© Pierre-Luc Bélanger, 2018
Développement d'une méthode d'évaluation de la
viabilité et de la stabilité de Bifidobacterium longum par
analyse d'images
Mémoire
Pierre-Luc Bélanger
Maîtrise en génie chimique - avec mémoire
Maître ès sciences (M. Sc.)
Développement d’une méthode d’évaluation
de la viabilité et de la stabilité de
Bifidobacterium longum
par analyse d’images
Mémoire
Pierre-Luc Bélanger
Sous la direction de :
Bruno Gaillet, directeur de recherche
Carl Duchesne, codirecteur de recherche
III
Résumé
Assurer la stabilité des produits probiotiques est un défi technologique important pour l’industrie. En effet, des déviations dans le procédé de production de ces probiotiques peuvent conduire à un déclin dans la population viable qui n’est détectable que plusieurs mois après la fabrication du produit.
Conséquemment, une méthode d’analyse a été développée et évaluée en collaboration avec Pfizer pour prédire la stabilité d’un échantillon de Bifidobacterium longum sous forme lyophilisée. B. longum est ainsi cultivé sur géloses pendant 4 jours, suivi de l’acquisition d’images des plaques. Des données morphologiques sur les colonies sont extraites par analyse d’images et sont utilisées dans un modèle multivarié PLS.
D’abord, les paramètres de la méthode ont été testés et ajustés afin de mieux cerner les capacités de la méthodologie employée. Ainsi, l’épaisseur de la gélose influence les propriétés des couleurs des colonies et accroit la variabilité de la taille des colonies lorsqu’elle est en-dessous de 3,1 mm. D’autre part, la concentration du composé XA n’a
pas d’influence sur la formation des colonies. Le délai de réhydratation avant incubation n’a pas non plus d’effet détectable sous la barre des 2 heures. Enfin, la durée d’incubation préférable a été sélectionnée à 4 jours, avec un nombre de colonies visé d’environ 75 par gélose.
Les essais d’évaluation de la méthode ont révélé sa capacité à distinguer des échantillons issus d’une colonie fraîche d’échantillons lyophilisés. Cependant, les échantillons lyophilisés ayant subi un conditionnement supplémentaire (thermique, oxydatif) n’ont pas pu être distingués d’échantillons lyophilisés non-conditionnés. Ces défis ont été attribués à un effet masquant de la lyophilisation. En conséquence, il est proposé d’étudier l’effet de la lyophilisation en relation avec la méthodologie afin de poursuivre le développement de la méthode.
IV
Table des matières
Résumé ... III Table des matières ... IV Liste des tableaux ... VII Liste des figures ... VIII Liste des abréviations ... XI Remerciements ... XIII Financement ... XIII Diffusion des résultats ... XIV
Introduction ... 1
Mise en contexte ... 1
Problématique ... 1
Objectifs ... 2
Chapitre 1 – Recherche bibliographique et état de l’art ... 5
Microorganisme étudié ... 5
Production industrielle de probiotiques ... 7
Stabilité des probiotiques ... 10
Généralités sur la stabilité des produits pharmaceutiques ... 10
Facteurs ayant une influence sur la stabilité des probiotiques ... 11
Revue de méthodes d’analyse potentielles ... 12
Méthodes nécessitant la croissance ... 12
Méthodes ne nécessitant pas la croissance ... 18
Synthèse et sélection ... 24
V
Culture de B. longum ... 27
Conditionnement d’échantillons ... 27
Mise en culture d’échantillons ... 29
Variation des paramètres de culture ... 30
Détermination de la proportion de cellules blessées ... 32
Essais de stabilité ... 33
Acquisition d’images ... 34
Acquisition en continu ... 34
Acquisition finale ... 34
Traitement des images ... 36
Analyse multivariée ... 39
PCA ... 39
PLS ... 43
Application aux données générées ... 44
Chapitre 3 – Résultats ... 49
Essais préliminaires ... 49
Confirmation de l’identité de la souche ... 49
Confirmation de la justesse méthode de culture... 49
Réduction de la population viable par les conditionnements ... 49
Facteurs influençant la croissance des colonies ... 51
Épaisseur de la gélose... 51
Concentration du composé X ... 54
Délai avant incubation... 56
Durée de l’incubation et nombre de colonies sur la gélose ... 60
Essais de dégradation accélérée... 66
VI
Effet du conditionnement sur le taux de dégradation ... 66
Distinction entre échantillons conditionnés ... 68
Comparaison d’échantillons lyophilisés et d’échantillons frais ... 68
Caractérisation des conditionnements ... 71
Discrimination des échantillons conditionnés par traitement oxydatif ... 73
Discrimination des échantillons conditionnés par traitement thermique ... 77
Chapitre 4 - Discussion ... 82
Facteurs influençant la croissance des colonies ... 82
Épaisseur de la gélose... 82
Concentration du composé X ... 83
Délai avant incubation... 83
Durée de l’incubation et nombre de colonies sur la gélose ... 84
Essais de dégradation accélérée... 87
Distinction entre échantillons conditionnés ... 89
Conclusion ... 93
Bibliographie ... 95
VII
Liste des tableaux
Tableau 1: Principales caractéristiques de B. longum ... 6 Tableau 2: Effets des microorganismes probiotiques sur la santé humaine (adapté de 13) . 7 Tableau 3: Temps de doublement de divers microorganismes (le temps rapporté est le plus court mentionné dans la référence associée) ... 15 Tableau 4: Épaisseurs calculées de la gélose selon le volume utilisé ... 31 Tableau 5: Sels utilisés sous forme de solutions saturées pour contrôler l'humidité lors des essais de stabilité ... 34 Tableau 6: Liste des descriptions ajoutées à chaque variable (représentée sous le terme générique Variable dans le tableau) ... 38 Tableau 7: Réduction du nombre de CFU par exposition d'un échantillon lyophilisé de B. longum à de hautes températures pendant plusieurs heures ... 50 Tableau 8: Réduction du nombre de CFU par exposition d'un échantillon lyophilisé de B. longum aux vapeurs d’une solution de peroxyde d’hydrogène 3% (V/V) pendant la durée indiquée ... 51 Tableau 9: 10 premiers VIP du modèle PLS ajusté à l'ensemble des données générées en variant l'épaisseur de la gélose ... 52 Tableau 10: Premiers VIP d'un modèle PLS formé pour prédire le nombre de colonies présentes sur chaque gélose ... 64 Tableau 11: Taux de dégradation calculé expérimentalement et comparé aux résultats d’Abe et al. 2009, rapporté en log10(CFU/g/mois) ... 88 Tableau 12: Liste des variables générées pour décrire les colonies observées sur les images de géloses ... 107
VIII
Liste des figures
Figure 1: Diagramme illustrant la structure générale de la méthode à développer ... 3
Figure 2: Schéma concis des étapes de production de microorganismes probiotiques, incluant quelques alternatives pour les opérations unitaires à effectuer ... 7
Figure 3: Schéma représentant les facteurs ayant une influence sur la croissance de microorganismes ... 16
Figure 4: Séquence de mortalité d’E. coli exposée à des rayonnements UV, basé sur les résultats de Berney et al. 2006 ... 21
Figure 5: Schéma des 4 types de conditionnements oxydatifs effectués ... 28
Figure 6: Diagramme du montage utilisé pour l'acquisition d'images finales ... 35
Figure 7: Photo du montage utilisé pour l'acquisition d'images finales ... 35
Figure 8: Exemple d'image de colonies de B. longum sur gélose ... 36
Figure 9: Explication géométrique d'un modèle PCA à 2 composantes (le centre du modèle est représenté par un point blanc) ... 41
Figure 10: Images de géloses aux différentes épaisseurs testées ... 52
Figure 11: Aire médiane des colonies en fonction de l'épaisseur de la gélose, standardisée par rapport à la moyenne de l’essai, avec intervalles de confiance à 95% ... 53
Figure 12: Coefficient des variables présentant les corrélations les plus fortes avec la concentration en composé X ... 54
Figure 13: Variables individuelles ayant un poids important dans le modèle PLS ajusté aux données issues de géloses à différentes concentrations du composé X ... 55
Figure 14: Q² résultant de 200 permutations de Y (le modèle original est encadré) ... 56
Figure 15: Variables les plus fortement corrélées au délai avant incubation ... 57
Figure 16: Intensité dans le canal bleu pour la médiane de chaque gélose, comparée à la médiane de l'intensité minimales des colonies pour chaque gélose, en fonction du délai avant incubation, avec intervalles de confiance à 95% (les deux panneaux utilisent le même axe des Y) ... 58
IX
Figure 17: Relation entre le délai avant incubation et l’aire médiane des colonies formées ... 59 Figure 18: Effet du délai avant incubation sur le nombre de CFU ... 60 Figure 19: Diamètre moyen des colonies de B. longum en fonction du temps d’incubation, calculée à partir de la moyenne de 12 colonies ... 61 Figure 20: Taux de croissance du diamètre de colonies de B. longum, calculé à partir de la moyenne de 12 colonies ... 62 Figure 21: Interaction entre le nombre de colonies par gélose et l'aire médiane résultante, explicitée selon le nombre de jours d’incubation ... 63 Figure 22: Graphique de probabilité de la distribution de MajorAxisLength vérifiant l'ajustement à une distribution normale, pour 3 géloses contenant respectivement 32, 112 et 253 colonies, avec intervalles de confiance à 95% (les axes (X et Y) sont identiques pour tous les panneaux) ... 65 Figure 23: Diagramme à barres représentant la distribution de MajorAxisLength calculée pour 3 géloses contenant respectivement 32, 112 et 253 colonies, avec les courbes normales ajustées correspondantes ... 65 Figure 24: Déclin de la population viable de B. longum à 37 °C à différents taux d'humidité ... 66 Figure 25: Profils de dégradation d'échantillons selon divers conditionnements, à 37 °C et 32% HR ... 67 Figure 26: Images de géloses obtenues après la culture d'un échantillon lyophilisé et d'un échantillon frais ... 68 Figure 27: Graphique des scores d’un modèle PCA construit à partir des images d’échantillons lyophilisés et d’échantillons frais (R2 de 0,463 pour t
1, 0,147 pour t2, intervalles de confiance à 95%) ... 69 Figure 28: Prédiction de l'appartenance de chaque observation à son groupe d'origine (échantillon lyophilisé (1) ou frais (0)) ... 70 Figure 29: Boîtes à moustaches montrant la distribution de l'aire médiane des colonies en fonction de leur échantillon d'origine ... 71
X
Figure 30: Comparaison du pourcentage de cellules blessées et intactes en fonction du conditionnement appliqué ... 72 Figure 31: Images de géloses obtenues après culture d'échantillons conditionnés par traitements oxydatifs ... 73 Figure 32: Graphique des scores des 4 types d’échantillons conditionnés avec divers degrés d’oxydation (R2 de 0,226 pour t
1, 0,130 pour t2, intervalles de confiance à 95%) .. 74 Figure 33: Prédiction de l'appartenance de chaque observation à son groupe d'origine (échantillon traité au H2O2 (1) ou contrôle (0)) ... 75 Figure 34: Prédictions de l’appartenance des géloses formées à partir des échantillons conditionnés à l’air et aux vapeurs d’eau en utilisant le même modèle PLS qu’à la Figure 33 ... 76 Figure 35: Q² résultant de 999 permutations de Y (le modèle original est encadré) ... 77 Figure 36: Images de géloses obtenues après culture d'échantillons conditionnés par traitement thermique ... 78 Figure 37: Graphique des scores des 2 types d’échantillons conditionnés thermiquement (R² de 0,303 pour t1, 0,107 pour t2, intervalles de confiance à 95%) ... 79 Figure 38: Prédiction de l'appartenance de chaque observation à son groupe d'origine (échantillon traité à 70 °C (1) ou contrôle (0)) ... 80 Figure 39: Q² résultant de 999 permutations de Y (le modèle original est encadré) ... 80 Figure 40: Fenêtre pour l'acquisition pour laquelle la déviation du diamètre est à l'intérieur de 7,5% du diamètre, calculé selon le taux de croissance instantané à ce point ... 85
XI
Liste des abréviations
°C Degré Celsius
3D 3 dimensions
ADN Acide DésoxyriboNucléique
ANOVA Analysis of Variance
ARN Acide RiboNucléique
ATP Adénosine Tri-Phosphate
B. longum Bifidobacterium longum
CE-LIF Capillary Elecrophoresis - Light Induced Fluorescence
cF Carboxyfluorescéine
CFU Colony Forming Unit
cm Centimètre
CRSNG Conseil de Recherches en Sciences Naturelles et en Génie DA Discriminant Analysis
E. coli Escherichia coli
et al. et alii
FISH Fluorescent in situ hybridization
FRQNT Fonds de recherche du Québec - Nature et technologies
g Gramme
h Heure
HR Humidité Relative
ICH International Conference on Harmonisation
L Litre
log Logarithme
mL Millilitre
mm Millimètre
MRS De Man, Rogosa et Sharpe
NAD Nicotinamide Adénine Dinucléotide NIPALS Nonlinear Iterative Partial Least Squares PCA Principal Components Analysis
pH Potentiel Hydrogène
PLS Projection to Latent Structures
ppm Parties Par Million
RMSE Root Mean Square Error
RMSECV Root Mean Square Error of Cross Validation RMSEE Root Mean Square Error of Estimation RMSEP Root Mean Square Error of Prediction SCGCh Société Canadienne de Génie Chimique SERS Surface Enhanced Raman Spectroscopy
ssp Sous-espèce
XII
TSB Tryptic Soy Broth
v/v Volume par Volume
XIII
Remerciements
Je souhaite d’abord remercier ma famille et mes amis pour avoir su être compréhensifs et patients face à l’isolement auquel j’ai dû avoir recours pour compléter la rédaction de ce mémoire. Leurs encouragements ont été fort appréciés.
Je remercie également l’ensemble de mes collègues chez Pfizer pour leur esprit de camaraderie et leurs conseils. Remerciements particuliers à Bárbara Santos Silva pour m’avoir montré à utiliser un gestionnaire de références et ainsi m’avoir épargné bien du temps sur ce point.
Je désire aussi remercier Pfizer pour l’opportunité exceptionnelle qui m’a été offerte. La valeur de cette collaboration est inestimable à mes yeux et m’a permis d’apprendre et de me développer grandement. Je remercie en particulier mon superviseur industriel Antoine Cournoyer, pour avoir su croire en mes capacités et pour ses judicieux commentaires. Je souhaite aussi remercier les collaborateurs chez CHR Hansen pour leur contribution au projet.
Des remerciements sont également mérités pour Pierre-Marc Juneau et Simon Asselin-Tardif, qui ont par leurs efforts permis de démarrer le projet qui est devenu mon projet de maîtrise.
Un grand merci est dû à mon codirecteur Carl Duchesne pour m’avoir aidé à apprendre sur le domaine de l’analyse multivariée et avoir ainsi su me rendre accessible un sujet occasionnellement ardu.
Je veux chaleureusement remercier mon directeur Bruno Gaillet, pour avoir su me guider à travers ce projet. Tant ses encouragements que ses critiques constructives ont été essentielles à la progression du projet ainsi que de mes compétences. Merci également pour sa disponibilité et son soutien.
Financement
Le projet décrit dans ce mémoire a pu être réalisé par le biais d’une bourse BMP Innovation, financée à part égale par le CRSNG, le FRQNT et Pfizer. L’appui financier du Département de Génie Chimique de l’Université Laval est également gracieusement reconnu.
XIV
Diffusion des résultats
Des éléments des travaux décrits dans le cadre de ce mémoire ont été présentés aux occasions suivantes :
Rencontre Québec-Ontario en Biotechnologie, Montréal, 2015 (Poster) : Présentation du plan du projet et des premiers essais de la méthodologie
Conférence de la Société Canadienne de Génie Chimique (SCGCh), Québec, 2016 (Présentation orale) :
[Traduction du résumé] Alors que le secteur des probiotiques croît considérablement, de nouveaux besoins de contrôle de la qualité doivent être comblés pour les nouveaux produits vendus sur le marché. Alors que les bactéries probiotiques sont traditionnellement testées par des comptes cellulaires et des procédures d’identification, il est également utile d’acquérir une meilleure vue de la viabilité cellulaire et de son comportement lors d’essais de routine. Ce type d’information peut être utilisé pour le diagnostic de procédés et le suivi de la stabilité.
Dans cette optique, l’utilisation d’analyse d’images de la croissance de colonies bactériennes a été investiguée. De façon à développer une telle méthode, l’effet de l’épaisseur de l’agar, du temps de réhydratation, le temps de croissance et l’encombrement des colonies sur l’aspect visuel des colonies sur géloses d’agar ont été quantifiés pour une espèce bactérienne probiotique anaérobie. La connaissance de ces facteurs a ensuite été utilisée pour discriminer et classifier des échantillons conditionnés et des échantillons non-conditionnés en utilisant des méthodes d’analyse de données multivariées.
Symposium de génie chimique du Département de Génie Chimique de l’Université Laval, Québec, 2016 (Présentation orale) :
Présentation générale des résultats, principalement sur la discrimination des échantillons en fonction de leur conditionnement
Présentations internes chez le partenaire industriel, 2015-2017 (Présentation orale) :
1
Introduction
Mise en contexte
La consommation de microorganismes probiotiques par Homo sapiens remonte au néolithique, où l’usage de la fermentation comme méthode de préservation a permis la création d’aliments tels que le fromage et le yogourt1. Depuis ces premières intégrations à l’alimentation humaine, le marché des probiotiques a crû de façon considérable, augmentant au moment d’écrire ces lignes au rythme de 7% annuellement2
. La production de ces microorganismes est désormais portée par une industrie évaluée à hauteur de 35 milliards de dollars en 20152, ce qui constitue une progression remarquable lorsque mise en perspective avec ses débuts modestes.
Un probiotique est défini par l’Organisation Mondiale de la Santé comme étant un « microorganisme vivant qui, lorsqu’ingéré en quantité suffisante, exerce un effet positif sur la santé » (traduction libre de 3). L’atténuation des symptômes du syndrome du côlon irritable4, le raccourcissement de la durée de diarrhées infectieuses5 et le traitement du cancer6 sont quelques-uns des bienfaits rapportés pour ces derniers. À l’instar des médicaments traditionnels, une certaine dose doit minimalement être présente pour espérer en retirer des bénéfices thérapeutiques, ce qui implique que le nombre de microorganismes viables dans le produit doit demeurer suffisamment élevé pour l’ensemble de la durée de vie de ce dernier. Dans cette optique, nombre d’organismes réglementaires, incluant Santé Canada, exigent de la part des producteurs de probiotiques qu’ils indiquent et garantissent un nombre de microorganismes viables qui devra être minimalement présent dans le produit jusqu’à son expiration7
.
Problématique
S’assurer qu’un produit contienne un nombre de microorganismes viables suffisant demeure un défi. En effet, même si le profil de diminution de la population viable est établi par une étude de stabilité lors de l’enregistrement du produit, il est possible que des déviations dans le procédé de production entraînent un déclin plus rapide du nombre de cellules viables. Or, l’approche de contrôle-qualité traditionnellement utilisée consiste à effectuer le décompte du nombre de microorganismes viables à la fin de la chaîne de production et à ne relâcher le lot que si ce nombre est suffisamment élevé pour qu’un déclin normal laisse tout de même un nombre adéquat de cellules en vie.
2
Ainsi, il est possible qu’une déviation entraîne l’utilisation d’un lot de microorganismes dans un état physiologique défavorable à leur préservation, ce qui ne serait pas détecté par la méthodologie standard. Effectivement, l’état physiologique des cellules peut être relié à leur survie à long terme8. Cependant, bien que plusieurs méthodes soient disponibles pour établir l’état physiologique de cellules (cytométrie de flux, microscopie à fluorescence, etc.), ces méthodes n’ont pas été développées et orientées vers la prédiction de la stabilitéB. Il existe donc actuellement une lacune analytique, où une méthode permettant de prédire la stabilité attendue d’un lot de probiotiques serait d’une grande utilité pour l’industrie.
Pour adresser cette problématique, un projet a été amorcé avec l’entreprise Pfizer afin de pouvoir travailler sur un produit concret. Dans cette optique, des travaux ont été effectués sur une bactérie probiotique du nom de Bifidobacterium longum, sélectionnée en collaboration avec le partenaire industriel. Ce microorganisme est principalement utilisé sous forme lyophilisée, et c’est donc ce type d’échantillon qui est normalement utilisé pour effectuer le contrôle de la qualité du produit dans un contexte industriel.
Objectifs
À partir de la problématique générale ainsi qu’en considérant le cas spécifiquement étudié par la collaboration avec Pfizer, un objectif global de projet a pu être dégagé. Cet objectif est donc le suivant :
Développer une méthode rapide de prédiction de la viabilité à long terme de B. longum sous forme lyophilisée
La mention de rapidité dans l’énoncé implique que la méthode doit être suffisamment brève pour qu’elle puisse être faite en parallèle avec les autres tests de contrôle de la qualité qui sont nécessaires. En particulier, le décompte des bactéries viables à la fin de la production requiert quelques jours d’incubation, ce qui constitue donc la durée visée pour la méthode de prédiction de la stabilité. L’expression « viabilité à long terme » fait référence au fait que cette nouvelle méthode doit permettre d’assurer que le nombre de cellules viables demeure au-dessus de la spécification du produit. Enfin, la forme lyophilisée est mentionnée pour la raison qu’il est souhaité de pouvoir effectuer le test à la
B
Cet aspect est abordé plus en profondeur dans la section dédiée à la recherche bibliographique et à l’état de l’art.
3
toute fin de la production, et ce de façon à capter toute déviation ayant pu survenir en cours de procédé.
Figure 1: Diagramme illustrant la structure générale de la méthode à développer
La Figure 1 illustre la méthode à développer d’un point de vue conceptuel et global. Ainsi, l’échantillon initial lyophilisé doit être utilisé pour générer des données sur l’état des cellules qu’il contient. Ces données doivent ensuite pouvoir être prises en charge par un modèle prédictif pouvant estimer le profil de stabilité de l’échantillon.
Afin de mener à bien le développement de la méthode générale, plusieurs sous-objectifs doivent être considérés, sous la forme d’étapes intermédiaires :
1. Identifier et adapter une méthode d’analyse et de prédiction de la viabilité à long terme de B. longum;
2. Quantifier l’effet de paramètres de la méthode d’analyse afin de sélectionner des valeurs propices à son utilisation efficace;
3. Évaluer la capacité de la méthode à distinguer des échantillons de B. longum en fonction de leur conditionnement;
4. Identifier des conditions de stabilité accélérée appropriées pour B. longum sous forme lyophilisée;
5. Calibrer le modèle prédictif en reliant plusieurs échantillons lyophilisés avec leur stabilité résultante.
Dans cette optique, le sous-objectif 1 est principalement accompli par le biais de la revue de littérature de ce mémoire et a été identifié pour s’assurer de concentrer les ressources du projet sur une seule méthode. Ensuite, le sous-objectif 2 a été établi pour améliorer la méthode à partir des premières tentatives et ainsi optimiser sa robustesse en vue d’une utilisation industrielle. Par la suite, le sous-objectif 3 a été considéré dans le but d’évaluer la méthode développée, d’identifier ses limitations et son applicabilité à la résolution de la problématique établie. Le sous-objectif 4 a également pu être abordé dans le cadre de ce
4
projet de maîtrise, sans toutefois pouvoir être complété. Enfin, l’accomplissement du sous-objectif 5 est planifié dans des travaux futurs.
5
Chapitre 1
– Recherche bibliographique et état de
l’art
Microorganisme étudié
Le microorganisme sur lequel l’ensemble des essais a été centré est Bifidobacterium longum ssp longum. Plus spécifiquement, la souche qui a été manipulée est connue sous le code commercial de BB46 et est produite et vendue par CHR Hansen. D’un point de vue phylogénétique, B. longum est rattaché aux actinobactéries et fait partie de l’ordre Bifidobacteriales et de la famille Bifidobacteriaceae. En tant que bifidobactérie (bactérie du genre Bifidobacterium), B. longum est un bacille répondant positivement au test de Gram. Lorsqu’observé au microscope, on note que les cellules ont une forme de bâtonnets, présentent des extrémités renflées et sont fréquemment courbées9.
Au niveau de sa croissance, B. longum est un microorganisme mésophile dont la température optimale de croissance se situe entre 37 et 41 °C. Il est anaérobie microaérotolérant, en ce sens où il peut croître en présence d’une faible quantité d’oxygène et peut survivre à une exposition brève en présence d’oxygène à concentration atmosphérique. Cette caractéristique facilite sa mise en culture, puisqu’il peut être préparé en présence d’oxygène et incubé dans un jarre anaérobie, plutôt que de nécessiter une mise en culture en conditions continuellement anaérobies à l’aide d’une chambre anaérobie. Il est plausible que B. longum utilise les enzymes oxydase et NAD-peroxydase pour transformer l’oxygène en peroxyde d’hydrogène, puis ce dernier en eau10,11, ce qui lui confère donc sa tolérance à l’oxygène.
B. longum ssp longum est principalement retrouvé dans le système digestif d’êtres humains. Ses besoins nutritionnels, tout comme ses conditions de croissance, sont le reflet de son adaptation à ce milieu. Ainsi, B. longum utilise le lactose comme source de carbone de prédilection, au détriment du glucose. En effet, contrairement à la plupart des microorganismes, B. longum effectue la répression catabolique du glucose lorsqu’il est en présence de lactose et consomme donc prioritairement celui-ci avant de consommer le glucose12.
6
Tableau 1: Principales caractéristiques de B. longum
Caractéristique Valeur
Ordre Bifidobacteriales
Famille Bifidobacteriaceae
Espèce Bifidobacterium longum
Sous-espèce Longum
Gram Positif
Forme Bacille
Température de croissance 37-41 °C
Oxygène Anaérobie microaérotolérant
Catalase Négatif
L’intérêt industriel dirigé vers B. longum est principalement dû aux propriétés probiotiques qui lui sont attribuées. Du côté des microorganismes probiotiques en général, les communautés scientifiques et médicales continuent à étudier leurs bénéfices pour la santé notamment dans le cadre d’essais cliniques et de méta-analyses. Le Tableau 2 fait état de quelques-uns de ces bienfaits.
7
Tableau 2: Effets des microorganismes probiotiques sur la santé humaine (adapté de 13)
Condition Effet
Maladie de Crohn Bénéfices faibles ou inexistants14
Colite ulcéreuse Augmentation de la poursuite de la rémission chez les enfants15,16
Syndrome du côlon irritable Diminution de la persistance des symptômes5,17,18
Infection par Clostridium difficile Possible prévention de l’infection et de sa
récurrence19
Diarrhée infectieuse Diminution de la sévérité et de la durée de la diarrhée4
Diarrhée associée aux antibiotiques
Prévention de la diarrhée et réduction des symptômes20
Entérocolite nécrosante Réduction de la mortalité21,22
Toutefois, un nombre important de travaux est en cours afin d’éclaircir les bienfaits potentiels des probiotiques. Pour ce qui est de B. longum, ce dernier a vraisemblablement un effet bénéfique pour le syndrome du côlon irritable et les diarrhées23. En outre, B. longum a été associé à la réduction de la durée et de la sévérité du rhume chez des patients24.
Production industrielle de probiotiques
Il existe plusieurs façons de produire des microorganismes probiotiques à échelle industrielle. La description non-exhaustive présentée dans cette section se veut une brève mise en contexte du reste du projet. Cette description est principalement basée sur l’expérience industrielle de l’auteur de ce mémoire ainsi que sur quelques articles de référence25–29.
Figure 2: Schéma concis des étapes de production de microorganismes probiotiques, incluant quelques alternatives pour les opérations unitaires à effectuer
8
La production débute par la fermentation à petite échelle basée sur un inoculum de la souche d’intérêt, souvent préservé sous conditions cryogéniques. Le microorganisme d’intérêt est introduit aseptiquement dans une enceinte stérile remplie de milieu de culture liquide et est incubé à température contrôlée pour faciliter la division cellulaire. La biomasse produite après la première fermentation à petite échelle est utilisée pour inoculer un bioréacteur de taille supérieure. Cette séquence est répétée successivement jusqu’à l’obtention d’un inoculum suffisamment grand pour l’inoculation du bioréacteur principal. L’approche traditionnelle utilisée pour la culture de microorganismes probiotiques est une culture semi-continue. Selon ce paradigme, le bioréacteur est partiellement rempli de milieu de culture avant d’être inoculé. Durant la croissance du microorganisme, des nutriments sont ajoutés au bioréacteur jusqu’à ce qu’une quantité adéquate de biomasse soit atteinte, ce qui correspond généralement à l’atteinte du niveau maximal du bioréacteur. L’opération d’un bioréacteur en mode continu est généralement considérée plus efficace, mais présente certains défis dont la préservation des conditions aseptiques qui rendent plus ardue son application à échelle industrielle.
Le milieu de culture utilisé doit être adapté au microorganisme cultivé afin d’offrir un rendement optimal. Puisque plusieurs microorganismes probiotiques sont des bactéries lactiques, il est commun d’utiliser divers sous-produits de la production laitière tels que le lactosérum comme base du milieu de culture ou comme supplément30. En effet, ces sous-produits sont généralement une source économique de nutriments qui demeurent adaptés au microorganisme cultivé.
Une caractéristique de la production de microorganismes probiotiques vis-à-vis d’autres procédés biotechnologiques est que le produit d’intérêt est le microorganisme lui-même, et non un composé produit par le microorganisme qui aurait ainsi besoin d’être récupéré. Conséquemment, les paramètres de fermentation sont ajustés pour produire la plus grande quantité possible de microorganismes dans un état favorable à leur utilisation ultérieure. La fermentation de microorganismes anaérobies comme B. longum doit notamment être effectuée en absence d’oxygène, ce qui peut être accompli par la purge du réacteur avec de l’azote stérile.
Suite à la fermentation, les microorganismes sont concentrés, ce qui peut être effectué par le biais d’une centrifugation ou d’une filtration. Dans le cas d’une centrifugation, la suspension cellulaire est chargée dans une chambre rotative. La séparation solide-liquide est dirigée par la différence de densité entre les phases et l’accélération centrifuge. Cette
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opération unitaire peut s’effectuer en mode semi-continu, où la centrifugeuse est continuellement chargée jusqu’à ce que l’accumulation de solides atteigne la capacité de la centrifugeuse et que celle-ci soit arrêtée pour être déchargée, ou en mode discontinu, où la centrifugeuse est entièrement chargée, effectue son cycle de rotation et est arrêtée pour être déchargée. Pour sa part, la filtration peut s’effectuer sous forme de filtration frontale, où la suspension s’écoule perpendiculairement vers le filtre et où les cellules s’accumulent progressivement sur le filtre, ou de filtration tangentielle, où l’écoulement se produit en parallèle au filtre. La filtration tangentielle a l’intérêt de limiter la formation d’un gâteau à la surface du filtre, ce qui permet son opération pour une plus longue durée avant de nécessiter la récupération des solides. Cependant, la filtration frontale permet typiquement d’atteindre une concentration en solides plus élevée. Le choix de l’opération unitaire idéale est donc notamment guidé par les spécifications des opérations subséquentes.
Afin de préserver le substrat concentré, ce dernier peut être séché, ce qui peut être accompli par plusieurs opérations unitaires, dont l’atomisation et la lyophilisation31–33. En préparation à cette étape de séchage, les microorganismes sont combinés à une solution protectrice, visant à assurer leur survie durant le séchage ainsi que leur stabilité34. L’atomisation consiste en le passage de la suspension à travers une buse, générant une dispersion de fines gouttelettes. Cette dispersion génère une grande interface par laquelle le transfert de masse de l’eau des gouttelettes vers la phase gazeuse peut s’effectuer efficacement et rapidement, ce qui est nécessaire pour évider une trop forte diminution de la viabilité des microorganismes. Pour sa part, la lyophilisation nécessite la congélation de la suspension microbienne. Celle-ci est ensuite exposée à une faible pression afin de favoriser la sublimation de l’eau. La lyophilisation est une opération relativement lente en raison des faibles températures employées, ce qui réduit le taux de transfert de masse qui peut être obtenu. Cependant, ces faibles températures favorisent généralement la survie des microorganismes.
Suite au séchage, la poudre obtenue doit être transformée sous sa forme posologique. Ce processus peut notamment impliquer l’ajustement de la taille de particules (réduction par comminution ou augmentation par granulation) ainsi qu’un mélange avec divers composés assurant la viabilité et la stabilité des microorganismes. La réduction de taille de particules peut s’effectuer par un moulin à marteaux, où la poudre est chargée sur un tamis et est fractionnée par de multiples marteaux rotatifs. L’augmentation de taille de particules peut
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être effectuée par granulation humide, où les particules sont combinées entre elles ou avec un excipient par le biais d’un agent liant. Le mélange de poudre obtenu peut alors être comprimé à l’aide d’une presse ou encapsulé avant d’être emballé, distribué et vendu.
Stabilité des probiotiques
Généralités sur la stabilité des produits pharmaceutiques
Une entreprise effectuant la production et la vente de microorganismes probiotiques est responsable de s’assurer que son produit contienne suffisamment de microorganismes viables jusqu’à sa date d’expiration. Pour ce faire, le producteur a recours à une étude de stabilité, dont les modalités sont établies par les requis du Conseil international d’harmonisation des exigences techniques pour l’enregistrement des médicaments à usage humain (abrégé ICH, de l’anglais International Council for Harmonisation), qui sont applicables pour plusieurs organismes réglementaires dont Santé Canada. Plus spécifiquement, la stabilité de nouveaux produits mis sur le marché doit être déterminée selon les lignes directrices Q1A(R2)35. Bien que certain de leurs éléments puissent être pertinents, les lignes directrices Q5C sur la stabilité des produits biotechnologiques et biologiques ne s’applique pas aux probiotiques, mais est plutôt restreinte aux protéines présentant un niveau suffisant de caractérisation36.
Ainsi, afin de prouver que la stabilité de son produit est suffisante, un producteur doit fabriquer un minimum de 3 lots qui doivent être stockés dans des conditions de température et d’humidité contrôlées, et ce dans le contenant qui sera utilisé lors de la vente. Ces conditions de température et d’humidité sont dictées par les propriétés climatiques de la région de distribution du produit, ce qui correspond typiquement à 25 °C et 60% d’humidité relative. L’ensemble de la durée de vie du produit doit être couverte par l’étude, quoiqu’il est possible de procéder à l’enregistrement du produit après 12 mois de données pour les conditions de stabilité à long terme et de compléter l’étude durant et après l’enregistrement. Durant l’étude de stabilité, les caractéristiques du produit doivent être minimalement testées aux 3 mois pour la première année, aux 6 mois pour la deuxième et annuellement pour les années subséquentes. Dans le cas des probiotiques, la caractéristique principale à tester est le nombre de microorganismes viables dans une unité du produit, mais d’autres propriétés peuvent être également testées telles que la stérilité (c’est-à-dire l’absence d’autres microorganismes), l’intégrité physique de l’unité ou sa couleur.
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Comme plusieurs autres microorganismes, en phase de déclin, le nombre de bactéries décline selon une dynamique de premier ordre, ce qui peut être représenté par une diminution linéaire de la concentration en fonction du temps sur un graphe semi-log3738.
Facteurs ayant une influence sur la stabilité des probiotiques
Plusieurs facteurs peuvent avoir une influence majeure sur le profil de stabilité affiché par un microorganisme probiotique comme B. longum. Ainsi, les conditions de température et d’humidité dans lesquelles le produit est stocké ont un effet important sur la stabilité, où une température et un taux d’humidité faibles favorisent la préservation de la viabilité31
. D’autre part, la présence d’oxygène dans l’atmosphère a un effet déstabilisateur sur B. longum31,39. De plus, ces facteurs présentent une interaction avec l’emballage utilisé, en particulier selon sa perméabilité à l’humidité et la présence de dessicant39.
La formulation du mélange contenant les microorganismes est également d’intérêt. En effet, l’optimisation du milieu est une méthode communément utilisée pour favoriser la préservation de la viabilité39–45. En général, la présence de saccharides et de protéines a souvent un effet stabilisateur sur la viabilité des cellules, quoique leur effet exact dépende de la souche utilisée. En fait, différentes souches ont généralement une stabilité différente, et ce même lorsque les autres conditions sont maintenues constantes32,46–48. L’explication généralement avancée pour expliquer l’effet stabilisateur des saccharides et des protéines est celle du remplacement de l’eau (water replacement). Selon cette hypothèse, les groupes alcool des agents stabilisants servent de substitut à l’eau et évitent ainsi que les groupements hydrophiles des macromolécules cellulaires interagissent indûment, ce qui permet leur préservation49.
Les conditions de fermentation utilisées pour la production d’un microorganisme ont également été reliées à sa stabilité. Par exemple, Lactobacillus rhamnosus E800 a montré une meilleure stabilité après avoir été cultivé à un pH de 5,8 plutôt que 5,050. Dans le cas de Bifidobacterium animalis, le temps de fermentation et la neutralisation du pH avant lyophilisation n’ont toutefois pas pu être reliés à un changement de stabilité43. L’application d’un stress (thermique ou osmotique) durant la culture de Lactobacillus rhamnosus a pu augmenter sa stabilité, ce qui est attribué à son adaptation au stress subi par le biais de protéines telles que GroEL et DnaK51. Toutefois, l’application d’un choc thermique à Lactococcus lactis a mené à une réduction de sa stabilité52, ce qui est donc une indication que l’effet de ce type de traitement n’est pas universel.
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Enfin, l’opération de séchage utilisée a une influence sur la préservation de la viabilité des probiotiques produits. Tel que mentionné précédemment, le milieu dans lequel la biomasse est séchée et préservée a une grande importance et présente une interaction avec la méthode de séchage employée53. Les propriétés générales (temps de latence après remise en croissance, hydrophobicité, induction de la production d’interleukines-10 et interleukines-12, etc.) des microorganismes séchés sont d’ailleurs considérablement affectées selon que les probiotiques soient séchés à l’air, par atomisation ou par lyophilisation54.
Revue de méthodes d’analyse potentielles
Pour évaluer si un lot de probiotiques est conforme aux attentes et déterminer s’il peut vraisemblablement maintenir un nombre de cellules viables durant l’ensemble de sa durée de vie, une méthode est requise pour capter les déviations qui peuvent survenir dans le procédé. En effet, tel que détaillé précédemment, il est requis d’établir le profil de stabilité normal pour un nouveau médicament et de démontrer que celui-ci est suffisant. Or, cette démonstration peut être effectuée avec seulement 3 lots, ce qui implique que certaines déviations de procédé peuvent ne pas être prises en compte durant cette procédure, et ce malgré la bonne volonté du producteur.
L’un des indicateurs de déviations dans le procédé qui peut être employé est l’état physiologique des microorganismes, c’est-à-dire la présence de dommages plus ou moins sévères à diverses parties de la cellule55. Par exemple, la lyophilisation de microorganismes peut blesser une partie des cellules, ce qui est notamment mesurable par cytométrie de flux56 (la méthode est expliquée plus en détail plus loin dans la section). Ainsi, l’utilisation d’une méthode révélant l’état physiologique des cellules apparaît prometteur pour générer des données pouvant être subséquemment corrélées à une altération de la stabilité de B. longum. Les méthodes potentielles considérées ont été divisées en deux grandes catégories, soient les méthodes ayant recours à la croissance bactérienne et celles n’y ayant pas recours.
Méthodes nécessitant la croissance
Description de la croissance bactérienne sur milieu solide
D’un point de vue macroscopique, la croissance de bactéries sur un milieu solide (typiquement une matrice d’agar dans un contexte de laboratoire) conduit à la formation
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de colonies, qui consistent en fait en l’ensemble des cellules issues de la division initiale d’une cellule ou d’un groupe de cellules. Ces colonies présentent une grande variété de phénotypes quant à leur taille, leur forme, leur texture et leur couleur9.
En considérant un inoculum composé d’une bactérie placée à la surface d’un milieu solide, la première phase de croissance est une phase de latence. Durant cette étape, la bactérie s’adapte à son nouveau milieu de culture, synthétisant au passage les enzymes qui lui serviront éventuellement à consommer les substrats disponibles. La phase de latence permet aussi à la bactérie d’effectuer la réparation de constituants cellulaires qui ont pu être endommagés au préalable (matériel génétique, membrane, paroi, enzymes et protéines diverses)57. Cette période est également utilisée pour l’accumulation de composés essentiels à la croissance tels que des métaux lourds servant de cofacteurs pour certaines enzymes58.
La bactérie peut alors entrer en période de croissance exponentielle. En effet, chaque bactérie viable se divise en 2 bactéries, ce qui conduit au doublement de la population de façon régulière. Les bactéries issues de la division s’accumulent progressivement dans un même endroit, débutant la formation d’une colonie.
La phase subséquente de croissance consiste en une période où le diamètre de la colonie augmente de façon constante59. Contrairement à la phase précédente, seule une fraction des cellules de la colonie parvient à se reproduire de façon significative. L’explication classique pour ce phénomène est qu’en milieu solide, la diffusion des nutriments est plus limitée et il n’y a pas de mouvement de convection pour distribuer ceux-ci, ce qui conduit à un épuisement local rapide des nutriments qui se situent directement autour et en dessous de l’origine de la colonie60,61. En plus de l’épuisement des nutriments, la croissance des bactéries entraine la production de déchets métaboliques dont des acides organiques. Ces acides s’accumulent et consomment le tampon présent dans le milieu jusqu’à épuisement, ce qui conduit à une diminution du pH et à une inhibition de la croissance62,63. Dans le cas des bactéries aérobies, l’accès à l’oxygène peut également devenir progressivement limité64. Considérant ces phénomènes, la croissance exponentielle d’une colonie dans cette phase est limitée à un anneau situé en périphérie de la colonie65. Éventuellement, les facteurs limitant la croissance de toutes les cellules finit par ralentir la croissance de la colonie entière, dont le taux de croissance diminue progressivement jusqu’à atteindre une croissance nulle. De légères irrégularités dans la distribution spatiale
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des nutriments peuvent conduire à la croissance inégale de différentes sections de la colonie, qui peut alors former des villosités et donc développer une forme plus complexe65. Description de la croissance bactérienne en milieu liquide
Par contraste avec la croissance sur milieu solide, la croissance de microorganismes en milieu liquide est traditionnellement divisée en 4 étapes66. Ainsi, une première phase de latence est rencontrée, suivie d’une phase de croissance exponentielle qui se prolonge jusqu’à ce que la déplétion des nutriments et l’accumulation de déchets métaboliques ne ralentissent la croissance. La culture entre alors en phase stationnaire, où le nombre de microorganismes viables stagne et ces derniers tentent de s’adapter à leur milieu changeant. Enfin, la culture entre en phase de mortalité, où le nombre de microorganismes viables diminue jusqu’à éventuellement atteindre zéro si l’incubation se prolonge. La différence de comportement entre la culture en milieu liquide et en milieu solide est principalement causée par la capacité des cellules à se répartir dans le milieu liquide plutôt que de s’encombrer mutuellement en milieu solide.
Facteurs ayant une influence sur la croissance bactérienne
La façon dont croît un microorganisme dépend de plusieurs facteurs. Pour les besoins du présent projet, ces derniers peuvent être regroupés en 3 catégories principales :
Facteurs intrinsèques à la souche Facteurs environnementaux État du microorganisme
Les facteurs intrinsèques à la souche incluent l’ensemble des particularités génétiques et physiologiques du microorganisme en question. Ainsi, certaines bactéries possèdent une vitesse maximale de croissance plus rapide que d’autres. Cette variabilité est due à plusieurs facteurs, incluant les codons utilisés dans le génome de la bactérie67. Le Tableau 3 liste quelques microorganismes (dont B. longum) ainsi que leur temps de doublement.
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Tableau 3: Temps de doublement de divers microorganismes (le temps rapporté est le plus court mentionné dans la référence associée)
Microorganisme Temps de doublement
(minutes) Temps de doublement (heure et minutes) Bifidobacterium longum (Bb-2) 20368 3h2368 Bifidobacterium longum (Bb-3) 18168 3h0168 Mycobacterium tuberculosis 100269 16h4269 Escherichia coli 2170 0h2170 Klebsiella aerogenes 4371 0h4371 Streptococcus faecalis 3572 0h3572
Parmi les facteurs intrinsèques à la souche, on peut souligner les besoins nutritionnels du microorganisme, qui sont ultimement le reflet des enzymes que possède celui-ci et donc de son génotype.
Les facteurs environnementaux regroupent les conditions dans lesquelles le microorganisme doit croître et subsister. Par exemple, les composés présents dans le milieu de croissance (incluant les sous-produits métaboliques et métaboliques secondaires qui peuvent être toxiques ou agir en promoteurs de la croissance), la température, le pH, la luminosité et concentration en gaz, tel que l’oxygène, sont tous des facteurs qui peuvent avoir une influence dramatique sur la façon et la vitesse à laquelle les cellules se divisent73–77. B. longum, par exemple, croît mieux en absence d’oxygène et en absence de lumière75.
Enfin, l’état dans lequel se retrouve un microorganisme au moment de débuter sa croissance dépend de l’historique de l’inoculum et des traitements qu’il a subis. Ainsi, un microorganisme ayant été endommagé, provenant d’une phase de croissance différente ou ayant crû dans des conditions initiales différentes des conditions actuelles va généralement avoir un temps de latence plus long78. En outre, le séchage peut avoir un impact majeur sur le temps de latence d’un microorganisme, ce qui est particulièrement d’intérêt pour le projet considérant que le matériel étudié a été lyophilisé78. Suite à la phase de latence, la vitesse de croissance maximale est en théorie la même tant que le génotype et les conditions environnementales sont identiques79. Cependant, en pratique, le taux de croissance montre une certaine hétérogénéité en raison de la variation du
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niveau d’expression des gènes et de mutations aléatoires, et ce même si les autres facteurs sont maintenus constants80.
Figure 3: Schéma représentant les facteurs ayant une influence sur la croissance de microorganismes
Tel que schématisé sur la Figure 3, seul l’état du microorganisme est directement d’intérêt dans l’optique de prédire la stabilité d’un lot de probiotiques à partir de données sur la croissance. En effet, les facteurs intrinsèques sont constants d’un lot à l’autre, puisque la souche demeure la même. De plus, les facteurs environnementaux sont par définition externes au microorganisme et leur effet peut être contrôlé en les maintenant constants. Ainsi, l’observation de la croissance sous conditions particulières peut donc refléter l’état du microorganisme.
Analyse d’images de colonies formées sur milieu solide
Tel que souligné dans la section précédente, la façon dont se forment les colonies d’un inoculum bactérien sur gélose dépend de l’interaction de plusieurs facteurs. L’analyse de ce phénomène a donc été utilisée par plusieurs chercheurs afin d’extraire de l’information sur des échantillons bactériens. Cette analyse a principalement été effectuée par le biais de l’analyse d’images de colonies, généralement à l’aide d’outils informatiques, mais également par mesures manuelles
Ainsi, Guillier et al. 2006 ont comparé la croissance d’inocula de Listeria monocytogenes conditionnés sous différents stress79. Dans la série d’expériences rapportées, la taille des colonies individuelles a été compilée au fil du temps, permettant de comparer leur évolution.
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Ainsi, il a été observé que l’inoculum contrôle, constitué de cellules en phase exponentielles, avait une distribution de temps de latence différente de l’inoculum ayant subi les stress séquentiels suivants :
1. 360 ppm de chlore à 25 °C pendant 2 minutes 2. pH de 4,6 à 25 °C pendant 24 h
3. 250 g/L de NaCl dans un bouillon TSB (tryptic soy broth) à pH 4,6 et 15 °C pendant 1 h
4. 25 g/L de NaCl dans un bouillon TSB à pH 4,6 et 15 °C pendant 71 h
En effet, l’application de ce stress a conduit à des temps de latence plus longs et ayant un écart-type plus important. Ces travaux sont une indication qu’un changement dans l’état physiologique des cellules peut être détecté par l’effet de ce changement sur la formation des colonies.
D’autre part, Dykes 1999 montre l’effet d’un stress thermique appliqué à L. monocytogenes sur la distribution de taille des colonies après croissance81. Ainsi, les échantillons ayant subi un stress thermique (suspension dans une saline TSB à 56 °C pendant 20 minutes) ont produit des colonies dont la distribution était asymétrique. En effet, la taille des colonies était biaisée vers des tailles inférieures, mais contrainte par le fait que la taille ne peut être négative. Les travaux rapportés par Dykes montrent également une corrélation négative (r²=0,90) entre la taille moyenne des colonies et la proportion de cellules blessées. Cette dernière variable était définie dans ce contexte comme étant la proportion de colonies d’un échantillon qui ne croissent pas sur plaques de TSA (tryptic soy agar) incluant 4% de NaCl, mais qui peuvent croître sur des plaques de TSA sans l’addition de NaCl.
Ces deux cas montrent des applications de l’analyse d’images de colonies qui sont plus directement dirigées vers la détection de blessures cellulaires. D’autres applications intéressantes ont cependant été rapportées pour des objectifs tangentiels. En outre, Sousa et al. 2013 montrent comment effectuer la discrimination de 18 morphotypes de Pseudomonas aeruginosa. La classification a été réalisée en se basant sur la forme, contour, texture, taille et couleur des colonies. Cependant, l’extraction des caractéristiques des images était exécutée par un être humain et non par des outils informatiques. Malgré tout, les travaux rapportés montrent comment une même espèce de microorganismes peut varier et que cette variation peut notamment être détectée visuellement.
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D’autre part, certains colorants de type azo peuvent être dégradés par les bactéries anaérobies (dont les bifidobactéries)82,83. Il serait donc envisageable de les ajouter à la composition de géloses en tant que discriminant au niveau de l’activité enzymatique, de façon analogue à la mesure des zones de lyse autour de colonies pour estimer leur activité amylolytique84. L’utilisation de ces colorants demanderait néanmoins de s’assurer qu’elles n’inhibent pas significativement la croissance de B. longum et sa récupération à partir de son état lyophilisé initial.
Méthodes basées sur la culture en milieu liquide
De façon similaire aux méthodes basées sur la culture en milieu solide, la croissance en milieu liquide dépend de l’état dans lequel se trouve le microorganisme. Ainsi, des blessures causées par chauffage, congélation, séchage, radiation-gamma ou changements osmotiques brusques conduisent à une augmentation du temps de latence57,85–87. Ce temps de latence, de même que la courbe de croissance en général, peut être établi en prélevant un échantillon du milieu de culture à des intervalles définis. La concentration en bactéries viables peut alors être déterminée par la mesure de la densité optique88 ou par des comptes cellulaires par croissance de l’échantillon sur une gélose suivi du décompte des colonies formées. L’échantillonnage de cultures de bactéries anaérobies sans causer d’inhibition due à l’oxygène peut être effectué, mais demande un montage expérimental adapté89–91. Ainsi, la mesure du temps de latence pourrait être utilisée pour déterminer l’état d’un échantillon cellulaire et donc le rattacher à une prédiction de stabilité.
Méthodes ne nécessitant pas la croissance
Bien que l’observation de la croissance permette d’extraire de l’information sur un échantillon bactérien, plusieurs techniques n’ayant pas recours à la croissance ont également été appliquées pour ce même objectif.
Dosage d’ATP
L’ATP (adénosine tri-phosphate) est un composé crucial dans le fonctionnement des cellules. En effet, l’énergie des liens entre les atomes de phosphate est impliquée dans un grand nombre de voies métaboliques92. De ce fait, le dosage de l’ATP contenu dans un échantillon bactérien permet d’évaluer son niveau d’énergie, qui est notamment affecté par son historique.
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Par exemple, des variations brusques dans le pH du milieu dans lequel se situe une cellule ont un impact sur le contenu en ATP de celle-ci93. D’autre part, la culture d’un microorganisme dans un milieu oxydatif tend à diminuer le contenu en ATP des cellules, ce qui est du moins le cas de Lactococcus lactis94.
Un grand nombre de méthodes sont disponibles pour faire le dosage d’ATP, dont la bioluminescence, la chromatographie, la fluorescence et l’utilisation de senseurs95. La plupart des méthodes disponibles permettent d’évaluer la concentration en ATP totale d’un échantillon de cellules, mais pas la concentration intracellulaire individuelle.
Cytométrie de flux
La cytométrie de flux est une méthode rendant possible l’analyse individuelle d’un grand nombre de cellules en un laps de temps relativement court96. Pour ce faire, un échantillon initial est mis en contact avec un ou plusieurs fluorochromes. Le mode d’action de ces derniers varie considérablement selon leur nature, mais ils permettent effectivement de ségréguer une population cellulaire en sous-populations basées sur leur niveau de fluorescence. Durant l’analyse, les cellules sont soumises à un vortex et sont ensuite illuminées par un laser. La lumière résultante est alors décomposée en plusieurs canaux par des miroirs dichroïques. L’intensité lumineuse produite dans chaque canal par chaque événement (cellule, débris, etc.) fournit ainsi beaucoup d’information sur la nature intime de l’élément analysé, notamment selon la présence ou l’absence d’un fluorochrome97. Hammes et al. 2011 montrent un tour d’horizon des cibles cellulaires qui sont typiquement visées pour évaluer la viabilité des bactéries98. Ainsi, la présence d’acides nucléiques est une condition de base qui est remplie par un microorganisme viable. L’ADN (acide désoxyribonucléique) et l’ARN (acide ribonucléique) sont révélés par des composés tels que le SYTO® 9 et le SYBR Green. Ce type de sonde est généralement utilisé pour révéler la présence de microorganismes potentiellement viables et les distinguer de débris non-biologiques. Pour cette raison, il est fréquemment combiné à d’autres sondes.
L’intégrité des membranes cellulaires est généralement testée à l’aide de sondes (iodure de propidium, etc.) visant un élément à l’intérieur de la cellule, mais qui n’est pas en mesure de traverser une membrane cellulaire en bon état. De façon similaire à l’intégrité membranaire, la présence d’une différence de potentiel entre l’intérieur et l’extérieur de la cellule est indicateur de viabilité. En effet, une bactérie doit dépenser de l’énergie afin de maintenir son cytoplasme chargé négativement. De ce fait, la présence d’un fluorochrome
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anionique ou l’absence d’un fluorochrome cationique révèle typiquement que la polarisation de la membrane est déficiente.
D’autre part, l’activité des pompes à efflux, dont le rôle est de transporter certaines molécules à travers la membrane, est également un indicateur de viabilité. Ainsi, une cellule blessée permettra l’accumulation de fluorochromes tels que le bromure d’éthidium. Pour sa part, la respiration cellulaire peut être évaluée à l’aide de composés comme les sels de tetrazolium. Ces derniers font office d’accepteurs d’électrons et sont donc réduits lorsque s’effectue la respiration cellulaire.
Enfin, l’activité enzymatique peut également fournir de l’information sur le degré de viabilité des cellules, en particulier pour les enzymes reliées aux mécanismes de base de maintien de la cellule. En pratique, plusieurs enzymes peuvent être visées par cette étape. Ainsi, l’activité des estérases est généralement attendue dans toutes les cellules et est souvent détectée par la fluoresceine diacétate (ou dérivés), alors qu’il est également possible de suivre l’activité d’enzymes plus spécifiques. Par exemple, dans le cas de B. longum, l’activité enzymatique de la F6PPK pourrait être un choix intéressant dans certains contextes vu sa spécificité aux bifidobactéries12,99.
Les travaux de Berney et al. permettent d’interpréter ces différents paramètres dans l’optique où l’on souhaite évaluer la viabilité d’un échantillon bactérien de façon globale100. En effet, les essais réalisés montrent comment la viabilité d’E. coli diminue lorsqu’un échantillon est exposé à de la radiation ultraviolette. En particulier, il est possible de voir l’ordre dans lequel plusieurs marqueurs notamment mesurés par cytométrie montrent une décroissance, mettant en lumière la séquence de mortalité d’une cellule. L’ordre dans lequel ces fonctions flanchent est illustré dans la Figure 4.
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Figure 4: Séquence de mortalité d’E. coli exposée à des rayonnements UV, basé sur les résultats de Berney et al. 2006
En se basant sur ces résultats, la mesure parallèle du transport actif, du potentiel membranaire et de l’intégrité membranaire permettrait de situer une cellule dans cette séquence et ainsi d’obtenir une évaluation de la viabilité de la cellule en question avec un bon niveau de spécificité. Des travaux analogues utilisant une combinaison de sondes ont notamment été effectués pour caractériser les blessures infligées à Bifidobacterium lactis et Bifidobacterium adolescentis par des sels biliaires101. Les dommages causés par la congélation et le stockage suite à la congélation ont également pu être quantifiés par cette méthode, montrant ainsi que diverses souches de Lactobacillus delbrueckii réagissaient différemment à ces stress47. D’autre part, une combinaison d’iodure de propidium, de bromure d’éthidium et de bis-oxonol a pu être utilisée pour subdiviser Salmonella typhimurium en groupes en fonction de la viabilité de chaque bactérie102. Il a subséquemment été montré que ces groupes avaient une capacité différente à croître sur milieu solide.
Observation de cellules par microscopie
L’observation de cellules par microscopie à fluorescence permet d’accomplir approximativement la même fonction que la cytométrie de flux. En effet, les mêmes sondes peuvent être employées dans les deux cas103 et vont permettre d’identifier la présence ou l’absence d’une propriété dans chaque cellule. Cette méthode a par exemple été utilisée pour déterminer la viabilité de Lactobacillus rhamnosus et Bifidobacterium animalis sous forme lyophilisée à l’aide de SYTO® 9, iodure de propidium et DiBAC4104. La
Cellules viables
Cellules non-viables
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microscopie à fluorescence a également permis de caractériser les dommages infligés par divers conditionnements (chauffage, congélation, acidification ou exposition à des sels biliaires) par le biais des sondes cF (carboxyfluorescéine) et iodure de propidium105.
De plus, l’observation par microscope permet de caractériser la morphologie des cellules et fournir de l’information sur la disposition spatiale des bactéries et de leur contenu. L’une des limitations, cependant, est le nombre plus faibles de cellules qui peuvent être pratiquement analysées comparativement à ce que peut accomplir la cytométrie de flux. La microscopie confocale consiste en bref en une technique de microscopie où seul un point précis d’un échantillon est imagé à la fois. Cette approche permet de balayer successivement plusieurs points de l’échantillon et d’ainsi reconstituer ce dernier en trois dimensions. Cette méthode a été utilisée pour évaluer la viabilité de Lactobacillus acidophilus microencapsulé à l’aide de SYTO® 9 et d’iodure de propidium, et ce en trois dimensions106. Une approche similaire a aussi été rapportée pour Lactobacillus paracasei et deux souches de Bifidobacterium sous forme atomisée107.
La microscopie peut aussi être combinée à l’hybridation in situ en fluorescence (appelée FISH, de l’anglais Fluorescence In Situ Hybridization). Dans cette méthode, une sonde fluorescente est conçue pour se lier spécifiquement à des acides nucléiques (ADN, ARN) ou à des protéines108. Cette méthode pourrait être principalement d’intérêt si la présence ou l’absence d’une organelle spécifique pouvait être rattachée à une stabilité altérée. L’utilisation de FISH serait également appropriée dans le cas où deux microorganismes probiotiques seraient utilisés dans un même produit. La technique permettrait ainsi de les discriminer avant de poursuivre l’analyse, ce qui serait utile puisque différents microorganismes ont des profils de stabilité différents109. Cette méthode a d’ailleurs été utilisée pour identifier des souches de bifidobactéries présentes dans les excréments de sujets humains110 et les distinguer des multiples autres microorganismes présents.
Calorimétrie
La calorimétrie différentielle à balayage est une technique analytique permettant de déterminer l’énergie qui est requise lors de diverses transitions d’un matériau. Lorsque des cellules sont analysées par cette méthode, plusieurs pics de transition peuvent être reliés à la dénaturation de composés cellulaires111. Cette particularité a été utilisée pour établir un lien entre le thermogramme de E. coli ainsi que Lactobacillus plantarum et leur viabilité attendue, lorsque des traitements thermiques d’intensité variable sont appliqués à
