiquées des caractéristiques associées aux cellules de chaque couche. Figure adaptée de [1]. Crédit : Amerman, Erin C., Human Anatomy & Physiology, 1ère édition, © 2016.
5 Les protéines entrant dans la composition de l’enveloppe cornée sont nombreuses. De façon intéressante, plusieurs de ces protéines sont codées par des gènes du complexe EDC (pour Epidermal Differentiation Complex) : une zone de 2 mégapaires de bases située dans la région q21 du chromosome 1 [14-16]. L’EDC comprend une soixantaine de gènes codant pour des protéines pouvant être divisées en trois familles : les précurseurs de l’enveloppe cornée, les protéines S100A et les protéines de gènes fusionnés [17]. Il existe également d’autres protéines de l’enveloppe cornée dont les gènes ne sont pas situés dans l’EDC comme la cystatine A [18]. Les principales protéines composant l’enveloppe cornée de même que leurs caractéristiques sont résumées dans le tableau 1.1.
Figure 1.3: Schéma illustrant les principales composantes et caractéristiques de l’épiderme. Le pH extracellulaire et la formation du gradient de calcium sont illustrés à gauche de l’image. Les différentes structures cellulaires sont illustrées en noir (voir encadré). Les intervalles d’expression de différentes protéines d’intérêt sont indiqués dans la portion de droite de la figure. Abréviations : Ca= calcium, K= kératine, TG= transglutaminase. Figure adaptée de [19].
6
Familles Membres Taille (kDa) Début Exp. % EC Caractéristiques et fonctions Réf. Précurseurs de l’enveloppe cornée
Involucrine 68 Épineuse 5% Première protéine de l’EC à être exprimée. Échafaudage de base de l’EC. [20, 21] Loricrine 26 Gran. 80% Présente dans les granules de kératohyaline. Composante majoritaire de l’EC. [12, 22] SPRR2G et 4 6-25 Variée 3-5% Répétitions de 2 à 20 prolines. Proportion supérieure dans épiderme plus rigide. [17, 23]
LCE 9-12 Gran. - Expression tardive. [18, 24]
Protéines S100 S100A7, 10, 11 et 15 10-14 Variée - Interaction avec le cytosquelette, régulation de FT et du Ca2+ intracellulaire. [25]
Gènes fusionnés
Filaggrine 35 Gran. < 1% Contribue à l’agrégation des filaments intermédiaires, la régulation du pH et de
l’hydratation de la peau. [26, 27]
Trichohyaline 220 Gran. - Surtout retrouvée dans le follicule pileux. [28]
Protéines des desmosomes
DP 330/
250 Basale < 1%
Composante de base des desmosomes.
Assure le lien avec les filaments de kératine. [29, 30]
Envoplakine 210 Épineuse sup. < 1% Plakines entrant dans la composition de la plaque dense interne des desmosomes et formant, avec l’involucrine, l’échafaudage de base pour la formation de l’EC.
[31]
Périplakine 195 Idem < 1% [32]
Kératines Type II (1, 2, 5) 56-60 Variée < 1% Composantes des filaments intermédiaires de la cellule. [33-35]
Autres
Cystatine A 12 Gran. 2-5% Précurseur de l’EC, rôle dans l’adhésion. [36, 37]
Hornerine 45 Gran. < 1% Composante de l’EC [38]
Cornifeline 12 Gran. - Associée à la loricrine et l’involucrine. [39]
Tableau 1.1 : Caractéristiques et expression des principaux constituants de l’enveloppe cornée. Les gènes codant pour les précurseurs de l’enveloppe cornée, les protéines S100 et les gènes fusionnés se retrouvent dans la région de l’EDC. Abréviations: Ca= calcium, DP= desmoplakine, EC= Enveloppe cornée, Exp.= expression, Gran.= granuleuse, FT= Facteurs de transcription, kDa= kilodalton, LCE= Late Cornified Envelope protein, Réf.- références, SPRR= Small Proline Rich Protein, Sup.= supérieure. Sources pour la taille et le pourcentage de l’enveloppe cornée : [12, 18].
7 Au sein de la littérature scientifique, les protéines de l’enveloppe cornée les plus connues et les plus étudiées sont l’involucrine, la loricrine et la filaggrine. Parmi celles-ci, notons la filaggrine, une protéine de la couche granuleuse résultant du clivage d’un large complexe protéique de 400 kDa, la profilaggrine, dont l’expression peut être régulée par les facteurs c-Jun et c-fos (voir tableau 1.9) [40]. La déphosphorylation de la profilaggrine par la protéine phosphatase PP2 induit le clivage de celle-ci par diverses protéases telles que la profilaggrine endoprotéinase 1, la kallikréine 5, la furine et la SASpase (pour Skin-specific retroviral-like aspartic protease) [41-48]. Ce clivage mène à la création de deux types de fragments : les sous-unités de filaggrine (environ 10 sous-unités) et le domaine N-terminal de la profilaggrine [41, 49-51]. Après le clivage, la portion N-terminale de la profilaggrine migre au noyau où celle-ci serait potentiellement impliquée dans la régulation de la dégradation de l’ADN [52]. Mise à part leur implication dans la formation de l’enveloppe cornée, les sous-unités de filaggrine, contribuent, quant à elles, à l’agrégation des filaments intermédiaires de kératines favorisant l’aplatissement des kératinocytes [53]. Plus tard, la filaggrine, est finalement dégradée par la caspase 14 et la calpaïne 1 en acides aminés hydrophiles qui contribuent à la rétention de l’eau dans la peau et donc à son hydratation [43, 54, 55]. L’histidine, un autre dérivé du clivage de la filaggrine, est converti en acide urocanique par l’histidase et contribue alors à la modulation du pH de l’épiderme et à la protection contre les rayons UV[56].
1.1.2.2 Assemblage de l’enveloppe cornée par les transglutaminases
L’assemblage des protéines de l’enveloppe cornée en une structure compacte et solide est assuré par des enzymes appelées transglutaminases [2, 57]. Chez l’être humain, la famille des transglutaminases (TGM) regroupe 9 membres qui possèdent la capacité de modifier des protéines par des réactions d’hydrolyse ou encore par l’ajout de groupes aminés ou lipidiques (tableau 1.2) [58]. Parmi ces transglutaminases, les TGM1, 3 et 5 (voir tableau 1.3), sont exprimées dans les couches suprabasales de l’épiderme et impliquées dans la formation de l’enveloppe cornée. Celles-ci catalysent, notamment, la formation de liaisons isopeptidiques (liaisons N glutamyl)lysine) résistantes à la plupart des enzymes protéolytiques de même que des réactions d’estérification qui permettent la liaison de lipides aux protéines de l’enveloppe cornée [2, 59, 60].
La transglutaminase 1 (TGM1), aussi appelée transglutaminase kératinocytaire, est celle qui a été la plus étudiée dans le cadre de la formation de l’enveloppe cornée. Exprimée de la couche épineuse jusqu’à la couche cornée [60], la TGM1 se démarque des TGM3 et TGM5 par sa capacité à être ancrée à la surface interne de la membrane cellulaire et à former des liens esters entre un résidu glutamine de l’involucrine et un analogue de l’-hydroxycéramide permettant ainsi l’attachement de lipides à l’enveloppe cornée [61]. De telles réactions, de même que la formation de liaisons isopeptidiques, nécessitent que la TGM1 soit tout d’abord activée. Tout comme les autres membres de la famille des transglutaminases, l’activité de la TGM1 requiert la présence d’un cofacteur important soit le calcium.
8
Nom Autre appellation Activité principale Expression Réf. Facteur
XIII
Facteur de stabilisation
de la fibrine Coagulation sanguine Plasma, monocytes [62]
Bande 4.2
Protéine membranaire
des érythrocytes Protéine structurale Érythrocytes [63]
TGM1 TGM kératinocytaire Assemblage de l’EC,
Modification des microtubules Épithélia, cerveau [64-66]
TGM2 TGM tissulaire Mort, différenciation, adhésion,
assemblage de la MEC Ubiquitaire [67, 68]
TGM3 TGM épidermique Assemblage de l’EC Épiderme, follicules pileux, cerveau
[65, 69, 70]
TGM4 TGM prostatique Peu connue Prostate [71]
TGM5 TGX Différenciation épidermique (EC, cornéodesmosomes)
Exprimée partout
sauf au cerveau [72]
TGM6 TGY Fonctions motrices Système nerveux central [73]
TGM7 TGZ Pas connue Pas caractérisée -
Tableau 1.2 : Appellations, activité, expression et localisation des transglutaminases chez l’humain. Abréviations : EC= Enveloppe Cornée, MEC= matrice extracellulaire, Réf.= références, TGM = transglutaminase. Sources [59, 74].
L’activation de la TGM1 passe aussi par le clivage de cette enzyme en trois sous-unités de 10, 33 et 67 kDa [75]. Des enzymes telles que la cathepsine D [76] et la calpaïne [77] ont été proposées comme étant impliquées dans ce processus. L’activité de la TGM1 dans la formation de l’enveloppe cornée requiert également sa localisation appropriée en périphérie cellulaire [78]. Ceci s’effectue par l’ajout de groupements myristyles ou palmitoyles sur son extrémité N-terminale [79]. Assez récemment, une protéine ancrée à la membrane plasmique et colocalisant avec la TGM1, TIG3 (pour Tazarotene-Induced Gene 3), a été proposée comme étant en mesure d’activer la TGM1 [80, 81]. La TGM1 est une enzyme fort importante dans l’élaboration de l’enveloppe cornée. Ceci est soutenu par des observations faites chez des patients souffrant de l’ichtyose lamellaire de type 1. En effet, cette pathologie, causée dans 50% des cas par une mutation faux sens dans une région conservée du gène de la TGM1, a pour effet de provoquer des déficiences dans l’assemblage de l’enveloppe cornée [10, 82-84].
9 La TGM3, est quant à elle, exprimée dans les kératinocytes des couches granuleuse et cornée [10, 85]. Tout comme la TGM1, l’activation de la TGM3 nécessite le clivage de celle-ci en sous-unités de 30 et 47 kDa qui, par la suite, deviennent liées entre elles par des interactions non-covalentes [86]. La protéase catalysant ce clivage n’est toutefois pas encore connue. La TGM3 favorise la formation de liaisons isopeptidiques entre des résidus glutamine et lysine bien spécifiques [70]. Elle est la transglutaminase présentant le plus d’affinité pour les SPRR (pour Small Proline Rich proteins) [10].Contrairement à la TGM1, des études faites dans un modèle de souris dépourvues du gène tgm3 suggèrent que cette enzyme n’est pas essentielle à la formation de la couche cornée, mais qu’elle serait plutôt impliquée dans le développement approprié des poils [69].
La dernière transglutaminase épidermique impliquée dans la formation de l’enveloppe cornée est la TGM5. Elle est exprimée dans les couches épineuse et granuleuse de l’épiderme [87], Toutefois, contrairement aux deux autres, celle-ci ne nécessite pas une étape de clivage pour son activation puisqu’elle est active sous sa forme initiale [59]. Ses principaux substrats sont la loricrine, l’involucrine et les SPRR [88]. Chez l’humain, des mutations au niveau de cette enzyme mènent à l’apparition du syndrome de peau déciduale acrale, une pathologie cutanée pour laquelle on observe, peu de temps après la naissance, une desquamation des zones superficielles de l’épiderme particulièrement au niveau des mains et des pieds [72]. Cette maladie est caractérisée par un clivage des jonctions spécialisées des cornéocytes (les cornéodesmosomes) suggérant un rôle de la TGM5 dans l’assemblage de ces jonctions cellulaires spécialisées [17]. L’existence de pathologies présentant des mutations sur les gènes des TGM1 et 5 et provoquant des phénotypes cutanés délétères montre que ces enzymes jouent un rôle important dans la différenciation des kératinocytes (voir tableau 1.4).
TGM Expression Localisation Activation Substrats Réf.
1 Épineuse- cornée Cytosol Membrane Calcium, clivage, localisation en périphérie cellulaire et TIG3 Involucrine, loricrine, céramides [61, 75, 78, 89-91]
2 Basale Cytosol, noyau, membrane, MEC
Activée par le calcium Inhibée par le GTP
Pas impliquée dans la
formation de l’EC [74, 92]
3 Granuleuse
- cornée Cytosol Clivage Loricrine, SPRR [70, 85]
5 Épineuse-
granuleuse
Cytosquelette,
matrice nucléaire Active par défaut
Loricrine, involucrine,
SPRR [87, 88]
Tableau 1.3 : Expression, activation et substrats des transglutaminases épidermiques. Abréviations : EC= enveloppe cornée, GTP= Guanosine Triphosphate, MEC= Matrice Extracellulaire, Réf.= références, SPRR= Small Proline Rich Protein, TGM= transglutaminase, TIG3= Tazarotene-Induced Gene 3. Adapté de [74]. Sources additionnelles : [10, 85, 87, 88].
10
Structure
affectée Protéine Maladies Phénotype Réf
Enveloppe cornée
Cystatine A
Ichtyose exfoliative
Desquamation superficielle des zones palmo-plantaires.
[36] Peau déciduale
acrale [93]
Filaggrine Ichtyose vulgaire Peau sèche, légère hyperkératose. [94] Loricrine Syndrome de
Vohwinkel
Présence de callosités au niveau
palmo-plantaire. [95]
TGM1 Ichtyose lamellaire Érythème palmo-plantaire avec plaques blanches, hyperkératose. [82] TGM5 Peau déciduale
acrale
Desquamation superficielle des zones
palmo-plantaires. [72]
Filaments intermédiaires
K5, K14 Épidermolyse bulleuse simple
Érosion de la peau causée par une
fragilité de la couche basale. [96] K1, K10 Ichtyose
épidermolytique
Érythème généralisé, érosion
(fragilité des couches suprabasales). [97]
Jonctions cellulaires
P-cadhérine Hypotrichose Perte des poils. [98]
Claudine 1
Ichtyose néonatale - cholangite sclérosante
Hypotrichose du cuir chevelu,
squames blanches diffuses. [99]
DSC2
Kératodermie palmo-plantaire légère
Légère hypertrophie des couches cornées au niveau des zones palmo-plantaires. [100] DSC3 Hypotrichose à vésicules cutanées récurrentes
Poils rares avec follicules normaux. [101]
DSG1 Kératodermie palmoplantaire Hypertrophie des couches cornées au niveau palmo-plantaire. [102] Ac contre DSG1 Pemphigus foliacé Apparition de bulles intraépidermiques. [103] Ac contre DSG3 Pemphigus vulgaire
Érosion de l’épiderme entre la couche basale et les suprabasales. [104] DSG4 Hypotrichose
simple Pilosité réduite. [105]
DP
Kératodermie palmo-plantaire striée
Hypertrophie des couches cornées
dans les régions palmo-plantaires. [106] Syndrome de
Carvajal
Cheveux laineux, kératodermie
palmo-plantaire. [107]
Épidermolyse bulleuse létale acantholytique
Érosions suintantes, généralement en l'absence de bulles, chute des cheveux.
[108]
PKP1 Épidermolyse
bulleuse simple
Érosion superficielle et généralisée de
11
Structure
affectée Protéine Maladie Phénotype Réf
Jonctions cellulaires (suite)
PG
Maladie de Naxos Cheveux laineux et kératodermie
palmo-plantaire. [110]
Épidermolyse bulleuse
congénitale létale
Desmosomes anormaux et peu nombreux. Érosions cutanées, absence d’ongles et alopécie.
[111]
CDSN Peau déciduale
généralisée type B
Desquamation diffuse et superficielle de la peau avec une érythrodermie sous-jacente, un prurit et une atopie.
[112]
Transporteurs
ABCA12
(lipides) Ichtyose Harlequin
Présence à la naissance de grandes
squames épaisses sur tout le corps. [113] ATP2C1
(Ca)
Syndrome Hailey-Hailey
Fissurations aux aisselles, plis
inguinaux et plis périnéaux. [114] ATP2A2
(Ca au RE) Maladie de Darier
Développement de papules
kératosiques (régions séborrhéiques). [115] Tableau 1.4 : Résumé de pathologies associées à la présence de mutations ou au ciblage par anticorps (dans le cadre de maladies auto-immunes) de protéines exprimées au niveau de l’épiderme. De façon générale, les ichtyoses et la kératodermie sont associées à un épaississement anormal de la couche cornée (hyperkératose), les épidermolyses à l’érosion de la peau et l’hypotrichose à la perte des poils ou des cheveux. Abréviations : ABCA12= ATP Binding Cassette subfamily A member 12, Ac= anticorps, ATP2A2= Calcium transporting ATPase sarcoplasmic reticulum type 2, ATP2C1= ATPase Ca++ transporting type 2C member 1, Ca= calcium, CDSN= cornéodesmosine, DSC = desmocolline, DSG= desmogléine, DP= desmoplakine, K= kératine, PKP= plakophiline, PG= plakoglobine, RE= réticulum endoplasmique, TGM= transglutaminase. Inspiré de [116].
1.1.2.3 Étapes de formation de l’enveloppe cornée
La formation de l’enveloppe cornée (figure 1.4) est un processus qui débute au niveau de la couche épineuse par le recrutement de l’involucrine à proximité des desmosomes par l’envoplakine et la périplakine [117]. Ces composantes représentent un échafaudage de base sur lequel les transglutaminases épidermiques attachent d’autres protéines (filaggrine, loricrine, SPRR, kératines) de même que des lipides extracellulaires lors des étapes de renforcement de l’enveloppe cornée et de la formation de l’enveloppe lipidique au sein des couches granuleuse et cornée [10, 118]. Ces étapes, combinées à des processus de dégradation du noyau et des organites, mènent à la formation de cornéocytes. L’apport en cornéocytes étant constant, ceux-ci sont progressivement éliminés par un processus de desquamation impliquant la dégradation des cornéodesmosomes par des protéases telles que les kallikréines 5 et 7 [119, 120].
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Figure 1.4: Illustration des étapes d’assemblage de l’enveloppe cornée. L’initiation de l’assemblage de l’enveloppe cornée prend place au niveau de la couche épineuse de l’épiderme. Cette étape est marquée par la formation d’un échafaudage de base formé de périplakine, d’envoplakine et d’involucrine et de son ancrage aux desmosomes par les transglutaminases 1 et 5. Un peu plus haut, dans la couche granuleuse ont lieu les étapes de renforcement et d’incorporation de lipides. Lors de ces processus des lipides et diverses protéines de l’enveloppe cornée exprimées de façon un peu plus tardive (comme la loricrine, la filaggrine ou les SPRR) sont incorporés à l’échafaudage de base par la formation de liaisons covalentes par les transglutaminases 1 et 3. La formation de ces liaisons de même que l’extrusion des lipides se poursuivent au niveau de la couche cornée lors de l’étape de desquamation marquant ainsi la fin du processus d’assemblage de l’enveloppe cornée. Abréviation : SPRR= Small Proline Rich Protein. Figure adaptée de [10].
La différenciation des kératinocytes est un processus important qui requiert non seulement la formation de l’enveloppe cornée, mais également le remodelage du cytosquelette et la formation de jonctions d’adhésion. Ces sujets seront abordés au cours des sections suivantes.
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1.2 Le remodelage du cytosquelette au cours de la différenciation
des kératinocytes
Les composantes cytosquelettiques subissent des modifications pendant le processus de différenciation des kératinocytes. Une des plus connues est le changement au niveau de la composition des filaments intermédiaires. En effet, alors que dans la couche basale, ce sont surtout les kératines 5 et 14 qui forment les filaments intermédiaires, ce sont surtout les kératines 1 et 10 qui assurent cette tâche dans les couches suprabasales (voir figure 1.3) [121]. Il est également démontré que l’induction de la différenciation de kératinocytes en culture par un traitement au calcium provoque un réarrangement en périphérie cellulaire des filaments intermédiaires. Un tel changement s’observe également pour les deux autres composantes cytosquelettiques de la cellule, soit les microfilaments d’actine et les microtubules (voir figure 1.5 et tableau 1.5) [122, 123].
Figure 1.5 : Illustration des différentes composantes du cytosquelette et de leur localisation dans la cellule. Il existe trois catégories de structure du cytosquelette dans la cellule : les microfilaments d’actine, les filaments intermédiaires et les microtubules. À noter sur le schéma que les microtubules (jaune) émergent d’une structure appelée centrosome. Les diamètres des différentes composantes du cytosquelette sont indiqués à droite de la figure. Abréviation : nm= nanomètre. Figure adaptée de [1].
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Type de
cytosquelette Structure Propriétés Composition Fonctions
Microfilaments 2 filaments croisés d’actine Contractiles Polarisés ATP requis pour l’assemblage Actine (globulaire) Forme cellulaire,
mobilité (lamellipodes, pseudopodes),
invaginations de la membrane
(phagocytose, endocytose),
division cellulaire (anneau contractile), contraction musculaire,
transport intracellulaire unidirectionnel (myosine).
mécanotransduction
Retrouvés aux jonctions serrées, adhérentes et focales. Microtubules Tubes creux formés de 13 protofilaments de tubuline Dynamiques Polarisés GTP requis pour l’assemblage Hétérodimères d’α et β tubuline (globulaires) Forme cellulaire,
mobilité cellulaire (cils et flagelles), transport intracellulaire bidirectionnel (kinésine, dynéine),
division cellulaire (fuseau achromatique)
Filaments intermédiaires Protéines fibreuses organisées en superstructure Stables Non-polarisés Assemblage spontané Homo ou Hétérodimères (kératinocytes : Hétérodimères K type 1 et 2) Forme cellulaire,
ancrage du noyau et de certains organites,
associés aux desmosomes
Tableau 1.5 : Résumé de la structure, des propriétés, de la composition et des fonctions des différents types de structures du cytosquelette cellulaire. Abréviations : ATP= Adénosine triphosphate, K= kératine, GTP : Guanosine triphosphate.
Alors qu’une fonction de régulation des propriétés mécaniques de la cellule a été proposée pour expliquer la redistribution des filaments intermédiaires en périphérie cellulaire, le rôle d’une telle réorganisation demeure flou en ce qui concerne les microtubules et les microfilaments. Il est toutefois connu que les microtubules représentent une structure nécessaire à la localisation adéquate en périphérie cellulaire d’une protéine de l’enveloppe cornée nommée S100A11 [124]. De plus, la sous-expression de Lis1 et HSP27, des protéines capables de réguler la distribution des microtubules, a été associée à des problèmes de différenciation épidermique suggérant une participation des microtubules dans ce processus [125, 126]. Malgré ces découvertes, il ne semble pas exister, dans la littérature actuelle, d’études ayant eu pour but d’analyser le rôle des microtubules dans le processus de différenciation des kératinocytes. Les mécanismes provoquant la redistribution des microtubules en périphérie cellulaire restent donc à préciser. Une étude a toutefois permis de mettre en évidence que ce processus pouvait être induit dans des kératinocytes murins en culture suite à la stabilisation des microtubules par un traitement au taxol suggérant ainsi que des facteurs capables de réguler la stabilisation des microtubules pourraient favoriser leur redistribution en périphérie cellulaire [127].
