Université de Liège
Centre d’Ingénierie des Protéines
Recherche de nouveaux métabolites secondaires
chez les Streptomyces
La Condromycine:
Histoire d’un antibiotique mort-né …
Introduction
Streptomycètes
Introduction
Streptomycètes
Introduction
Streptomycètes
Séquençage des génomes de S. coelicolor et S. avermitilis révèlent la présence de nombreux clusters « cryptiques ».
Les bactéries pathogènes multirésistantes aux antibiotiques posent un grave problème médical. recherche de nouvelles molécules.
Le groupe Strepto a décidé de rejoindre l’ensemble du CIP dans cette cette aventure.
Quels sont les signaux environnementaux perçus déclenchant le passage du métabolisme primaire au métabolisme secondaire ?
Criblage de la collection de Streptomyces du CIP pour la recherche de nouveaux antibiotiques
Souche S. sp. G2
Streptomyces sp G2 produit un métabolite secondaire inhibant la croissance de bactéries Gram-positives (MRSA).
Il existe trois antibiotiques naturels caractérisés contenant un atome de bore
* Le tartrolon:
- Produit par Sorangium cellulosum - Mw = 888 Da
* L’aplasmomycine:
- Produite par Streptomyces griseus - Mw = 799 Da
* La boromycine:
- Produite par Streptomyces antibioticus - Mw = 866 Da
Objectifs du doctorat
• Caractérisation génétique, biochimique et morphologique de la
souche G2.
• Détermination des propriétés physico-chimiques de l’antibiotique.
• Optimisation de la production de l’antibiotique dans le but de la
détermination de sa structure tridimensionnelle par RMN (en
collaboration avec le Professeur Luxen, ULg).
• Recherche de la cible de l’antibiotique.
• Identification des gènes responsables de la biosynthèse de la
condromycine (clonage et séquençage du cluster de gènes).
Résultats
• 1) Génotypage de Streptomyces sp G2 en amplifiant, clonant et séquencant le gène codant pour les RNA 16S et les Internally transcribed spacers (ITS).
Mise au point des conditions optimales de croissance de S. sp. G2 et
de production de condromycine en milieu liquide.
16 h 22 h 40 h 46 h 112 h TSB + glycérol 1% MM + glycérol 1% MM + glucose 1% MM + chitine 1% MM + mannitol 1% MM + GlcNAc 1% TSB + glycérol 1% + chitine 0,5%
MM + glycérol 1%
MM + chitine 1% R2YE
MM + MM + mannitol 1%
Mise au point des conditions optimales de croissance de S. sp. G2 et de
production de condromycine sur milieu gélosé.
Mise au point d’un protocole de production et de
purification de condromycine.
La souche S. sp. G2 ne produit plus l’antibiotique en milieu liquide.
Mutagenèse chimique au NTG
Screening des colonies après incubation des spores avec du
NTG et caractérisation des mutants potentiels
• 15 mutants potentiellement surproducteurs • 21 mutants potentiellement non producteurs
• 3 mutants présentant un phénotype fortement altéré
Non producteur S. sp. G2 Surproducteur Mutant brun
9 mutants surproducteurs confirmés
4 cultures de 250 ml en TSB + glycérol 1% + chitine 1%
Purification:
- Extraction liquide-liquide
- Purification trois pics sur colonne semipréparative.
35 mg pics A, B et C
Activité biologique
Enterococcus
Propriétés physico-chimiques
• Spectres UV:
• Stabilité thermique et résistance aux protéases. • Spectre de masse. co ntr o l 90°C 1h30 tr ait e men t Pronase 4 μg/mL 24 h 37°C 5795,6 597,4 1267,9 1282,1
Production et purification de la condromycine sur milieu
gélosé
.
100 boîtes de milieu R2YE (2,5 litres) spores du mutant
surproducteur SPXII.
Condromycine extraite du milieu gélosé en présence d’acétate
d’éthyle.
Purification par HPLC (colonne C18) et séparation des trois pics.
150 mg
… Et c’est l’embardée …
• Pic A: 1254,7 Actinomycin D : 1255,4 • Pic B: 1268,8 Actinomycin C2 : 1269,4 • Pic C: 1282,8 Actinomycin C3 : 1283,5 Condromycine = Actinomycine? - Masses très proches- Spectre d’absorption similaire
- Même activité (actif contre les gram +)
- Même spectre RMN du proton Litt.: Spectre 1H de
actinomycin D spectre 1H obtenu de fraction B (ppm) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0
CONDROMYCINE
Objectifs
• Caractérisation génétique, biochimique et morphologique de la
souche G2.
• Détermination des propriétés physico-chimiques de l’antibiotique.
• Optimisation de la production de l’antibiotique dans le but de la
détermination de sa structure tridimensionnelle par RMN (en
collaboration avec le Professeur Luxen, ULg).
• Recherche de la cible de l’antibiotique.
• Identification des gènes responsables de la biosynthèse de la
condromycine (clonage et séquençage du cluster de gènes).
S. sp. G2 = Sous-espèce de S. griseus
Masse, spectre UV, stabilité thermique, stabilité en fonction du pH, hydrophobicité, …
Se lie à l’ADN empêchant la transcription en ARN hautement toxique.
Recherche de nouveaux métabolites secondaires
1) Criblage de la collection de Streptomycètes du CIP.
Recherche de nouveaux métabolites secondaires
1) Criblage de la collection de Streptomycètes du CIP. 2) Méthodologie « dasR »
Facteur de transcription pléiotropique. - Métabolisme de la GlcNAc.
- Scan du génome de S. coelicolor pour identifier les sites dre (dasR-responsive element).
Recherche de nouveaux métabolites secondaires
2) Méthodologie « dasR »
DNA array BAP29 vs S. coelicolor M145
M145
BAP29
Recherche de nouveaux métabolites secondaires
2) Méthodologie « dasR ».
DNA array BAP29 vs S. coelicolor M145
Recherche de nouveaux métabolites secondaires
2) Méthodologie « dasR »
DNA array BAP29 vs S. coelicolor M145
Recherche de nouveaux métabolites secondaires
2) Méthodologie « dasR »
DNA array BAP29 vs S. coelicolor M145
Gènes SCO6273 à SCO6288 régulés par scbR et scbA en amont desquels on retrouve un site dre.
Recherche de nouveaux métabolites secondaires
2) Méthodologie « dasR »
DNA array BAP29 vs S. coelicolor M145
SCO6280 = KasO SCO6273
Recherche de nouveaux métabolites secondaires
Et en pratique…
1 2 3 41 = M145 MM + mannitol 1% 2 = BAP29 MM + mannitol 1% 3 = M145 MM + GlcNAc 1% 4 = BAP29 MM + GlcNAc 1% M145 ΔdasR MM MM + GlcNAc
Recherche de nouveaux métabolites secondaires
BAP29 MM + GlcNAc 1%
Recherche de nouveaux métabolites secondaires
1 2 3 4 1 = M145 LB + glucose 1% 2 = BAP29 LB + glucose 1% 3 = M145 LB + chitine 1% 4 = BAP29 LB + chitine 1%Recherche de nouveaux métabolites secondaires
Jus de culture BAP29 LB + glucose 1%
Pic 1
Pic 2
Perspectives
Effet de la GlcNAc sur d’autres Streptomycètes.
Streptomyces clavuligerus 1 2 3 4 5 6 1 = MM + mannitol 1% 2 = MM + GlcNAc 1% 3= MM + glucose 1% 4 = MM + glucose 1% + GlcNAc 1% 5 = MM + chitine 1% 6 = MM + chitine 1% + GlcNAc 1%
Perspectives
PCR pour identifier les souches de la collection possédant le gène dasR. Inactivation du gène Réveil de métabolites cryptiques?
Etudier le métabolome des souches de la collection sur différents milieux en présence de différentes sources de carbone et d’azote.
