Effets d'Actinobacillus pleuropneumoniae et Streptococcus suis sur la barrière épithéliale de la trachée du porc

© Philippe Bercier, 2019

Effets d'Actinobacillus pleuropneumoniae et

Streptococcus suis sur la barrière épithéliale de la

trachée du porc

Mémoire

Philippe Bercier

Maîtrise en microbiologie - avec mémoire

Maître ès sciences (M. Sc.)

Effets d’Actinobacillus pleuropneumoniae et Streptococcus suis

sur la barrière épithéliale de la trachée du porc

Mémoire

Philippe Bercier

Sous la direction de :

iii

Résumé

Actinobacillus pleuropneumoniae et Streptococcus suis sont des bactéries pathogènes

entraînant des maladies porcines mortelles et des pertes économiques importantes dans l’industrie porcine mondiale. Ces bactéries sont notamment reconnues pour leur implication dans certaines maladies pulmonaires porcines, dont la pneumonie, et leurs mécanismes de pathogénicité ne sont pas parfaitement élucidés. De ce fait, nous nous sommes intéressés à l’activité de ces deux bactéries sur la barrière épithéliale de la trachée du porc, soit un modèle représentatif de la première ligne de défense des voies respiratoires supérieures du porc. Plus précisément, nous avons étudié la capacité d’A. pleuropneumoniae et de S. suis à induire une perte d’intégrité de la barrière épithéliale, à la traverser, et à induire une réponse inflammatoire. En considérant les cytokines pro-inflammatoires sécrétées par les cellules épithéliales en présence de ces bactéries pathogènes, les effets du TNF-α sur la barrière épithéliale ont également été analysés. Nous avons démontré qu’A. pleuropneumoniae, S.

suis et le TNF-α sont aptes à induire des dommages importants à la barrière épithéliale et à

permettre la translocation de ces bactéries pathogènes à travers cette barrière. Ces résultats suggèrent que la barrière épithéliale puisse représenter une cible thérapeutique contre les infections engendrées par les bactéries pathogènes environnantes afin de limiter leur capacité d’invasion. Pour ce faire, il serait nécessaire d’investiguer davantage les facteurs de virulence de ces bactéries contribuant à la perte d’intégrité de la barrière épithéliale des voies respiratoires supérieures du porc afin d’élaborer de potentiels thérapies ciblées inhibant leur pathogénicité.

iv

Table des matières

Résumé ... iii

Table des matières ... iv

Liste des figures ... vii

Remerciements ... xi

Avant-propos ... xii

Introduction ... 1

1. Industrie porcine ... 1

2. Système respiratoire porcin ... 1

2.1 Structure générale ... 1

2.2 Épithélium ... 2

2.3 Système immunitaire ... 4

3. Infections respiratoires chez le porc ... 7

3.1 Généralités ... 7

3.2 Infections à Streptococcus suis ... 7

3.2.1 Généralités ... 7

3.2.2 Facteurs de virulence ... 8

3.2.3 Interaction de S. suis avec les cellules épithéliales ... 10

3.2.4 Prévention et traitements ... 10

3.3 Infections à Actinobacillus pleuropneumoniae ... 11

3.3.1 Généralités ... 11

3.3.2 Facteurs de virulence ... 12

3.3.3 Interaction d’A. pleuropneumoniae avec les cellules épithéliales ... 14

3.3.4 Prévention et traitements ... 14

4. Problématique ... 15

5. Hypothèse et objectifs ... 15

Chapitre 1: Effets d’Actinobacillus pleuropneumoniae sur la fonction barrière et la réponse inflammatoire des cellules épithéliales de la trachée du porc ... 17

1.1 Résumé ... 18

1.2 Abstract ... 19

1.3 Introduction ... 20

1.4 Materials and methods ... 22

v

1.4.2 Determination of epithelial tight junction integrity ... 22

1.4.3 Fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran transport ... 23

1.4.4 Determination of cell viability ... 23

1.4.5 Immunofluorescent staining of occludin and zonula occludens-1 ... 23

1.4.6 Bacterial translocation assay ... 24

1.4.7 Pro-inflammatory cytokine secretion ... 24

1.4.8 Statistical analysis ... 24 1.5 Results ... 25 1.6 Discussion ... 28 1.7 Acknowledgments ... 31 1.8 References ... 32 1.9 Figures ... 37

Chapitre 2: Le TNF-α altère l’intégrité de la barrière épithéliale respiratoire du porc ... 41

2.1 Résumé ... 42

2.2 Abstract ... 43

2.3 Introduction ... 44

2.4 Materials and methods ... 46

2.4.1 Bacteria and growth conditions ... 46

2.4.2 Determination of epithelial tight junction integrity ... 46

2.4.3 Fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran transport ... 47

2.4.4 Immunofluorescent staining of occludin and zonula occludens-1 ... 47

2.4.5 Cytokine secretion by TNF-α-stimulated NPTr cells... 47

2.4.6 TNF-α-secretion by NPTr cells stimulated with respiratory bacterial pathogens 48 2.4.7 Statistical analysis ... 48 2.5 Results ... 49 2.6 Discussion ... 51 2.7 Acknowledgements ... 53 2.8 References ... 54 2.9 Figures ... 57

Chapitre 3: La suilysine de Streptococcus suis compromet les fonctions de la barrière épithéliale de la trachée du porc ... 60

3.1 Résumé ... 61

3.2 Abstract ... 62

3.3 Introduction ... 63

vi

3.4.1 Bacterial strains and growth conditions ... 65

3.4.2 Preparation of recombinant suilysin ... 65

3.4.3 Determination of epithelial tight junction integrity ... 65

3.4.4 Fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran transport ... 66

3.4.5 Determination of cell viability ... 66

3.4.6 Immunofluorescent staining of occludin and zonula occludens-1 ... 66

3.4.7 Bacterial translocation assay ... 67

3.4.8 Statistical analysis ... 67 3.5 Results ... 68 3.6 Discussion ... 70 3.7 Acknowledgments ... 72 3.8 References ... 73 3.9 Figures ... 77 Discussion ... 80 Conclusion ... 85 Bibliographie ... 86

vii

Liste des figures

Introduction

Figure 1: Composantes jonctionelles retrouvées au niveau apical de la voie paracellulaire de l’épithélium. ... 2

Chapitre 1

1. Figure 1: Effect of A. pleuropneumoniae at different MOIs on porcine tracheal epithelial barrier integrity in function of time. ... 37

1. Figure 2: Cellular permeability of porcine tracheal epithelial cells stimulated with A.

pleuropneumoniae at different MOIs. ... 38

1. Figure 3: Immunofluorescence staining of the tight junction proteins zonula occludens-1 (ZO-1) and occludin in porcine tracheal epithelial cells treated for 24 h with A.

pleuropneumoniae at MOIs of 1, 10, and 100.. ... 38

1. Figure 4: Translocation of FITC-labelled A. pleuropneumoniae across a monolayer of porcine tracheal epithelial cells following infection with MOI of 100. ... 39

1. Figure 5: Secretion of IL-8 (Panel A), IL-6 (Panel B) and TNF-α (Panel C) by porcine tracheal epithelial cells stimulated for 24 h with A. pleuropneumoniae at different MOIs. 40

Chapitre 2

2. Figure 1: Effect of TNF-α on porcine tracheal epithelial cell tight junction integrity determined by monitoring TER values ... 57

2. Figure 2: Effect of TNF-α on the paracellular permeability of porcine tracheal epithelial cells as determined by measuring the transport of FITC-dextran 4 (FD-4) ... 58

2. Figure 3: Immunofluorescence staining of the tight junction proteins occludin and zonula occludens-1 (ZO-1) of porcine tracheal epithelial cells treated for 24 h with TNF-α. ... 59

2. Figure 4: Effect of TNF-α on the secretion of IL-8 (panel A) and IL-6 (panel B) by porcine tracheal epithelial cells ... 59

2. Figure 5: Effect of A. suis (panel A) and H. parasuis (panel B) on the secretion of TNF-α by porcine tracheal epithelial cells ... 59

viii

Chapitre 3

3. Figure 1: Effects of S. suis 31533 and S. suis SX911, a suilysin-deficient mutant, at MOIs of 1000, on the integrity of a porcine tracheal epithelial barrier model. ... 77

3. Figure 2: The cellular permeability of porcine tracheal epithelial cells treated with S. suis 31533 and S. suis SX911, a suilysin-deficient mutant, at MOIs of 1000 ... 77

3. Figure 3: Translocation of FITC-labelled S. suis 31533 and S. suis SX911, a suilysin deficient mutant, across a monolayer of porcine tracheal epithelial cells at MOIs of 1000 78

3. Figure 4: Effect of 50 µg/ml of active or heat-treated recombinant suilysin on the integrity of a porcine tracheal epithelial barrier model following a 1-h exposure as determined by measuring TER ... 78

3. Figure 5: Immunofluorescence staining of the tight junction proteins zonula occludens-1 (panels A and C) and occludin (panels B and D) in porcine tracheal epithelial cells untreated (panels A and B) or treated (panels C and D) for 1 h with 50 µg/ml of recombinant suilysin. ... 79

ix

Liste des abréviations

% Pourcentage

α Alpha

β Beta

°C Celcius

Ω Ohm

A. pleuropneumoniae Actinobacillus pleuropneumoniae

A. suis Actinobacillus suis

Apx Actinobacillus pleuropneumoniae RTX-toxin

CO2 Dioxyde de carbone

DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

FBS Serum fetal bovin

FD FITC-conjugated dextran

FITC Isothiocyanate de fluorescéine

g Accélération centrifuge

h Heure

HBSS Hank’s Balanced Salt Solution

HEPES Acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique

H. parasuis Haemophilus parasuis

IL-6 Interleukine-6 IL-8 Interleukine-8 kDa Kilodalton LDH Lactate déshydrogénase LPS Lipopolysaccharide M, mM Molaire, millimolaire min Minute ml Millilitre

MLST Multilocus sequence typing

MOI Multiplicité d’infection

MTT 3-[4,5-diethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide

NaCl Chlorure de sodium

NAD Nicotinamide adenine dinucléotide

NF-ΚB Facteur nucléaire kappa B

NK Natural killer

nm, µm, mm, cm Nanomètre, micromètre, millimètre, centimètre

NPTr Newborn pig tracheal cells

PBS Phosphate-buffered saline

pg, ng, µg Picogramme, nanogramme, microgramme

PMN Polymorphonucléaires

PRR Pattern recognition receptor

PRRSV Porcine reproductive and respiratory syndrome virus

RTX Repeats in toxin

x

ST Sequence type

TER Résistance électrique transépithéliale

THB Todd Hewitt Broth

TJ Tight junction

TNF-α Facteur de nécrose tumoral alpha

v/v Volume/volume

ZO-1 Zonula occludens-1

xi

Remerciements

Il est beaucoup plus aisé de se donner à fond et de performer en absence de sentiments d’oppression et d’obligations. Pour cela, j’aimerais adresser mes sincères remerciements au Dr Daniel Grenier pour la confiance et la liberté qu’il m’a octroyé durant tout mon parcours de maîtrise. J’ai eu la chance d’avoir un mentor disponible, ouvert à la discussion et terre à terre ce qui a grandement embelli mon expérience d’étude au cycle supérieur en plus de me permettre d’atteindre mes objectifs professionnels.

Ces deux belles années n’auraient guère été possible sans l’aide de mon second mentor, Dr Amel Ben Lagha. Cette femme a eu la patience et la gentillesse de m’apprendre l’ensemble des techniques que j’ai utilisé lors de la réalisation de mon projet. Sa camaraderie, sa joie de vivre et sa bonté sont uniques et contagieuses. Quoi de mieux pour avoir une atmosphère de travail parfaite, chaleureuse et familiale. Celle-ci a toujours été présente et rassurante lors de mes périodes d’angoisses et de doutes, et pour cela, je ne pourrai jamais assez la remercier. Mes autres camarades de laboratoire ne sont également pas à oublier, particulièrement Katy et Jabrane. Je vous remercie énormément pour votre soutien et pour le temps que vous avez consacré à nos nombreuses discussions constructives m’ayant permis d’arriver là où j’en suis aujourd’hui. Le partage des connaissances est un art demandant et je suis privilégié de vous avoir eu dans mon entourage.

Mes derniers remerciements s’adressent à mes amis et à ma famille qui m’ont supporté tout au long de cette aventure. Plus particulièrement, j’aimerais remercier personnellement ma partenaire Joanie qui a subi de nombreuses discussions scientifiques parfois farfelues à toutes heures du jour et de la nuit. Ses encouragements et son support m’ont été indispensables.

xii

Avant-propos

Le présent mémoire est divisé en cinq sections. La première section constitue une mise en contexte du sujet du mémoire sous forme d’une revue de littérature actualisée en plus de la de la problématique, l’hypothèse et les objectifs de recherche y étant liés. Les principaux résultats obtenus dans ce projet de maîtrise ont fait l’objet de publications ou sont en cours de publication dans des journaux avec comité de lecture et sont retranscrits dans les chapitres 1 à 3 avec l’autorisation des coauteurs et dans le respect des licences de diffusion. Le tout se conclura par une discussion générale des résultats obtenus ainsi que les perspectives futures envisagées.

Chapitre 1: Effets d’Actinobacillus pleuropneumoniae sur la fonction barrière et la réponse inflammatoire des cellules épithéliales de la trachée du porc

Cet article a été publié sous la référence Bercier, P., Gottschalk, M. & Grenier, D. Effects of

Actinobacillus pleuropneumoniae on barrier function and inflammatory response of pig

tracheal epithelial cells. Pathogens and Disease (2019), doi: 10.1093/femspd/fty079. La contribution des auteurs est la suivante: le premier auteur (Philippe Bercier) a effectué toutes les expériences ainsi que la rédaction de la première version du manuscrit. Dr Gottschalk a fourni les cellules épithéliales et a contribué à la révision du manuscrit. Le tout a été effectué sous la supervision de Dr Daniel Grenier qui a également participé à la conception des expériences, l’analyse des données et à la révision du manuscrit.

Chapitre 2: Le TNF-α altère l’intégrité de la barrière épithéliale respiratoire du porc

Cet article a été publié sous la référence Bercier, P. & Grenier, D. TNF-α disrupts the integrity of the porcine respiratory epithelial barrier. Research in Veterinary Science (2019), doi: 10.1016/j.rvsc.2019.01.029. Les expérimentations et la rédaction de cet article ont été effectuées par le premier auteur sous la supervision de Dr Daniel Grenier.

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Chapitre 3: La suilysine de Streptococcus suis compromet les fonctions de la barrière épithéliale de la trachée du porc

Cet article a été soumis pour publication dans le journal Microbial Pathogenesis sous la référence Bercier, P., Gottschalk, M. & Grenier, D. Streptococcus suis suilysin compromises the function of a porcine tracheal epithelial barrier model. Microbial Pathogenesis (2019). Le premier auteur (Philippe Bercier) a effectué toutes les expériences ainsi que la rédaction initiale de l’article. Dr Marcelo Gottschalk a fourni les cellules épithéliales ainsi que la suilysine recombinante en plus de contribuer à la révision du manuscrit. Le tout a été effectué sous la supervision de Dr Daniel Grenier qui a également participé à la conception des expériences, l’analyse des données et à la révision du manuscrit.

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Introduction

1. Industrie porcine

Dû à la grande demande en viande d’origine porcine, les fermes d’élevage regroupent une grande quantité de porcs dans des espaces restreints rendant les conditions environnementales extrêmes [1]. Cela dit, la présence d’une importante densité animale dans un environnement fermé a pour effet de faciliter la transmission d’agents pathogènes au sein des troupeaux [2,3]_{. Les maladies respiratoires engendrées par ces microorganismes}

pathogènes causent des pertes économiques importantes dans l’industrie porcine mondiale [4,5]. Ces pertes économiques sont principalement liées à une hausse du taux de mortalité, une diminution de la prise de masse chez les porcs, des frais supplémentaires en nourriture ainsi que l’augmentation des coûts associés à la prévention des maladies (vaccination et traitements) et à la main-d’œuvre [1]. Considérant l’ampleur des effets négatifs associés aux maladies respiratoires porcines, celles-ci représentent l’une des préoccupations principales dans la production porcine actuelle.

Le Canada est le 7e plus importants pays producteurs de porcs au monde ce qui représente 2 % de la production globale mondiale [6]. Selon Statistiques Canada, plus de 7000 fermes porcines regroupant un total de plus de 12 millions de porcs étaient présentes et actives au Canada en 2011. À cette date, la valeur associée à l’exportation du porc canadien s’élevait à environ 2.9 milliards de dollars [7].

2. Système respiratoire porcin

2.1 Structure générale

Le tractus respiratoire porcin est composé de plusieurs compartiments menant aux poumons et assurant le bon fonctionnement du système respiratoire de l’hôte. En soi, les voies respiratoires du porc sont constituées de la cavité nasale, du nasopharynx, du larynx et des tubules. Les tubules représentent les différentes parties des voies respiratoires inférieures ou menant à celles-ci, soit la trachée, les bronches extra- et intra-pulmonaires, les bronchioles ainsi que les alvéoles et les bronchioles terminales constituant le système d’échange gazeux de ces voies [1,8]_.

2

2.2 Épithélium

L’épithélium est une barrière polarisée composée de plusieurs couches de cellules adhérentes présentes à la surface de certains organes et de la peau [9,10]_{. Ce sont les cellules les plus}

exposées aux agents pathogènes de l’environnement et responsables d’assurer une protection de l’organisme par leur fonction barrière, de sécrétion et d’absorption [11]_{. Elles sont aussi}

impliquées dans le transport transcellulaire et dans la détection de corps étrangers [9,12]. L’importance de l’épithélium dans la défense de l’hôte a notamment été démontrée en présence de perturbations de la barrière épithéliale (brulure, coupure) résultant en une augmentation de la prévalence infectieuse. D’ailleurs, les cellules épithéliales infectées aident à l’initiation de la réponse inflammatoire par la sécrétion de chimiokines attirant des cellules du système immunitaire. La production de peptides antimicrobiens joue également un rôle important en ce qui a trait à la défense exercée par la barrière épithéliale [11].

Figure 1: Composantes jonctionelles retrouvées au niveau apical de la voie paracellulaire de l’épithélium [13]_.

3

Les cellules épithéliales sont attachées les unes aux autres via plusieurs jonctions dont les fonctions sont déterminées par des protéines spécifiques, ces jonctions sont nommées les jonctions serrées [14]. En collaboration avec d’autres jonctions de structure intercellulaires, les jonctions serrées fournissent une intégrité structurale aux tissus et crées une barrière hautement polarisée assurant le maintien de l’homéostasie cellulaire par le passage sélectif d’eau, de molécules et d’autres cellules [15]_{. En d’autres termes, les jonctions serrées sont}

composées de diverses protéines membranaires et contribuent au maintien des fonctions de la barrière épithéliale en assurant une perméabilité et une sélectivité entre les cellules épithéliales [16]. Ces jonctions possèdent deux voies fonctionnelles et distinctes responsables du passage de molécules/ions au travers de la barrière épithéliale, soit la voie de la fuite («leak pathway») et des pores («pore pathway»). La voie des pores permet le passage à haute capacité à l’aide de pores sélectifs de petits ions et de molécules non-chargées. D’autre part, la voie de la fuite permet le passage d’ions de taille plus importante et de molécules, qu’elles soient chargées ou non. Le flux associé à la voie de la fuite est beaucoup moins élevé que dans la voie des pores [16].

Une dérégulation des jonctions serrées peut être associée à la pathogénèse de diverses maladies, telles que le cancer, des désordres pulmonaires et des troubles inflammatoires chroniques au niveau des voies digestives [15,17]_{. Le maintien de ces jonctions est assuré par}

plus de 40 protéines différentes pouvant avoir des rôles distincts [18]_{. Plus spécifiquement,}

certaines sont transmembranaires et forment des liens homophiles et hétérophiles entre les cellules épithéliales, dont l’occludine, tandis que d’autres sont des protéines intracellulaires assurant la liaison entre ces protéines transmembranaires et le cytosquelette d’actines. Parmi ces protéines intracellulaires se retrouve la zonula occludens-1 (ZO-1) [19]. En fait, la ZO-1 est une protéine d’échafaudage recrutant diverses protéines à la surface cytoplasmique des jonctions [14]. À l’aide d’un modèle murin ayant subi un «knockout» du gène de la ZO-1 au niveau des cellules épithéliales, il fut démontré que la ZO-1 n’est pas essentielle à la formation des jonctions serrées, mais son absence réduit significativement l’assemblage de ces jonctions [19,20]. ZO-1 interagit directement avec plusieurs protéines transmembranaires situées dans les jonctions serrées, dont l’occludine [14]_{. L’occludine est une protéine majeure}

des jonctions serrées possédant de potentielles capacités d’adhésion/blocage et jouant un rôle important dans les fonctions de la barrière épithéliale au niveau paracellulaire [21]. Le retrait

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de l’occludine dans des modèles murins par «knockout» a démontré que l’absence de cette protéine n’affecte pas la morphologie des jonctions serrées. Toutefois, cette lacune entraîne des anomalies, dont l’apparition d’inflammation chronique et l’induction d’une baisse d’intégrité des jonctions serrées dans plusieurs lignées cellulaires épithéliales [22]_{. Il est donc}

suggéré que l’occludine joue un rôle important au niveau de la stabilité de ces jonctions et des fonctions de la barrière épithéliale [15,21]. L’implication de l’occludine et de la ZO-1 dans les jonctions serrées au niveau du maintien de la perméabilité paracellulaire de la barrière épithéliale a été démontrée via diverses techniques, dont la résistance électrique transépithéliale (TER) [19,21].

2.3 Système immunitaire

Outre les différentes barrières physiques et leurs mécanismes associés, le système immunitaire joue un rôle important dans la protection de l’hôte contre les potentiels agents pathogènes. Les réponses immunitaires se différencient en deux groupes principaux, les réponses immunitaires innée et adaptative. Dans ce mémoire, nous nous intéresserons principalement à l’immunité innée.

La réponse immunitaire innée assure une protection immédiate de l’hôte suivant une exposition à un agent pathogène. Cette réponse qualifiée de non-spécifique est assurée par différentes composantes du système immunitaire, dont les cellules épithéliales. [12] _Les

surfaces de l’épithélium respiratoire sont chacune recouverte d’une muqueuse jouant un rôle critique dans la protection des voies respiratoires vis-à-vis les agents pathogènes environnementaux. Cette muqueuse va notamment assurer la filtration et le conditionnement de l’air via les capillaires extensifs retrouvés dans la cavité nasale, mais également piéger les particules à l’aide d’une bicouche de mucus présente à la surface de différentes structures du système respiratoire, tels que les cellules épithéliales de la trachée [1]. La bicouche de mucus contient également des substances permettant l’inactivation des agents pathogènes. Parmi ces substances, les peptides antimicrobiens sont très abondants, plus particulièrement les défensines. En fait, les défensines constituent une famille diversifiée de peptides possédant un spectre d’activité antimicrobien important pouvant éliminer et/ou inhiber les bactéries à Gram – et à Gram +, les mycètes, les parasites et les virus. Elles sont également des protéines particulièrement abondantes dans les neutrophiles lors de la phagocytose [12].

5

Les neutrophiles sont les cellules phagocytaires les plus abondantes en circulation au niveau du système immunitaire et sont les premières à être recrutées dans une zone d’infection par divers agents pathogènes [23]. Globalement, la phagocytose est un mécanisme permettant l’internalisation de particules (bactéries, cellules mortes, etc.) suivi par leur ingestion. La reconnaissance s’effectue par une détection d’antigènes de surface sur la proie; ce mécanisme est utilisé par différentes cellules immunitaires [24].

Les macrophages sont des cellules phagocytaires résidentes et jouent de nombreux rôles dans la biologie de l’organisme, que ce soit au niveau de son développement, du maintien de l’homéostasie par sa réponse aux changements physiologiques ou de la réparation tissulaire suite à une réponse immunitaire vis-à-vis un agent pathogène [25]. Cette homéostasie est notamment préservée par la délétion des cellules apoptotiques et par la production de facteurs de croissance [26]. Les macrophages exercent une phagocytose efficace grâce à des récepteurs appelés «pattern recognition receptor; PRR» et peuvent également sécréter des cytokines inflammatoires [27].

Le rôle du système immunitaire inné est d’éliminer les entités étrangères à l’aide de différents groupes de cellules ayant des fonctions diverses, tels que les cellules phagocytaires que nous venons d’aborder. Ce système protège également l’hôte contre ses propres cellules infectées ou tumorales à l’aide de cellules cytotoxiques inductrice d’apoptose et reconnaissant les cellules du soi modifiées, tels que les cellules «natural killer» (NK). En plus de leur activité cytotoxique, les cellules NK peuvent sécréter différentes cytokines inflammatoires jouant un rôle dans la modulation des fonctions des cellules du système immunitaire inné et adaptatif [12,28]_.

Les cytokines sont de petites glycoprotéines responsables de la communication entre différentes cellules immunitaires (macrophages, neutrophiles, etc.), hématopoïétiques et plusieurs autres types de cellules [29], dont les cellules épithéliales [30–32]. Celles-ci sont spécifiques et vont notamment influencer l’activation, la croissance, la différenciation et/ou la migration des cellules possédant des récepteurs compatibles à sa surface [30,33]. De plus, certaines cytokines jouent un rôle majeur dans la modulation de l’inflammation [34]. Quoiqu’il existe une grande diversité de cytokines, seules celles faisant l’objet du présent mémoire seront présentées.

6

L’interleukine-8 (IL-8) est une chimiokine produite par les macrophages et d’autres types cellulaires, dont les cellules épithéliales. Cette cytokine est l’un des médiateurs majeurs de la réponse inflammatoire et son rôle principal est l’induction du chimiotactisme des neutrophiles vers le tissu enflammé où l’IL-8 a été sécrétée [34,35]. Toutefois, elle participe également à la migration et à l’activation de monocytes, lymphocytes, basophiles et éosinophiles au lieu de l’infection [34,36]_{. D’ailleurs, le recrutement et l’activation des}

neutrophiles engendrés par cette cytokine est possible via divers mécanismes de signalisation complexes et des molécules d’adhésion extracellulaires. Outre ses rôles principaux dans le maintien du système immunitaire, l’IL-8 est retrouvée en grande quantité lors de certaines maladies inflammatoires tissulaires ce qui pourrait mener à des désordres pro-inflammatoires [34,37,38].

L’interleukine-6 (IL-6) est une cytokine pléotropique exprimée par diverses cellules du système immunitaire incluant les polymorphonucléaires (PMN) et les cellules épithéliales [32,34]. Cette cytokine est impliquée dans l’hématopoïèse et l’inflammation tout en jouant un rôle crucial au niveau de la réponse immunitaire adaptative, tels que la maturation des lymphocytes B en cellules plasmatiques productrices d’anticorps et l’activation des lymphocytes T [34,39–41]_{. De plus, l’IL-6 est sécrétée dans les tissus infectés}

et est acheminée vers les tissus environnants comme signal de danger [39]_{. Toutefois, il a été}

démontré que l’IL-6 peut contribuer à la pathogénèse de certaines maladies lorsque celle-ci est excessivement produite et présente en quantité abondante. En fait, une surexpression de l’IL-6 a été observée lors de diverses maladies chroniques inflammatoires et dans des désordres auto-immuns [34,42,43].

Le facteur de nécrose tumoral-α (TNF-α) est un médiateur pro-inflammatoire ayant un rôle central dans les processus inflammatoires du système immunitaire inné, incluant notamment l’induction de la production de cytokines, l’apoptose et l’expression de molécules d’adhésion [34]_{. Cette cytokine est également impliquée dans la stimulation de la prolifération}

cellulaire, l’inhibition de cellules tumorales et la régulation de la réponse immunitaire [44,45]. Le TNF-α est principalement sécrété par les macrophages activés, mais peut être également produit par d’autres cellules du système immunitaire, comme les cellules NK et les cellules épithéliales [32,34,46]. Outre ses multiples fonctions dans la réponse immunitaire, la présence

7

de cette cytokine en quantité excessive peut entraîner des dommages dans divers tissus. D’ailleurs, en situation de surexpression, le TNF-α est impliqué dans certains désordres pro-inflammatoires et peut entraîner des dommages au niveau de l’intégrité de la barrière épithéliale et de ses fonctions [34,47,48].

3. Infections respiratoires chez le porc

3.1 Généralités

Malgré la grande efficacité des mécanismes de défenses présents au niveau des voies respiratoires normales du porc permettant de prévenir l’invasion et les dommages des poumons, il existe une variété d’agents pathogènes opportunistes ou commensaux aptes à contourner ce système et à entraîner de graves infections. L’origine de ces infections est principalement virale, bactérienne ou une association de ces deux types [49]. Parmi les virus, le «porcine reproductive and respiratory syndrome virus» (PRRSV) est un agent pathogène majeur du porc et comme son nom l’indique, il peut causer des maladies aux niveaux des organes reproducteurs et respiratoires. Plus précisément, ce virus module les réponses immunitaires de l’hôte par sa capacité à engendrer la destruction et la perte de fonctions des macrophages alvéolaires et pulmonaires [49–51]. D’autre part, de nombreuses espèces bactériennes possèdent aussi la capacité d’induire des troubles immunitaires et des lésions résultant en des maladies critiques et mortelles comme la pneumonie [49]_{. Parmi les bactéries}

pathogènes à l’origine de plusieurs infections pulmonaires chez le porc, nous nous sommes intéressés à deux agents entraînant des dommages importants et fréquents aux niveaux pulmonaires, soit Streptococcus suis et Actinobacillus pleuropneumoniae.

3.2 Infections à Streptococcus suis 3.2.1 Généralités

Streptococcus suis est une bactérie à Gram positif se présentant sous forme de coques et est

retrouvée naturellement au niveau de la cavité nasale et des amygdales chez les porcs sains qui représentent le réservoir principal de cette bactérie [5,52–54]. Toutefois, S. suis est à l’origine de plusieurs maladies sévères et mortelles chez le porc, telles que l’arthrite, les méningites, les endocardites, les pneumonies et les septicémies. S. suis est la cause première de mortalité chez les porcelets âgés de 5 à 10 semaines et engendre des pertes économiques

8

importantes dans l’industrie porcine [1]_{. À ce jour, 33 sérotypes différents de S. suis ont été}

identifiés et leur distribution est variable selon la zone géographique [52]_{. Une étude}

rapportant la distribution géographique des différents sérotypes de S. suis en fonction de leur prévalence chez des porcs malades a démontré que le sérotype 2 est celui le plus retrouvé chez ces mêmes porcs [5]. Malgré le fait que le porc est le réservoir principal de cette bactérie,

S. suis est un agent de zoonose émergent en Asie entraînant des maladies similaires et sévères

chez l’humain [55–57]_{. En fait, la littérature a démontré qu’au cours des dernières années, le}

nombre de cas d’infections par S. suis chez l’humain augmente significativement [58]_.

La plupart des infections à S. suis chez l’humain sont le résultat d’une exposition à un porc malade/porteur ainsi qu’à la consommation de viandes porcines crues et contaminées par cette bactérie [52,59]. En fait, l’infection débute principalement par la pénétration de cette bactérie au niveau des mains et/ou des bras via des coupures/zones ouvertes suite à un contact avec un porc contaminé, une carcasse ou des viandes [58].

Malgré le fait que S. suis est habituellement une bactérie extracellulaire, celle-ci peut devenir invasive dans certaines conditions. Dans le cas d’une méningite, il est suggéré que l’infection débute par la colonisation des tissus nasopharyngés suivi par sa propagation dans le tractus respiratoire, l’invasion dans le flux sanguin et la pénétration de la barrière cérébrale [60]_.

L’adhésion et l’invasion de la barrière épithéliale ainsi que les processus de survie de la bactérie sont des étapes cruciales à la réussite de l’infection [60]_{. Pour ce faire, les bactéries}

pathogènes expriment différents facteurs de virulence.

3.2.2 Facteurs de virulence

S. suis possède plusieurs facteurs de virulence dont certains sont impliqués dans sa survie et

son potentiel infectieux chez le porc. Dans cette section, les principaux facteurs de virulence de S. suis menant à l’invasion des tissus pulmonaires seront présentés. La capsule polysaccharidique est une structure extracellulaire variable retrouvée chez S. suis. Elle est fréquemment la première structure rencontrée par le système immunitaire lors d’une infection. Il fut démontré que la capsule de S. suis agit comme une barrière physique interférant et prévenant la phagocytose par les cellules phagocytaires de l’hôte résultant en la survie de la bactérie [61]. Cependant, lorsqu’internalisée, la capacité de S. suis à résister

9

aux mécanismes intracellulaires des cellules phagocytaires pourrait également impliquer d’autre facteurs propres à cette bactérie [62]_.

La suilysine est une protéine extracellulaire sécrétée et constituée de 497 acides aminés dont le poids moléculaire est d’environ 45 kDa [60]. Plus précisément, la suilysine est une hémolysine produite par certaines souches de S. suis et appartenant à la famille des cytolysines dépendantes au cholestérol formatrice de pores. Elle possède un large spectre de mécanismes d’action [63–65] _{et participe activement aux processus infectieux de S. suis} [60]_.

Outre sa capacité hémolytique sur les globules rouges [60], la suilysine entraîne des effets cytotoxiques sur plusieurs types de cellules, incluant les cellules épithéliales, endothéliales et phagocytaires [63,65,66]. Elle exerce également des effets sur l’adhérence, la réduction du nombre de cellules ciliées, l’apoptose et l’invasion de cellules épithéliales retrouvée au niveaux des voies respiratoires [67,68]. Il a également été démontré que la suilysine permet la migration de S. suis au travers de la barrière hémato-encéphalique [69,70], favorise l’invasion de cellules épithéliales [60,67], réduit la capacité du complément et des phagocytes (neutrophiles, macrophages et cellules dendritiques) à éliminer S. suis [71] et stimule une réponse inflammatoire chez différentes types cellulaires, tels que les cellules épithéliales [60].

S. suis possède également plusieurs autres facteurs de virulence pouvant être impliqués

directement ou indirectement dans les infections. En effet, S. suis peut former un biofilm et possède des adhésines favorisant son attachement aux cellules épithéliales de l’hôte ce qui assure l’initiation de l’infection [61,72,73]_{. Ces adhésines sont exprimées en réponse aux}

conditions environnementales ainsi que de croissance et vont se lier spécifiquement à des molécules de surface retrouvées sur des cellules particulières ou à des composantes de la matrice extracellulaire [72]. De plus, les adhésines de S. suis jouent un rôle important notamment dans le contournement des mécanismes du système mucosal de l’hôte au niveau des voies respiratoires supérieures [74]. S. suis peut également produire des protéases qui sont des enzymes hydrolytiques catalysant la coupure de liens peptidiques dans les protéines et les peptides [75]. Concrètement, il est connu que certaines protéases présentes chez S. suis inactivent l’immunoglobuline A qui joue un rôle important dans la défense primaire de l’hôte contre divers agents pathogènes [76]. D’autres protéases peuvent également moduler la réponse inflammatoire de l’hôte [77]_.

10

3.2.3 Interaction de S. suis avec les cellules épithéliales

Lors de l’initiation du processus infectieux, S. suis adhère aux cellules épithéliales via différentes composantes [78]. Cette adhérence est notamment possible grâce à la régulation de l’expression de la capsule. En effet, durant la colonisation et l’invasion de la barrière épithéliale respiratoire, la capsule de S. suis est réduite ce qui pourrait favoriser l’exposition des adhésines et donc l’adhérence de la bactérie aux cellules épithéliales [79]. Il a été rapporté que les souches virulentes de S. suis produisent davantage de biofilms que les souches avirulentes au niveau de l’épithélium [80]_{. Sachant que sous forme de biofilms l’adhérence}

aux cellules épithéliales est réduite et que les dommages engendrés aux tissus sont moindres dû à une réduction de l’activité métabolique, il est suggéré que cette stratégie est à l’origine de la présence commensale de cette bactérie au niveau du microbiome buccal porcin [78,80]. De plus, les voies respiratoires supérieures sont riches en profondes invaginations épithéliales, il est donc fort probable que ces zones permettent à la bactérie d’éviter le système immunitaire inné [81,82]_{. Suite à son adhérence, S. suis doit migrer au travers de la barrière}

épithéliale afin d’atteindre le système sanguin et envahir les tissus de prédilection. En fait, il fut démontré que cette bactérie peut pénétrer la barrière épithéliale du plexus choroïde afin d’atteindre le système nerveux central et engendrer une méningite [61,81]_{. S. suis peut}

également se déplacer au travers de la muqueuse intestinale porcine résultant en l’atteinte du réseau sanguin, la colonisation de différentes tissus suivi par les symptômes cliniques [83]. Malgré la connaissance de ces différentes interactions entre S. suis et les cellules épithéliales, les mécanismes et les facteurs de virulence impliqués leurs étant associés sont peu connus dans la littérature actuelle.

3.2.4 Prévention et traitements

La prévention contre les infections à S. suis dans les fermes porcines débute par le contrôle des conditions environnementales (ventilation/température stables et régulées) et de l’arrivée de nouveaux porcs dans le troupeau. Le statut immunitaire du troupeau ainsi que le contrôle de certains virus qui augmentent la susceptibilité aux maladies/lésions par S. suisinfluencent également la santé du troupeau. Certains antibiotiques sont également utilisés afin de prévenir la prolifération de cette bactérie, comme la pénicilline V/G et l’amoxicilline. Plus spécifiquement, l’utilisation de substances antimicrobiennes doit prendre en considération la

11

biodisponibilité de la substance, la route d’administration et la concentration nécessaire à l’élimination de S. suis, rendant cette pratique très complexe. Actuellement, seul l’usage du ceftiofure favorise la réduction significative de la mortalité cellulaire et de la sévérité des lésions pulmonaires entraînées par S. suis tout en limitant sa régénération au niveau des tissus nécrosés [1]. La vaccination est également utilisée pour la prévention des infections à S. suis et cible principalement les antigènes de la capsule, quoique les résultats obtenus suite à leur utilisation sont inconsistants. Ce phénomène pourrait être lié à la faible immunogénicité de la capsule bactérienne [1,84]. De plus, puisque la vaccination est effectuée à un bas âge, l’interférence engendrée par les anticorps maternels est à considérer également [1]_{. La}

recherche d’une cible optimale pour la production d’un vaccin contre S. suis est toujours en cours et plusieurs candidats potentiels sont actuellement à l’étude [85].

L’élimination complète de S. suis dans un troupeau malade nécessite la dépopulation et le renouvellement du troupeau en plus de l’insertion de mesures de biosécurité strictes. Cependant, ces mesures sont très couteuses et le risque d’échec est présent. D’ailleurs, il est difficile de maintenir un troupeau sain dû à l’absence d’appareils monitorant le statut des porcs d’où l’intérêt de contrôler/prévenir les infections à S. suis plutôt que d’envisager l’éradication du troupeau [1]_.

3.3 Infections à Actinobacillus pleuropneumoniae 3.3.1 Généralités

A. pleuropneumoniae est un court bacille encapsulé et anaérobie facultatif à Gram négatif

appartenant à la famille des Pasteurellaceae dont le réservoir est le porc uniquement [32,86–

88]_{. Cette bactérie est la cause de la pleuropneumonie porcine, une maladie respiratoire sévère}

et contagieuse affectant le porc et entraînant des pertes économiques importantes dans l’industrie porcine mondiale [87,89]_{. Elle est transmise principalement par voie aérienne}

(aérosols) ou via un contact direct entre un porc malade et un porc sain [90]. Il existe deux biotypes différents d’A. pleuropneumoniae; le biotype 1 est dépendant de la présence de nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) pour croître alors que le biotype 2 en est indépendant [1,91]. À ce jour, 18 sérotypes différents d’A. pleuropneumoniae ont été identifiés et les plus virulents sont les sérotypes 1, 5, 9, 10, 11 et 14 [90,91].

12

L’infection engendrée par A. pleuropneumoniae débute par la colonisation des voies respiratoires supérieures suivie par l’invasion de la barrière épithéliale. Par la suite, la desquamation de ces cellules épithéliales permet à cette bactérie d’atteindre les voies respiratoires inférieures où elle adhère aux pneumocytes sur les alvéoles entraînant l’apparition de symptômes cliniques tels que la pneumonie [1]_.

3.3.2 Facteurs de virulence

A. pleuropneumoniae possède la capacité de produire plusieurs facteurs de virulence jouant

un rôle crucial lors de son processus infectieux, que ce soit au niveau de sa survie ou de sa prolifération. Les bactéries à Gram négatif, comme A. pleuropneumoniae, possèdent une membrane externe dont le feuillet externe est riche en lipopolysaccharides (LPS). Le LPS est composé de trois domaines, soit le lipide A, le noyau oligosaccharidique et l’antigène O, et est considéré comme un important stimulant bactérien du système immunitaire inné chez divers types cellulaires [92]_{. L’antigène O est le fragment polysaccharidique retrouvé à la}

surface externe de la membrane externe et est spécifique à chaque sérotype [93,94]_{. Il est}

responsable notamment du caractère antigénique de la bactérie [94]_{. La partie centrale est}

composée d’une structure interne conservée entre les différentes souches d’A.

pleuropneumoniae et d’une structure externe variable entre les différents sérotypes [95]. Le

lipide A est un domaine hydrophobique retrouvé le plus profondément dans la membrane externe parmi les 3 domaines et est le seul essentiel à la survie de la cellule bactérienne. En fait, il est une endotoxine augmentant la résistance aux antibiotiques et aux conditions stressantes environnantes en plus de participer à l’évasion de la bactérie vis-à-vis les médiateurs de reconnaissance du système immunitaire innée de l’hôte [96,97]_{. Outre sa}

capacité à stimuler grandement le système immunitaire de l’hôte, il est connu que le LPS joue un rôle majeur dans l’adhésion des bactéries à Gram négatif aux cellules respiratoires de l’hôte [95,98]_.

A. pleuropneumoniae possède également une capsule polysaccharidique qui montre une

épaisseur variable selon le sérotype en question et possède des propriétés anti-phagocytaires [99–101]. En fait, il est assumé que cette structure représente la défense principale d’A. pleuropneumoniae contre le système immunitaire humorale de l’hôte [99,102]_.

13

De plus, il fut démontré que l’absence de capsule suite à une mutation réduit la virulence chez le porc [99]_.

Les facteurs de virulence les plus importants dans la formation de lésions par A.

pleuropneumoniae sont les toxines «Actinobacillus pleuropneumoniae RTX-toxin; Apx».

Ces toxines appartiennent à la famille des «repeats in toxin; RTX» [90]. Elles sont impliquées dans la formation de pores et peuvent entrainer la lyse plusieurs types cellulaires différents, tels que les cellules épithéliales alvéolaires et certaines cellules phagocytaires [86,103–105]. Il est suggéré que l’adhésion d’A. pleuropneumoniae aux cellules de l’hôte permet le largage de ces toxines directement sur la surface cellulaire résultant en la destruction de celles-ci [101]. Ces toxines sont très immunogènes et induisent une forte réponse d’anticorps suite à une infection par A. pleuropneumoniae [90,105]. À ce jour, il existe quatre types de toxines Apx et chaque souche virulente d’A. pleuropneumoniae exprime une ou deux toxines dans les types 1 à 3 et chacune d’entre elles exprime le type 4 [86]_{. En fait, il fut démontré que le type 4 est}

essentiel à l’optimisation de la virulence chez A. pleuropneumoniae [86,90,106]_{. Cela dit, la}

toxine Apx de type 4 est sécrétée exclusivement en condition in vivo [107]. Les effets observés en présence des toxines Apx dépendent du type présent. La toxine Apx de type 1 possède un potentiel hémolytique et cytotoxique important et est exprimée par les souches les plus virulentes. Le type 2 est modérément hémolytique et cytotoxique et le type 3 s’avère exclusivement cytotoxique [90,105,108]_.

Les microvésicules ou vésicules membranaires externes sont sécrétées par la plupart des bactéries à Gram négatif et participent à de nombreuses fonctions biologiques allant de la livraison de nutriments à la modulation immunitaire [109–111]_{. Les vésicules membranaires}

sont larguées durant toutes les phases de croissance et possèdent habituellement des propriétés antigéniques très similaires à celles de la bactérie [111]. Elles stimulent grandement le système immunitaire de l’hôte dû à la présence de LPS et de protéines immunomodulaires à leur surface [111,112]. Les vésicules membranaires d’A. pleuropneumoniae sont reconnues pour contenir des protéases et des toxines Apx [113].

A. pleuropneumoniae possède d’autres facteurs de virulence jouant un rôle direct ou indirect

dans sa pathogénicité. Cette bactérie dispose notamment d’adhésines, de fimbriaes et de protéines membranaires externes qui augmentent son adhésion aux cellules de l’hôte [86,114]_.

14

A. pleuropneumoniae exprime également des facteurs de virulence assurant sa survie via

l’acquisition de nutriments essentiels, comme des transporteurs et des récupérateurs de fer, et peut former des biofilms [86,115,116]. D’autres part, certaines protéases peuvent protéger la bactérie via la dégradation de certains types d’immunoglubulines facilitant son évasion du système immunitaire [117,118].

3.3.3 Interaction d’A. pleuropneumoniae avec les cellules épithéliales

Il fut démontré qu’A. pleuropneumoniae peut induire rapidement la mort de cellules épithéliales des voies respiratoires supérieures du porc via la nécrose et non par apoptose [115]. Quoique cette bactérie adhère aux cellules épithéliales, aucune invasion cellulaire n’a été observée. A. pleuropneumoniae peut également induire l’activation de la voie NF-ΚB et engendrer une réponse pro-inflammatoire chez les cellules épithéliales affectées [115]. Outre ces faits, les interactions entre cette bactérie et les cellules épithéliales ont été très peu étudiées. Dans la section résultats de ce mémoire, il est démontré qu’A. pleuropneumoniae induit une réponse pro-inflammatoire importante au niveau de l’épithélium respiratoire du porc en plus d’y induire de sérieux dommages au niveau de la fonction barrière [32]_.

3.3.4 Prévention et traitements

Les stratégies de prévention des pleuropneumonies porcines sont principalement basées sur des mesures de biosécurité externes empêchant l’introduction de porcs porteurs dans un troupeau sain et sur des mesures internes axées sur la séparation des porcs selon leur

âge [89,119]. Le contrôle des facteurs respiratoires ambiants dans une enceinte fermée est

également à considérer. Il fut démontré que tous les facteurs ayant un impact négatif sur les mécanismes de défense du système immunitaire mucosal augmentent les probabilités de maladies infectieuses respiratoires; ces facteurs incluent la poussière et/ou l’ammoniac [89,120].

D’autre part, il existe différents traitements permettant l’élimination/le contrôle d’A.

pleuropneumoniaedes porcs infectés, mais aucun n’offre une protection complète contre cet

agent pathogène [89,121]_{. En général, la vaccination et l’utilisation d’antibiotiques diminuent}

la sévérité des symptômes cliniques et le taux de mortalité chez le porc. Cependant, une augmentation continue de la résistance chez A. pleuropneumoniae à divers agents antimicrobiens, incluant la tétracycline et la pénicilline, a été observée [89,122,123]. Par ailleurs,

15

les vaccins commerciaux actuels ciblant A. pleuropneumoniae diminuent significativement les symptômes cliniques observés chez le porc, mais n’ont pas d’effets protecteurs considérables contre les infections et leurs transmissions [89,121]. La combinaison de ces diverses méthodes permet une protection plus optimale. Cela dit, cette pratique dans de grandes fermes porcines engendre des défis importants au niveau financier et logistique ce qui augmente la nécessité de mettre en place un traitement et des protocoles d’éradication efficaces [89].

4. Problématique

Les infections causées par S. suis et A. pleuropneumoniae sont de plus en plus fréquentes et entraînent des coûts importants dans l’industrie porcine mondiale en plus d’être une menace pour la santé de l’homme. Cette problématique est liée à un défi de taille, la résistance aux antibiotiques. En fait, l’efficacité des traitements disponibles actuellement sur le marché afin de contrôler ces deux bactéries pathogènes diminue graduellement. Afin de faciliter le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, une meilleure compréhension des mécanismes d’invasion de S. suis et A. pleuropneumoniae est essentielle. La découverte de composantes actives impliquées dans la pathogénèse de ces bactéries et ayant le potentiel de constituer une cible thérapeutique pourrait permettre de résoudre ce problème.

Nous nous sommes donc intéressés à la première ligne de défense immunitaire de l’hôte, soit la barrière épithéliale, avec pour but d’étudier la capacité de ces agents pathogènes à pénétrer l’épithélium et de cibler les composantes actives impliquées. Les composantes de S. suis et

A. pleuropneumoniae impliquées dans la pénétration de l’épithélium des voies respiratoires

supérieures du porc étant inconnues, nous avons utilisé un modèle cellulaire représentatif de ces voies, les cellules épithéliales de la trachée d’un porcelet (NPTr) [124].

5. Hypothèse et objectifs

Nous avons donc émis l’hypothèse que S. suis et A. pleuropneumoniae perturbent directement et/ou indirectement le fonctionnement de la barrière épithéliale des voies respiratoires supérieures du porc permettant leur passage.

16

1. Caractériser les interactions entre A. pleuropneumoniae et les cellules épithéliales de la trachée du porc.

2. Évaluer les effets du TNF-α sur les cellules épithéliales de la trachée du porc. 3. Étudier les interactions entre S. suis et les cellules épithéliales de la trachée du porc.

17

Chapitre 1: Effets d’Actinobacillus pleuropneumoniae sur la fonction

barrière et la réponse inflammatoire des cellules épithéliales de la trachée

du porc

Chapter 1: Effects of Actinobacillus pleuropneumoniae on barrier function

and inflammatory response of pig tracheal epithelial cells

Philippe Bercier1, Marcelo Gottschalk2,3 and Daniel Grenier1,3*

1 _{Groupe de Recherche en Écologie Buccale (GREB), Faculté de médecine dentaire,}

Université Laval, Quebec City, Quebec, Canada;

2 _{Groupe de Recherche sur les Maladies Infectieuses en Production Animale (GREMIP),}

Faculté de médecine vétérinaire, Université de Montréal, Saint-Hyacinthe, Quebec,

Canada;

3 _{Centre de Recherche en Infectiologie Porcine et Avicole (CRIPA), Fonds de Recherche}

du Québec - Nature et Technologies (FRQNT), Saint-Hyacinthe, Quebec, Canada

* Corresponding author at: Groupe de Recherche en Écologie Buccale (GREB), Faculté de

médecine dentaire, Université Laval, 2420 rue de la Terrasse, Quebec City, Quebec,

Canada, G1V 0A6. Tel: (418) 656-7341. Fax: (418) 656-2861. E-mail:

18

1.1 Résumé

Actinobacillus pleuropneumoniae est une bactérie pathogène respiratoire entraînant des

pleuropneumonies porcines, une maladie respiratoire mortelle responsable d’importantes pertes économiques dans l’industrie porcine mondiale. Afin de mieux comprendre les interactions entre A. pleuropneumoniae et l’épithélium respiratoire porcin, nous avons étudié la capacité de ce pathogène à engendrer des dommages à la barrière épithéliale et à induire une réponse inflammatoire. Nous avons démontré qu’A. pleuropneumoniae est apte à endommager l’intégrité de la barrière épithéliale de la trachée à partir d’une multiplicité d’infection de 10 à l’aide de la mesure de la résistance électrique transépithéliale et du transport du FITC-dextran. Des analyses par immunofluorescence suggèrent également qu’A.

pleuropneumoniae affecte deux protéines de jonctions serrées importantes (occludine, zonula

occludens-1). Le bris de l’intégrité de la barrière épithéliale a pour conséquence de permettre la translocation d’A. pleuropneumoniae au travers d’une monocouche cellulaire. Nous avons également observé la capacité des cellules épithéliales de la trachée à sécréter des cytokines pro-inflammatoires (IL-8, IL-6, TNF-α) en réponse à une stimulation avec cette bactérie pathogène. En somme, A. pleuropneumoniae peut induire des dommages à la barrière épithéliale de la trachée du porc. Les interactions entre les cellules épithéliales et A.

pleuropneumoniae ont également été associées avec une sécrétion de cytokines

pro-inflammatoires. Cette meilleure connaissance des interactions entre A. pleuropneumoniae et les cellules épithéliales pourrait aider au développement de nouvelles stratégies de prévention contre l’invasion de l’épithélium respiratoire porcin par cette bactérie et d’autres bactéries pathogènes respiratoires.

Mots clés: Actinobacillus pleuropneumoniae, pleuropneumonie porcine, cellules épithéliales

19

1.2 Abstract

Actinobacillus pleuropneumoniae is a respiratory pathogen that causes porcine

pleuropneumonia, a fatal respiratory disease responsible for high economic losses in the swine industry worldwide. With the objective to better understand the interactions between

A. pleuropneumoniae and the porcine respiratory epithelium, we investigated the capacity of

this pathogen to damage the epithelial barrier and induce an inflammatory response. We showed that A. pleuropneumoniae, even at a multiplicity of infection of 10, is able to break the tracheal epithelial barrier integrity as determined by monitoring the transepithelial electrical resistance and FITC-dextran transport. Immunofluorescence staining analysis suggested that A. pleuropneumoniae is affecting two important tight junction proteins (occludin, zonula occludens-1). As a consequence of the breakdown of the epithelial barrier integrity, A. pleuropneumoniae can translocate across a cell monolayer. We also showed that tracheal epithelial cells secrete pro-inflammatory cytokines (IL-8, IL-6, TNF-α) in response to a stimulation with this pathogen. In summary, A. pleuropneumoniae is able to induce damage to the porcine respiratory epithelial barrier. Challenging the epithelial cells with A.

pleuropneumoniae was also associated with the secretion of pro-inflammatory cytokines.

This better knowledge of the interactions between A. pleuropneumoniae and the epithelial cells may help to design novel strategies to prevent epithelium invasion by this bacterium along with other swine respiratory pathogens.

Keywords: Actinobacillus pleuropneumoniae, porcine pleuropneumonia, respiratory

20

1.3 Introduction

Actinobacillus pleuropneumoniae is a Gram-negative encapsulated coccobacilli. Two

biotypes can be distinguished based on their dependency for nicotinamide adenine dinucleotide. A. pleuropneumoniae is a respiratory pathogen that causes porcine pleuropneumonia, a highly contagious and mostly fatal respiratory disease responsible for important economic losses in the swine industry worldwide. This bacterium is transmitted mainly through direct contact following introduction into a herd of asymptomatic carrier pigs

[1–3]_{. Porcine pleuropneumonia can induce severe pulmonary tissue damages leading to}

clinical symptoms and mortality. A. pleuropneumoniae infections are difficult to eradicate due to the ability of bacteria to adapt and persist in the host [4,5]. This capacity is likely related to the production of several virulence factors, including fimbriae, proteases, lipopolysaccharide (LPS), capsular polysaccharide, and pore-forming Apx exotoxins [2,5]. Initially, A. pleuropneumoniae adheres and colonizes the upper respiratory tract. More specifically, this pathogen can produce biofilm aggregates on respiratory tissues as well as form multi-species biofilms with other respiratory pathogens [2]. The desquamation of colonized epithelial cells may allow bacteria to reach the lower respiratory tract where they can adhere to pneumocytes in the alveoli and cause disease [1,5,6]_.

The epithelium is a dynamic and organized polarized tissue made of adherent cells [7,8]. It represents the first line of defense that acts as a physical barrier to protect the host from the environmental microbial pathogens [9]_{. Moreover, epithelial cells can recognize pathogens}

through pattern recognition receptors (PRRs) thus resulting in the secretion of antimicrobial peptides (β-defensins) and pro-inflammatory cytokines [10]. Epithelial cells are connected to each other by intercellular tight junctions. Epithelial tight junctions are mainly composed of peripheral membrane proteins (claudins, occludin, zonula occludens-

1 [ZO-1]) and transmembrane proteins (β-catenin, E-cadherin, junctional adhesion proteins) that forms a selective permeable seal between adjacent epithelial cells and demarcates the boundary between apical and basolateral membrane domains [8,11,12].

Given the significant economic losses in porcine industry worldwide associated with A.

21

pleuropneumonia is needed. The exact mechanisms used by A. pleuropneumoniae to translocate through the respiratory epithelium are still not completely understood. The purpose of this study was to investigate the effects of A. pleuropneumoniae on the barrier function of tracheal epithelial cells. The response of epithelial cells to an A.

pleuropneumoniae challenge with regard to the secretion of pro-inflammatory cytokines was

also studied.

22

1.4 Materials and methods

1.4.1 Bacteria and growth conditions

A. pleuropneumoniae 81750 (biotype 1, serotype 5b), initially isolated from the lung of a

diseased pig [13], was used in this study. Bacteria were grown in Bacto™ Todd Hewitt Broth (BD, Mississauga, ON, CA) supplemented with 1% nicotinamide adenine dinucleotide, at 37°C under aerobic static conditions for 24 h, allowing to reach a final optical density at 660 nm of ≈ 0.6. Bacteria were harvested by centrifugation (11000 x g for 10 min) and suspended in Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium (DMEM) at a concentration of 1 x 1010 _cells

per ml as determined using a Petroff-Hausser counting chamber. For some assays, bacteria were heat-inactivated by a treatment at 100°C for 5 min.

1.4.2 Determination of epithelial tight junction integrity

The newborn pig tracheal cells (NPTr) are non-carcinoma and non-transformed adherent epithelial cells that have been previously characterized [14]. These tracheal epithelial cells were used to evaluate the effects of A. pleuropneumoniae on tight junction integrity by monitoring the transepithelial electrical resistance (TER) as previously described [15]. Cells were grown in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Wisent Inc., Saint-Jean-Baptiste, QC, CA), 1% (v/v) 1M HEPES and 100 µg/ml of penicillin Gstreptomycin at 37°C in a 5% CO2 atmosphere. Cells were used at passages 50-70. NPTr cells were seeded

(1 x 105 _{cells per insert) on Costar} _Transwell _{clear polyester membrane inserts (6.5 mm}

in diameter, 0.4-μm pore size; Corning Co., Cambridge, MA, USA). The basolateral and apical compartments were filled with 0.6 ml and 0.1 ml of culture medium, respectively. After 7 days of incubation, the conditioned medium was replaced with antibiotic-free DMEM and cells were further incubated for 18 h. A. pleuropneumoniae at multiplicity of infections (MOIs) of 1, 10, and 100 bacteria per NPTr cell was added to the medium in the apical compartment to determine the effect of bacteria on the integrity of the epithelial tight junction. Killed bacteria (at an MOI of 1000) were also tested. The TER values were measured with an ohm/voltmeter (EVOM2; World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA) after 0, 24, and 48 h. Resistance values were calculated in Ohms (Ω)/cm2 by multiplying the resistance values by the surface area of the membrane filter. Results were compared with the basal control value measured at time 0 h (100% value).

23

1.4.3 Fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran transport

The capacity of A. pleuropneumoniae to alter the tight junction integrity of porcine tracheal epithelial cells was confirmed by a paracellular permeability assay using fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated dextran (FD-4; molecular weight = 4.4 kDa; SigmaAldrich Canada Co., Oakville, ON, Canada). NPTr cells were cultured on Transwell membrane inserts as described above. Basolateral medium was replaced with Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) prior to add A. pleuropneumoniae at MOIs of 1, 10, 100 and 1000, and FD-4 (1 mg/ml in culture medium) in the apical compartment. Fluorescence in the basolateral compartment was measured after 0, 12, and 24 h of incubation using a Synergy 2 microplate reader (BioTek Instrument; Winooski, VT, USA).

1.4.4 Determination of cell viability

To assess the viability of the NPTr cells incubated (24 h) with A. pleuropneumoniae (MOIs of 1, 10, and 100), a cytotoxicity detection kit (LDH; Roche Diagnostics, Québec, Canada) was used according to the manufacturer’s protocol.

1.4.5 Immunofluorescent staining of occludin and zonula occludens-1

NPTr cells were cultivated and treated as described above with A. pleuropneumoniae at MOIs of 1, 10 and 100 for 24 h. Afterward, the medium was aspirated and cells were fixed in phosphate-buffered saline (PBS; pH 7) containing 4% paraformaldehyde for 20 min, permeabilized with 0.1% Triton-X100 for 5 min, and blocked in 3% non-fat milk in 20 mM Tris hydrochloride buffer (pH 8) containing 150 mM NaCl and 0.5% Tween 20 for 30 min. The cells were then labeled with anti-occludin antibody - Alexa Fluor® 488 conjugate (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) and anti-ZO-1 antibody - Alexa Fluor® 594 conjugate (Thermo Fisher Scientific) at 2.5 μg/ml in blocking buffer for overnight at 4°C. The cells were washed with PBS and treated with ProLong® Diamond antifade (Life Technologies Inc., Burlington, ON, Canada). The slides were then sealed with a coverslip using nail polish and conserved in the dark at 4°C until used. Tight junction proteins were visualized using an Olympus FSX100 fluorescence microscope and FSX-BSW imaging software (Olympus, Tokyo, Japan).

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1.4.6 Bacterial translocation assay

The ability of A. pleuropneumoniae to translocate across a porcine tracheal epithelial cell monolayer was determined using a fluorescent assay. NPTr cells were seeded on Costar Transwell clear polyester membrane inserts (2.1 mm in diameter, 8.0-µm pore size; Corning Co.). The basolateral and apical compartments were filled with 0.25 ml and 0.08 ml of complete DMEM, respectively. After 7 days of incubation, the conditioned medium was replaced with antibiotic-free DMEM, and cells were further incubated for 18 h. The polyester membrane inserts were then transferred on a Transwell black polystyrene plate (Corning Co.) and basolateral wells were filled with HBSS. Cells of A. pleuropneumoniae were labelled with FITC according to a previously described protocol [16]. FITC-labelled bacteria were added in the apical compartment at MOIs of 100. The fluorescence values corresponding to bacteria that migrated across the epithelial cell monolayer were monitored in the basolateral compartment after 24, 48, and 72 h of incubation (37°C; 5% CO2) with a

Synergy 2 microplate reader.

1.4.7 Pro-inflammatory cytokine secretion

NPTr cells in DMEM-10% FBS were seeded in a 12-well microplate at a concentration of 1 x 106 cells/ml for 24 h at 37°C in a 5% CO2 atmosphere. The culture medium was replaced

with DMEM-1% FBS with 1% (v/v) 1M HEPES and 100 µg/ml of penicillin G/streptomycin, and A. pleuropneumoniae cells at MOIs of 1, 10, and 100 were added. Following a 24-h incubation, the culture medium supernatants were collected and stored at -20 °C until used. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits (R&D systems, Minneapolis, MN, USA) were used to determine porcine IL-6, IL-8 and TNF-α concentrations according to the manufacturer’s protocol.

1.4.8 Statistical analysis

All assays were performed in triplicate in at least two independent experiments. The mean ± standard deviations were analyzed for statistical significance used the ANOVA at a p-value of 0.01.