Pour l’obtention du Grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE POITIERS (Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées)
(Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006)
École Doctorale : Sciences pour l’Environnement Gay Lussac. Secteur de Recherche : Biologie des organismes ; Biotechnologies animales, végétales et microbiennes
Présentée par :
Virginie PORTEMER
************************Impacts de la contrainte hydrique
sur l’architecture du rosier miniature :
étude de gènes impliqués et développement de protocoles
de transformation génétique en vue de leur validation
************************
Directeurs de Thèse :
Rossitza Atanassova
Rémi Lemoine
Soutenue le 17 décembre 2009
devant la Commission d’Examen
JURY
L. Jouanin Directeur de recherche CNRS, Versailles Rapporteur
T. Améglio Directeur de recherche INRA, Clermont-Ferrand Rapporteur
L. Hibrand Saint Oyant Ingénieur de recherche INRA, Angers Examinatrice
J-P. Reynoird Directeur de R&D de Delbard, Malicorne Examinateur
P. Coutos-Thévenot Professeur de l’Université de Poitiers Examinateur
R. Atanassova Professeur de l’Université de Poitiers Examinatrice
R. Lemoine Directeur de recherche CNRS, Poitiers Examinateur
Remerciements
Remerciements
Comme vous me connaissez, je ne vais pas faire de grands discours mais je tiens à remercier toutes les personnes qui m’ont permis de réaliser cette thèse et qui ont compté pour moi.
Je remercie vivement le docteur Philippe Michonneau, gérant de l’entreprise Géniflore, qui m’a permis de réaliser cette thèse dans le cadre d’une Convention Industrielle de Formation par la Recherche en Entreprise (CIFRE).
Mes remerciements les plus chaleureux s’adressent à ma directrice de thèse, le professeur Rossitza Atanassova pour m’avoir guidée dans mes travaux de recherche, conseillée, soutenue et aidée pour la réalisation de cette thèse.
J’adresse aussi mes remerciements au directeur du laboratoire et co-directeur de thèse, le docteur Rémi Lemoine pour m’avoir accueillie et encadrée durant ces trois années de thèse au sein de l’Equipe de Recherche Technologique (ERT), Applications biotechnologiques liées à la culture du rosier et de la FRE 3091 Physiologie moléculaire du transport des sucres chez les végétaux.
Je remercie très vivement Lise Jouanin, Thierry Améglio d’avoir accepté d’être rapporteur pour cette thése. De même, je remercie Laurence Hibrand Saint Oyant et Jean-Paul Reynoird qui ont bien voulu participer à ce jury de thèse et être examinateur.
Je remercie les universités d’Angers et de Lyon et la société Delbard avec lesquels nous avons collaboré sur divers projets notamment concernant la transformation du rosier miniature. Je remercie tout particulièrement Marie-José James pour ces précieux conseils en culture in vitro. J’ajoute à ces remerciements Clémence Henry pour avoir répondu à mes nombreux e-mails concernant la RT-qPCR.
Je remercie Pierre Coutos-Thévenot, membre de L’ERT, pour m’avoir orientée sur le protocole de transformation génétique du rosier et Pierrette Fleurat-Lessart pour ces précieux conseils en microscopie.
Je remercie Majorie, Fabiola et Laetitia pour leur aide qu’elles m’ont apportée pendant l’annuel CDD de l’ERT. Je n’oublie pas tous les stagiaires Nessrine, Adeline, Benjamin, Elsa, Angélique qui se sont succédé sur l’étude du rosier miniature et qui m’ont aidé dans mon travail.
Je remercie également tous les thésards que j’ai côtoyés pendant cette thèse et qui ont amené leur bonne humeur, leur conseil et leur aide. Ceux qui sont déjà docteur, Ludovic (j’espère avoir à mon tour ta
légendaire déduction de docteur), Estelle, Christophe, Amélie et Céline, ou les futurs docteurs (n’est-ce pas Damien dépêche-toi un peu de passer ta thèse, j’aurai aimé te mettre dans l’autre catégorie), Anna, Audrey (j’espère que continuera à m’appeler pour faire marcher la sonnerie d’ABBA), Yves, Dany et, sans oublier un autre spécialiste du rosier, Cyril (pour sa très grande contribution à l’étude de la photosynthèse chez le rosier et surtout pour ses blagues…).
Je tiens aussi à remercier Marie-Thérese Bidoyen qui m’a formée aux techniques du laboratoire pendant les premiers mois de la thèse et qui malheureusement nous a quitté trop vite.
Je tiens également à remercier le personnel technique de l’entreprise Nathalie, Freddy et Arnaud et du laboratoire Benoît (pour les nombreux passages de mes échantillons en HPLC et aussi pour les romans photos avec des dialogues très recherchés et dignes des plus grands auteurs), Florence, Cécile, Jenny et Julien pour leurs aides et leurs conseils. Je remercie aussi Bruno et Jean-Michel (alias le directeur ou le professeur) qui se sont occupés de mes rosiers à la serre.
Je remercie Genevièvre pour les nombreux bons de commandes et Sylvie pour les formalités administratives.
Je remercie également ma collègue de bureau Andrée pour son aide et ses conversations sur la pluie et le beau temps.
Je remercie tous ceux qui ont lu, relu et rerelu ce mémoire de thèse en particulier Rossi, Rémi, Marjorie, Pierre, Andrée, Fabienne et Jérôme.
Je remercie Anne Brunnelière pour les recherches de nombreux articles non disponibles sur Internet. Je tiens aussi à remercier Daniel Guillonet pour les nombreux séquençages effectués pour cette thèse et Sylvie Patrie pour ces conseils en RT-qPCR.
Je remercie tous les autres membres du laboratoire PhyMots qui ont supporté mon caractère (ou comme dirait Julien mon sale caractère) et mes crises « bruyantes » (contre mon ordi entre autres) et qui je suis sûre vont vous manquer (ou peut être pas).
Enfin, je remercie ma famille et Jérôme pour m’avoir aidée et soutenue pendant ces 3 ans (heu ! 2 ans 9 mois et 17 jours).
Abréviations
Abréviations
2,4-D : acide 2,4-dichloro-phénoxyacétique2,4,5-T : acide 2,4,5 trichloro-phenoxyacétique ABA : acide abscissique
ABRE : élément trans-régulateur de réponse à l’ABA ADN : acide désoxyribonucléique
ADNc : ADN complémentaire AIB : acide indole butyrique ARN : acide ribonucléique ARNm : ARN messager ARNr : ARN ribosomique
ANA : acide naphthalène acétique ASR : ABA, stress and ripening induced BAP : 6-benzylaminopurine
BET : bromure d’éthidium BSA : albumine sérique bovine
CaMV : virus de la mosaïque du chou fleur CAV : cellules associées aux vaisseaux CCD : cleavage caroténoïd dioxygenase CDS : séquence codante
Ct : cycle seuil
CTAB : hexadecyltriméthylammonium bromide CTPS : comité technique permanent de la sélection CSD : copper/zinc superoxyde dismutase
DNase : désoxyribonucléase
DREB : dehydration responsive element binding dNTP : désoxynucléotide 5’-triphosphate
EDTA : acide éthylène diamine tétraacétique EST : expressed sequence tag
ERD6 : early responsive to dehydration 6 FAO : formes actives d’oxygène
FeDDHA : ferric éthylènediamine di (2-hydroxyphenyl acetate) FeNaEDTA : acide ferricque sodium éthylènediamine
GA3 : acide gibbérellique
GAPDH : glyceraldehyde 3-phosphate déhydrogénase
HPLC : Chromatographie de haute performance en phase liquide IAA : alcool isoamylique
IAV : invertase acide vacuolaire
IPTG: isopropyl ß-D-thiogalactopyranoside IN : invertase neutre
LEA : late embryogenesis abundant LB : milieu Luria-Bertani
MAX : more axillary growth MCC : mode cultural court MCL : mode cultural long
MFS : major facilitator superfamily MS : milieu Murashige et Skoog
NCBI : national center for biotechnology information NLS : signal de localisation nucléaire
Oligo (dT) : Oligo-désoxythymidine
ori : origine de réplication
PAL : phénylalanine amoniac-lyase PCR : polymerase chain reaction PEG : polyéthylèneglycol
PLB : protocorm-like bodies PLT : transporteur de polyol
PGlcT : transporteur plastidial de glucose PVPP : polyvinylpolypyrrolidone
QTL : quantitative trait loci
qPCR : PCR quantitative en temps réel RT : transcription inverse
SDS : sodium dodécyl sulfate SMC : site multiple de clonage
SMS : signal mobile à longue distance
SOB : Super Optimal Broth, milieu de culture pour transformation des bactéries compétentes
SOC : Super Optimal Broth with Glucose, milieu de culture pour transformation des bactéries compétentes
SSC : tampon citrate de sodium STP : protéine de transport des sucres SUC ou SUT : transporteur de saccharose SuSy : saccharose synthétase
TAE : tampon tris/acétate/EDTA
TAIR : the arabidopsis information ressource
TMT : transporteur de monosaccharide tonoplastique Tris : tris-(hydroxyméthyl) amino méthane
Ti : tumor inducing UTR : région non traduite
Sommaire
Sommaire
Introduction ... 1
Chapitre 1 : Synthèse bibliographique ... 3
I.
Les roses : généralités ... 4
A. Classification botanique du rosier ... 4
B. Histoire et évolution des rosiers ... 5
1. Roses anciennes et premières hybridations ... 5
a. Anciens hybrides européens : les Gallicanae ... 5
b. Rosiers du Bengale ou rosiers de Chine ... 6
c. Rosiers Noisette et rosiers Thé ... 7
d. Rosiers Bourbon, hybrides remontants et hybrides de Thé ... 7
2. Rosiers modernes à grosses fleurs ... 7
3. Roses anglaises ... 8
4. Divers types de rosiers ... 8
C. Importance économique ... 9
D. Connaissances sur le génome du rosier ... 10
II.
Qualité architecturale des rosiers ... 12
A. Qualité esthétique ... 12
B. Influence du mode de culture sur l’architecture du rosier miniature ... 12
1. Le Mode Cultural Long (MCL) ... 12
2. Le Mode Cultural Court (MCC) ... 13
3. Régulation de la croissance en longueur ... 14
4. Régulation des ramifications : le trio auxines, cytokinines et strigolactones... 15
III.
Réponses des plantes face à un stress hydrique ... 16
1. Modifications morphologiques et physiologiques ... 16
2. Ajustement osmotique ... 17
3. Protection des structures cellulaires ... 18
4. Limitation du stress oxydatif ... 18
a. Les superoxydes dismutases... 19
b. Autres enzymes impliquées dans la dégradation des FAO... 20
5. Voies de signalisation impliquées dans la réponse au stress hydrique ... 22
a. Les principaux facteurs de transcription impliquées dans la réponse au stress hydrique .. ... 22
b. Les ASR, autres facteurs de transcription ? ... 22
IV.
Aspects physiologiques et moléculaires du transport de l’eau et des sucres
dans la plante ... 25
A. Mécanismes d’absorption de l’eau ... 25
B. Le transport et le métabolisme des glucides ... 26
1. Chargement et déchargement du phloème ... 27
2. Remobilisation des sucres dans le xylème ... 28
3. Les transporteurs de sucres ... 29
a. Les transporteurs de monosaccharides ... 30
b. Les transporteurs de disaccharides ... 32
4. Dégradation du saccharose ... 33
V.
Mécanismes de la transformation génétique par Agrobacterium
tumefaciens ... 35
A. A. tumefaciens : un mécanisme original... 35
2. Le transfert de gène ... 36
a. VirA et virG, senseurs à deux composantes pour l’induction du système de virulence bactérien ... 36
b. Le transfert de l’ADN-T dans la celulle végétale ... 37
c. Intégration de l’ADN-T dans le génome de la plante hôte ... 37
B. La transformation génétique chez le rosier via l’embryogenèse somatique .... 39
1. L’embryogenèse somatique chez le rosier ... 39
2. La transformation génétique du rosier ... 41
VI.
Objectifs de l’étude ... 42
Chapitre 2 : Matériel et méthodes ... 44
I.
Techniques pour l’étude de la contrainte hydrique ... 45
A. Matériel... 45
1. Matériel végétal : plantes en serre ... 45
2. Souche bactérienne Escherichia coli DH5αααα ... 45
3. Vecteur de clonage bactérien : le plasmide pGEM-T Easy ... 45
B. Méthodes d’expérimentation en serre ... 46
1. Conditions de culture en serre ... 46
2. Déroulement des prélèvements ... 46
C. Méthodes physiologiques pour la détermination de l’état hydrique du rosier 47 1. Le potentiel hydrique ... 47
2. La transpiration journalière ... 48
D. Méthodes de mesures morphologiques, histologiques et biochimiques ... 48
1. Mesures morphologiques ... 48
2. Observations et mesures histologiques ... 48
3. Dosage des sucres par HPLC ... 49
E. Méthodes de clonage de gènes ... 50
1. Recherche de gènes candidats avec a priori ... 50
a. À partir des bases de données d’EST de rosier ... 50
b. À partir d’amorces dégénérées des régions conservées ... 50
2. Extraction d’ADN génomique ... 50
3. Dosage de l’ADN au spectromètre ... 51
4. Définition d’amorces pour l’amplification de séquences... 52
5. Amplification des fragments d’ADN par PCR classique ... 52
6. Visualisation et élution des fragments d’intérêt ... 52
7. Ligature dans le plasmide pGEM-T Easy ... 53
a. Réaction de ligature ... 53
b. Purification du produit de ligature ... 53
8. Transformation de bactéries par électroporation ... 54
9. Extraction d’ADN plasmidique ... 55
10. Vérification de l’intégration de l’insert ... 55
11. Séquençage et analyse des clones ... 56
a. Réaction d’amplification ... 56
b. Purification et concentration des produits d’amplification ... 56
c. Vérification du produit du séquençage ... 56
12. Amplification rapide des extrémités des ADNc (RACE PCR) ... 57
a. Purification des ARN totaux ... 57
b. Extraction des ARNm ... 57
c. Synthèse des ADNc ... 58
d. Ligature des adaptateurs ... 59
e. RACE PCR ... 59
13. Production de sondes spécifiques ... 60
F. Méthodes d’analyse de l’expression des gènes ... 61
Sommaire
2. Traitement à la DNase et purification des ARN totaux ... 62
3. Vérification de l’intégrité des ARN ... 62
4. Analyse de l’expression par macroarrays ... 62
a. Dépôt des sondes d’ADN sur membrane de nylon ... 62
b. Synthèse et marquage radioactif des ADNc ... 63
c. Hybridation des membranes ... 63
d. Normalisation et calcul du niveau d’expression des gènes ... 64
5. Northern blot ... 64
a. Séparation des ARN totaux en conditions dénaturantes ... 64
b. Transfert des ARN totaux sur une membrane de nylon ... 65
c. Préparation des sondes ADN radioactive ... 65
d. Préhybridation et hybridation des membranes ... 66
6. RT-qPCR ... 66
a. Rétro-transcription ... 66
b. PCR quantitative en temps réel (qPCR) ... 67
G. Analyses statististiques ... 70
II.
Techniques de culture in vitro ... 71
A. Matériel... 71
1. Matériel végétal ... 71
2. Souches d’A. tumefaciens ... 71
a. La souche EHA105 ... 71
b. La souche A544 ... 72
B. Méthodes de régénération indirecte ... 72
1. Désinfection des explants et micropropagation ... 72
2. Induction de la calogenèse ... 72
3. Développement de structures embryogènes ... 73
4. Régénération des cals embryogènes et rhizogenèse ... 73
5. Acclimatation des plantes en serre ... 73
C. Méthode pour le développement d’une suspension cellulaire ... 74
D. Méthode de transformation génétique ... 74
1. Préparation de A. tumefaciens ... 74
2. Transformation génétique des cals embryogènes ... 75
a. Préparation et inoculation des cals embryogènes ... 75
b. Sélection et régénération des transformants ... 75
3. Transformation des cellules provenant de la suspension cellulaire... 76
a. Préparation et inoculation de cellules de la suspension cellulaire ... 76
b. Sélection, multiplication et régénération des transformants... 76
4. Test GUS histochimique ... 77
Chapitre 3 : Résultats et discussion ... 78
I.
Caractérisation des effets du stress hydrique chez le rosier miniature .... 79
A. Estimation de la contrainte hydrique subie par les rosiers miniature... 79
1. Variation du potentiel hydrique de base ... 79
2. Variation de la transpiration relative journalière ... 80
3. Relation entre le potentiel de base et la transpiration relative ... 80
4. Aspect des plantes lors de la période de stress hydrique ... 81
5. Discussion ... 81
B. Caractérisation des effets du stress hydrique au niveau morphologique, histologique et physiologique ... 83
1. Effets du stress hydrique sur l’architecture ... 83
2. Effets du stress hydrique sur le complexe conducteur ... 85
3. Effets du stress hydrique sur la composition glucidique ... 86
a. Effets sur la composition et la teneur en sucres solubles dans la sève xylémienne... 86
b. Effets sur la composition glucidique dans les feuilles et les tiges ... 87
a. Superposition des conditions climatiques extérieures aux effets du stress hydrique ... 88
b. Influence du stress hydrique au niveau morphologique, histologique et physiologique .. 88
C. Caractérisation de l’expression des gènes impliqués dans la réponse au stress hydrique ... 92
1. Sélection, définition et clonage de sondes spécifiques de gènes potentiellement impliquées lors d’un stress hydrique ... 92
a. Recherche de séquences dans la base d’EST de rosier ... 92
b. Clonage des sondes spécifiques de nouveaux transporteurs de saccharose en dehors de la base d’EST de rosier ... 93
2. Criblage des gènes candidats ... 95
3. Analyse de l’expression de gènes candidats ... 99
a. Expression des gènes de transporteurs de sucres ... 100
b. Expression des gènes du métabolisme glucidique ... 104
c. Expression du gène de réponse au stress hydrique ... 106
d. Expression des gènes impliqués dans le contrôle hormonal de la ramification ... 108
II.
Développement d’un protocole de transformation génétique du rosier . 111
A. Mise en place de l’embryogenèse somatique sur le rosier miniature... 1121. Induction de la callogenèse ... 112
2. Apparition d’embryons somatiques ... 113
3. Régénération des cals embryogènes non transformés et acclimatation en serre .. 115
4. Aspect des cultures in vitro et essais complémentaires ... 116
a. Observation de changements progressifs des cultures ... 116
b. Observation de bactéries dans les cultures in vitro ... 116
c. Établissement de nouvelles plantules-mères du cv Orange en micropropagation et essais comparatifs ... 117
5. Discussion ... 118
a. Types d’explants ayant régénéré des structures embryogènes ... 118
b. Efficacité de l’embryogenèse somatique ... 118
c. Modification de l’architecture des rosiers via le passage en culture in vitro... 120
d. Impact des contaminations endophytiques ... 120
B. Transformation des cals embryogènes via A. tumefaciens ... 122
1. Résultats ... 122
2. Discussion ... 124
a. Difficulté d’élimination d’A. tumefaciens après la coculture ... 124
b. Différence de l’efficacité de transformation entre la souche EHA105 et la souche A544 .... ... 125
c. Efficacité de la transformation des cals embryogènes avec la souche EHA105 ... 125
d. Sélection sur kanamycine ... 127
C. Transformation des cellules provenant d’une suspension cellulaire ... 128
1. Résultats ... 128
2. Discussion ... 130
a. Succès du développement et de la transformation de la suspension cellulaire ... 130
b. Différences entre les suspensions cellulaires sauvage et transformée ... 131
Conclusion ... 132
Perspectives ... 137
Annexes ... 140
Annexe 1 : Etude complémentaire : Séquençage d’EST ... 141
Matériel et Méthodes ... 142
Résultats ... 143
Sommaire
Alignements des séquences obtenues après amplification avec les amorces
dégénérées ... 144
Amorces utilisées pour la RACE PCR de RhSUC2 et RhSUC6 ... 145
Séquence de la partie 5’ de RhSUC2 obtenue par la RACE PCR ... 146
Séquence de la partie 3’ de RhSUC3 obtenue par la RACE PCR ... 147
Séquences des sondes utilisées pour les macroarrays et le Northern blot ... 149
Amorces utilisées pour la RT-qPCR définies pour cette étude ... 152
Autres amorces utilisées pour la RT-qPCR définies l’INRA Angers-Nantes ... 153
Annexe 3 : Milieux de culture utilisés ... 154
Composition du milieu Murashige et Skoog (MS) ... 154
Composition du milieu d’induction de cals embryogènes avec macroéléments N6 .... ... 155
Sommaire des figures
Synthèse bibliographique
Figure 1 : Caractéristiques générales du genre rosa ... 4
Figure 2 : Généalogie simplifiée des rosiers ... 5
Figure 3 : Différentes architectures de rosiers ... 8
Figure 4 : Culture du rosier miniature en MCL ... 12
Figure 5 : Concentration des nutriments dans la sève xylémienne avec différents modes de culture ... 12
Figure 6 : Culture du rosier miniature en MCC ... 13
Figure 7 : Métabolisme de la principale voie des gibbérellines (GA) et action du paclobutrazole ... 14
Figure 8 : Voie de l’inhibition des ramifications par les strigolactones ... 15
Figure 9 : Production de FAO à partir de l’oxygène moléculaire et leur détoxication ... 18
Figure 10 : Modèle du flux de masse entre source et puits, et relation entre les processus de chargement des assimilats et les flux d’eau ... 25
Figure 11 : Modèle biologique d’un transporteur d’hexoses ... 30
Figure 12 : Localisation des transporteures d’hexoses dans les membranes cellulaires ... 31
Figure 13 : Modèle biologique d’un transporteur de saccharose... 32
Figure 14 : Métabolisme simplifié du saccharose ... 33
Figure 15 : Plasmide Ti ... 35
Figure 16 : Transformation génétique des plantes par A. tumefaciens ... 37
Figure 17 : Rôle des facteurs hôtes et des mécanismes cellulaires de l’intégration de l’ADN-T dans le génome des plantes par A. tumefaciens ... 38
Matériel et méthodes
Figure 18 : Rosier cv Orange ... 45Figure 19 : Plasmide PGEM-T Easy et séquences flanquantes de la zone d’insertion incluant les amorces T7 et SP6 ... 45
Figure 20 : Rosiers disposés sur des tables à marée ... 46
Figure 21 : Principales étapes de la culture du rosier miniature en MCC ... 46
Figure 22 : Chambre à pression ... 47
Sommaire des figures et tableaux
Figure 24 : Système de transfert des acides ribonucléiques (ARN) par capillarité sur la membrane Hybond N ... 65 Figure 25 : Plasmide pCambia 2301 ... 71 Figure 26 : Vecteur pBBR1 MCS-5 ... 71
Résulats et discussion
Figure 27 : Evolution du potentiel hydrique de base des plantes témoins et des plantes ayant subi le stress hydrique ... 80 Figure 28 : Evolution de la transpiration journalière relative des plantes témoins et plantes ayant subi le stress hydrique ... 80 Figure 29 : Corrélation entre la transpiration journalière relative et le potentiel hydrique de base ... 80 Figure 30 : Aspect des rosiers ayant atteint le point de flétrissement après 4 jours de stress hydrique ... 81 Figure 31 : Hauteur des rosiers miniatures au stade adulte des plantes témoins et plantes ayant subi le stress hydrique ... 83 Figure 32 : Longueur du 4ème entrenœud des rosiers miniatures au stade adulte des plantes témoins et plantes ayant subi le stress hydrique ... 83 Figure 33 : Diamètre du 4ème entrenœud des rosiers miniatures au stade adulte des plantes témoins et plantes ayant subi le stress hydrique ... 83 Figure 34 : Nombre de ramifications des rosiers miniatures au stade adulte des plantes témoins et plantes ayant subi le stress hydrique ... 84 Figure 35 : Nombre de boutons floraux des rosiers miniatures au stade adulte des plantes témoins et plantes ayant subi le stress hydrique ... 84 Figure 36 : Morphologie des plantes adultes soumises au stress hydrique ... 84 Figure 37 : Effet du stress hydrique sur la structure des tissus conducteurs et la lignification des fibres du 4ème entrenœud des plantes témoins et plantes ayant subi le stress hydrique. 85 Figure 38 : Mesures des paramètres des faisceaux libéro-ligneux des plantes témoins et stressés en eau du 1er essai ... 85 Figure 39 : Teneur en sucres solubles dans la sève xylémienne des plantes témoins et stressés en eau ... 86 Figure 40 : Teneur en sucres solubles dans les tiges des plantes témoins et plantes ayant subi le stress hydrique ... 87
Figure 41 : Teneur en sucres solubles dans les feuilles des plantes témoins et plantes ayant
subi le stress hydrique ... 87
Figure 42 : Amorces dégénérées définies dans une région conservée des 9 transporteurs de saccharose d’A. thaliana ... 94
Figure 43 : Approches utilisées pour l’amplification avec des amorces dégénérées d’une région conservée des transporteurs de saccharose et pour l’obtention des régions spécifiques ... 94
Figure 44 : Séquences obtenues après amplification avec les amorces dégénérées ... 94
Figure 45 : Exemple de membranes macroarrays hybridées avec des ADNc issus de plantes témoins et de plantes ayant subi le stress hydrique ... 96
Figure 46 : Analyse de l’expression par macroarrays des gènes dans les tiges des plantes témoins et plantes ayant subi le stress hydrique lors du 2ème essai ... 97
Figure 47 : Analyse de l’expression des gènes de transporteurs de sucres dans les tiges des plantes témoins et plantes ayant subi le stress hydrique ... 100
Figure 48 : Analyse de l’expression des gènes de transporteurs d’hexoses dans les feuilles des plantes témoins et plantes ayant subi le stress hydrique par RT-qPCR ... 101
Figure 49 : Analyse de l’expression des gènes du métabolisme glucidique dans les tiges des plantes témoins et plantes ayant subi le stress hydrique ... 104
Figure 50 : Analyse de l’expression des gènes du métabolisme glucidique dans les feuilles des plantes témoins et plantes ayant subi le stress hydrique par RT-qPCR ... 105
Figure 51 : Analyse de l’expression du gène RhASR dans les tiges des plantes témoins et plantes ayant subi le stress hydrique... 106
Figure 52 : Analyse de l’expression du gène RhASR dans les feuilles des plantes témoins et plantes ayant subi le stress hydrique par RT-qPCR ... 107
Figure 53 : Analyse de l’expression des gènes RhMAX dans les tiges des plantes témoins et plantes ayant subi le stress hydrique par RT-qPCR ... 108
Figure 54 : Etapes préliminaires pour l’induction de la callogenèse sur les cv Marseille et Orange ... 112
Figure 55 : Développement de cals ... 112
Figure 56 : Cals embryogènes obtenus après 6 semaines minimum sur milieu d’induction... ... 113
Figure 57 : Influence de l’auxine utilisée dans l’apparition des cals embryogènes ... 113
Figure 58 : Influence du type d’explant dans l’apparition des cals embryogènes ... 113
Sommaire des figures et tableaux
Figure 60 : Cal embryogène maintenu sur milieu de multiplication de cals embryogènes 114
Figure 61 : Autre type de cal embryogène obtenu... 114
Figure 62 : Vitroplants transférés en pot et acclimatés en serre ... 115
Figure 63 : Aspect des vitroplants sur milieu de micropropagation ... 117
Figure 64 : Apparition de bactéries autour des feuilles sur milieu d’induction de cal ... 117
Figure 65 : Cal inoculé avec la souche A. tumefaciens A544 présentant des événements de transformation avec le gène rapporteur GUS ... 123
Figure 66 : Cal embryogène transformé sur milieu de sélection ... 123
Figure 67 : Cals embryogènes transformés avec la souche A. tumefaciens EHA105 exprimant le gène GUS ... 123
Figure 68 : Plantules régénérées après transformation génétique avec la souche A. tumefaciens EHA105 ... 124
Figure 69 : Développement d’une suspension cellulaire ... 128
Figure 70 : Monticules de cellules obtenues 2 mois après l’inoculation des cellules avec A. tumefaciens ... 128
Figure 71 : Test GUS histochimique sur cellules cultivées en suspension ... 129
Figure 72 : Aspect des cellules en suspension de rosier ... 129
Figure 73 : Croissance des cellules sauvages et transformées en suspension ... 129
Figure 74 : Essai de régénération directe à partir des cellules transformées en suspension .... ... 130
Conclusion et perspectives
Figure 75 : Synthèse générale des travaux de thèse ... 135Sommaire des tableaux
Résulats
Tableau 1 : Liste des gènes étudiés et définition de sondes ... 92 Tableau 2 : Résultats des BLASTs des séquences de 383 pb et 351 pb obtenues après amplification avec les amorces dégénérées ... 94 Tableau 3 : Récapitulatif du nombre d’explants, pour les cv Orange et Marseille, mis sur milieu d’induction de cals en fonction de la concentration et du type d’auxines utilisées ... 112 Tableau 4 : Récapitulatif des essais de transformation génétique par A. tumefaciens ... 122
Annexes
Tableau 5 : Type d’échantillons fournis par chaque partenaire en vue du séquençage des EST du rosier ... 142 Tableau 6 : Résultats du séquençage du projet AIP RosEST ... 143
Introduction
1
Introduction
Ce travail de thèse, effectué dans le cadre d’une Convention Industrielle de Formation par la Recherche en Entreprise (CIFRE), s’est déroulé au sein de l’Equipe de
Recherche Technologique (ERT) 1082 « Applications biotechnologiques à la culture du rosier ». Mise en place en 2004, elle a été recréée en 2008 pour une durée de 4 ans. Cette ERT est adossée à la FRE CNRS 3091 PhyMoTS (Physiologie Moléculaire du Transport des Sucres chez les végétaux) et à l’entreprise Géniflore.
Le rosier pour être considéré comme miniature doit répondre à plusieurs critères horticoles définis. Ce type de rosier doit être trapu avec une taille comprise entre 30 et 40 cm, très ramifié et offrir une floraison abondante. Afin d’obtenir ces qualités recherchées, deux modes de culture sont appliqués. Le premier est le Mode de Culture Long (MCL) qui nécessite une période de culture de 10 mois, avec une phase de températures basses provoquant un arrêt de la croissance végétative. Cette période de repos végétatif est bénéfique pour l’accumulation de substances nutritives (notamment des sucres et des acides aminés), se traduisant à la reprise de la croissance par un port robuste avec des tiges solides et très ramifiées (Michonneau, 2002). Par contre, ce mode de culture, ne permet la commercialisation des rosiers miniatures qu’une fois par an. Afin de résoudre ce problème de durée de production, le Mode de Culture Court (MCC) en 4 mois dans des conditions semi-contrôlées (température, humidité et luminosité) est privilégié. Il permet une vente continue des rosiers miniatures tout au long de l’année. Cependant, de telles conditions de culture favorisent la croissance en hauteur des plantes au détriment de la ramification. La limitation de ce phénomène nécessite l’emploi d’un régulateur de croissance : le paclobutrazole. Devant l’importance et le regain d’intérêt des pouvoirs publics et des consommateurs pour la protection de l’environnement, l’utilisation d’un tel produit phytosanitaire dans les années à venir est compromise. C’est pourquoi, l’un des thèmes de recherche de l’ERT est d’étudier les effets de l’application d’un stress abiotique comme une contrainte hydrique, afin de parvenir à la qualité architecturale souhaitée du rosier miniature, sans utilisation de régulateurs de croissance.
2 Trois axes de recherche ont été définis autour de cette thématique. Ils s’inscrivent dans la continuité des études antérieures et ont pour objectif d’élargir et d’approfondir les connaissances sur les mécanismes de réponse du rosier miniature à l’application d’une contrainte hydrique. Le premier axe consiste à étudier les effets de l’application d’une contrainte hydrique sur les rosiers au niveau morphologique, histologique et physiologique. Le deuxième axe concerne l’analyse de l’expression de gènes impliqués notamment dans le métabolisme glucidique, le transport des sucres et dans la réponse au stress hydrique. Le troisième axe vise le développement de protocoles efficaces de transformation génétique des rosiers en vue d’une validation de certains gènes impliqués dans la réponse au stress hydrique.
La présentation d’une synthèse bibliographique détaillant les connaissances actuelles sur le rosier et sa production, puis les connaissances acquises sur les effets d’un déficit en eau sur la plante et sur le métabolisme glucidique, et enfin les mécanismes de transformation génétique par Agrobacterium tumefaciens seront présentés. Puis, le matériel et les méthodes utilisés pour cette étude seront décrits. Ensuite, les résultats obtenus pour chacun des trois axes étudiés seront présentés et discutés pour répondre aux objectifs de ce travail de thèse concernant les impacts de la contrainte hydrique sur l’architecture du rosier miniature avec l’étude des gènes impliquées et le développement de protocoles de transformation génétique stable en vue de leur validation.
Synthèse bibliographique 3
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Figure : Caractéristiques générales du genre Rosa. A : Les feuilles sont alternes,
composées (5 à 7 folioles), imparipennées et souvent dentées. Elles sont munies de stipules à la base du pétiole. B : Les fleurs sont généralement disposées en corymbe. C : Elles sont de type 5 : 5 sépales + 5 pétales + n étamines + n carpelles (n est un multiple de 5). D : Le fruit est un faux fruit charnu appelé le cynorrhodon.
Sépale Pétale Etamine Carpelle Diagramme floral C D
Synthèse bibliographique
4
I.
Les roses : généralités
Au cours de l’histoire, la rose a toujours détenu une grande symbolique. Elle est mentionnée dans la littérature et la peinture, associée à la Vierge et à l’amour, mais également à la guerre et à la politique. En effet, la guerre des Deux-Roses opposa en Angleterre, au Xème siècle, la maison d'York (dont l'emblème était une rose blanche) à celle de Lancastre (représentée par une rose rouge). La rose est aujourd'hui encore la fleur symbolique de l'Angleterre. Plus récemment, la rose a été associée au parti socialiste.
A.
Classification botanique du rosier
Le rosier appartient au genre Rosa, de la famille des Rosacées. Les rosiers sont répandues essentiellement dans l’hémisphère nord. La classification du rosier est définie comme suit : Règne : Plantae Sous-règne : Tracheobionta Division : Magnoliophyta Classe : Magnoliopsida Sous-classe : Rosidae Ordre : Rosales Famille : Rosaceae Genre : Rosa Sous-genre : Eurosa
Le genre Rosa est composé de 120 espèces dont la majeure partie appartient au sous-genre Eurosa. Ce sous-genre compte environ 115 espèces et est également divisé en 10 sections (Banksiae, Bracteatae, Laevigatae, Carolinae, Caninae, Chinensis,
Cinnamomeae, Gallicae, Pimpinellifoliae, Synstylae) (Gudin, 2000).
Les rosiers sont des arbustes épineux mesurant de 30 cm à 5 m de haut, généralement à feuilles caduques. Leurs feuilles présentent le plus souvent de 5 à 7 folioles dentées. Rarement solitaires, les fleurs sont généralement groupées en corymbes (figure 1). Les sépales et les pétales sont en principe au nombre de 5. Le cynorrhodon est le faux fruit du rosier qui est le résultat du développement du receptable. Il contient de nombreux akènes qui représentent les véritables fruits. Ces fruits sont secs, indéhiscents à graine unique dont le péricarpe n’est pas soudé à cette graine. La principale modification observée chez les rosiers cultivés est la multiplication des pétales due à la transformation des étamines.
Figure 2 : Généalogie simplifiée des rosiers. R . p h o e n ic ia R o s ie rs G a ll iq u e s R . m o s c a ta R . c a n in a R o s ie rs d e D a m a s R o s ie rs d e C h in e R o s ie rs A lb a R o s ie rs B o u rb o n s R o s ie rs N o is e tt e R o s ie rs C e n tf e u il le s R o s ie rs M o u s s e u x R o s ie rs T h é H y b ri d e s re m o n ta n H y b ri d e s d e T h é R o s ie rs m o d e rn e s à g ro s s e s f le u rs R o s e s a n g la is e s A n c ie n s h y b ri d e s e u ro p é e n s R o s ie rs a n c ie n s S o le il d ’O r O ld B lu sh c M m e A n to in e M ei ll an d
Synthèse bibliographique
5
B.
Histoire et évolution des rosiers
Le rosier est probablement apparu, il y a 35 millions d’années, en Asie et sa culture a commencé en Chine il y a environ 5 000 ans. Le rosier a évolué au cours des siècles en raison de diverses hybridations (figure 2). Tout d’abord, elles ont été empiriques avec les hydridations des roses anciennes, puis de nos jours la sélection des rosiers s’est développée au moyen de la cartographie génétique (Gudin, 2000).
1.
Roses anciennes et premières hybridations
a. Anciens hybrides européens : les Gallicanae
La culture des rosiers a dû commencer par des églantiers sauvages comme
R. canina, R. rubiginosa, R. arvensis et R. spinosissima au nord de l’Europe, mais aussi R. moschata et R. foetida venus du Moyen Orient. Puis, de nombreux hybrides sont
probablement issus, à l’origine, de Gallica (R. gallica). Ainsi, la rose de Damas (R. damascena), rapportée en Europe occidentale lors des croisades est le fruit de l’hybridation de R. gallica x R. moschata (pour le groupe d’été avec période de floraison courte seulement l’été) et R. gallica x R. phoenicia (pour le groupe d’automne avec période de floraison prolongée jusqu’en automne). De même, R. damascena et R. canina (ou d’autres espèces proches) ont donné naissance au rosier Alba (R. alba) (Gudin, 2000).
Des écrits de l’Antiquité ont relaté la présence des roses en Egypte, en Grèce et dans l’Empire Romain. Elles ont été introduites en Egypte par les Grecs, après la conquête d’Alexandre le Grand au IVème siècle avant J.C. Elles ont été retrouvées dans une tombe égyptienne du Fayoum par le Dr Crepin lors de fouilles au XIXème siècle. Les Romains les ont utilisées principalement pour les fêtes religieuses. C’était d’ailleurs l’une de leur principale importation provenant de l’Egypte. Plus tard, les Romains ont fondé les prémisses des techniques horticoles, développant notamment le greffage et le forçage. Cependant, après le déclin de l’Empire Romain, la popularité de la rose a diminué et sa culture a été limitée aux monastères. À l’époque, seule une variété à fleurs blanches était cultivée principalement pour ses vertus médicinales. Ce n’est qu’au XIIème et XIIIème siècles, lors des croisades, que notamment R. gallica officinalis (rose des apothicaires) a été ramenée du Proche Orient en Europe. Cette rose a été utilisée en parfumerie et elle fit la fortune de Provins, en région parisienne. C’est à cette époque que la culture du rosier a
6 réellement débuté en France, d’abord pour ses vertus médicinales et cosmétiques avant d’être appréciée pour sa beauté dans les jardins.
Un engouement pour l’amélioration des qualités horticoles de cette fleur a commencé en Allemagne, puis en Hollande où sont apparus, à la fin du XVIème siècle, les rosiers Centfeuilles (R. centifolia) (croisement entre un rosier Damas et Alba). Les rosiers Centfeuilles sont de grands buissons à feuilles pubescentes, arrondies, sombres et mates. Les fleurs doubles, le plus souvent roses, sont très parfumées. Ces rosiers ont montré une grande aptitude à muter et ont ainsi donné naissance au rosier mousseux (présentant de fines excroissances qui tissent comme une mousse autour du pédoncule). Vers la fin du XVIIIème siècle, apparut aussi le rosier de Portland (R. portlandica) rapporté d’Italie mais dont l’origine est incertaine (Haudebourg, 1998).
Ainsi, en Europe, les Gallicanae étaient les seuls hybrides existant jusqu’au XVIIIème siècle. D’ailleurs, aucun rosier n'était obtenu artificiellement puisqu'ils provenaient de mutations naturelles et de croisements aléatoires. Toutes ces variétés avaient des traits communs : développées en gros buissons, elles présentaient le plus souvent une floraison unique et abondante. Chaque fleur très parfumée se composait de nombreux pétales variant du blanc pur au pourpre sombre.
b. Rosiers du Bengale ou rosiers de Chine
Ce n’est seulement qu’à la fin du XVIIIème siècle, avec les voyages des botanistes européens, que les rosiers du Bengale ou de Chine (R. chinensis semperflorens), comme le cultivar Old Blush, ont été rapportés en Europe, avec le développement des transports maritimes. Ces rosiers ont la capacité d’apporter de nouveaux coloris et d’être remontants (c'est-à-dire qu’ils fleurissent plusieurs fois dans l’année). À partir de ce nouveau type de roses, la France va devenir le leader, en matière d’amélioration des roses, grâce à l'Impératrice Joséphine. En effet, elle possédait au début du XIXème siècle, à son château de Malmaison, la collection de roses la plus importante de France et même d'Europe : elle comptait plusieurs centaines de variétés. À partir de cette collection, différents sélectionneurs, comme Vibert et Desmacret, vont créer plusieurs centaines de nouvelles variétés. Actuellement, ces variétés ont presque disparu, remplacées par des variétés plus rustiques et plus vigoureuses. Cependant, leur patrimoine génétique s’est transmis à beaucoup de roses modernes (Haudebourg, 1998).
Synthèse bibliographique
7
c. Rosiers Noisette et rosiers Thé
Les rosiers Noisette sont nés au XIXème siècle, grâce à John Champney, du croisement entre R. moschata et Old Blush, lequel a été importé aux Etats-unis par Philippe Noisette. La floraison est remontante, presque continuelle en climat doux. Les fleurs, groupées en bouquets légers, ont des tons pastel. Ces teintes varient du jaune pâle au rose, en passant par les crèmes, ocrés ou saumonés. Puis, un nouveau type de rosier de Chine est apparu : les rosiers Thé. Ils sont ainsi nommés à cause de l’odeur de thé obtenue, lors de leur voyage dans des sacs de thé. Ces roses étaient assez similaires à celles des rosiers du Bengale, mais les fleurs, en plus de posséder des teintes jaunes et oranges, étaient plus volumineuses. Malheureusement, ce rosier était non remontant (Haudebourg, 1998).
d. Rosiers Bourbon, hybrides remontants et hybrides de Thé
Les rosiers Bengale et R. damascesna formaient des haies, sur l’île de la Réunion (anciennement l’île Bourbon). Le croisement de ces deux espèces a donné naissance naturellement aux rosiers Bourbon. Puis, des hybrides remontants, descendant des rosiers de Chine, ont été développés, par hybridation avec les rosiers Thé. L’année 1867, marque les prémisses des roses modernes avec la naissance des hybrides de Thé. Avec ces roses, la remontance a été transmise aux souches européennes. Les hybrides de Thé avaient quasiment atteint la forme des rosiers d’aujourd’hui, mais deux couleurs étaient absentes : le jaune vif et le rouge écarlate. C’est pourquoi les rosiers modernes ont vu le jour (Haudebourg, 1998).
2.
Rosiers modernes à grosses fleurs
Autrefois, certains hybrides contenaient du jaune, mais il était mat et peu lumineux. Ils descendaient tous d’un rosier Thé, introduit en Europe en 1824, nommé Park’s Yellow Tea Scented China. Cependant, les essais pour transférer cette teinte aux
Gallicanae, aux hybrides remontants et hybrides de Thé, n’avaient pas abouti. En 1897,
Joseph Pernet-Ducher a obtenu Soleil d’or, qui est le fruit de l’hybridation entre un hybride de Thé et R. foetida bicolor (ayant une mutation de la couleur jaune et orange). Cette nouvelle variété avait de grandes fleurs doubles et parfumées, nuancées d’orange et teintée de rouge. Avec cette couleur inédite, elle rencontra un succès immédiat. Plus tard, Francis Meilland créa une rose jaune accompagnée de rose carmin, qu’il nomma
fleurs groupées
Rosier grimpant Rosier tige Rosier pleureur
Rosier miniature
Synthèse bibliographique
8 Mme Antoine Meilland. Cette célèbre rose obtint la médaille d’or de la Société Nationale Horticole Française en 1939, puis d’autres nombreuses récompenses.
3.
Roses anglaises
Dans les années cinquante, David Austin a redécouvert les roses anciennes (Gallica, Damas, Bourbons...) et a été charmé par leur parfum et leurs coloris. De ce fait, il désira obtenir des roses qui aient non seulement la forme et le charme des roses d’autrefois, mais également une gamme de couleurs plus étendue, la remontance et la résistance aux maladies des roses modernes. C’est ainsi que les roses anglaises sont nées (Haudebourg, 1998).
4.
Divers types de rosiers
Il est difficile de distinguer les espèces pures, les hybrides et les formes de jardin en raison des multiples hybridations qui se sont déroulées au cours des siècles. Diverses classifications horticoles basées notamment sur leur architecture ont vu le jour (figure 3).
Tout d’abord, les rosiers buisson à grandes fleurs sont en général pas très hauts (maximum 1,50 m). Ils sont munis de fleurs doubles solitaires et de forme parfaite. Il existe aussi des rosiers buisson à fleurs groupées. La création de ces rosiers résulte de l’introduction de R. multiflora ou R. polyantha, une espèce peuplant les côtes caillouteuses du Japon et de la Corée dont résulte le groupe des Floribunda (hybridation avec hybride de Thé pour une meilleure résistance au froid) (Haudebourg, 1998). Ces variétés de rosiers buissons se différencient des hybrides de Thé par un port plus compact et une ramification de la tige florale qui porte à son extrémité de nombreux boutons formant un corymbe de roses, plus ou moins grosses et serrées les unes contre les autres. Selon les variétés, les bouquets floraux peuvent aller de 5 à 6 roses jusqu'à plusieurs dizaines. On distingue également les rosiers paysagers regroupant des arbustes robustes à fleurs doubles ou à fleurs d’églantiers, florifères, pouvant former un très gros buisson de 2 m de haut qui ont en commun un port naturel. Ils peuvent être à végétation érigée, retombant ou couvre-sol, mais leurs qualités premières sont d'être rustiques et de demander peu de soins. Sous des climats et dans des milieux divers, plusieurs espèces botaniques de rosiers grimpants ont la capacité de s’accrocher aux arbres, ou d’escalader les rochers. Par sélection, des cultivars sont maintenant aptes à garnir des supports ou
9 habiller des façades. Il est possible aussi de trouver des rosiers tiges et pleureurs. Ces deux derniers sont greffés au sommet d’une tige d’églantier (Brochard, 2006).
Un autre type d’architecture existe chez les rosiers, il s’agit d’un port miniature. Tous les types de roses anciennes (Gallica, Centifolia, Chinensis, …) ont une forme miniature. Cependant, ces rosiers ne fleurissent qu’une seule fois par an. Comme leurs homologues de taille normale, les rosiers miniatures ont été croisés avec les rosiers d’origine asiatique afin d’obtenir la remontance. Ainsi, à partir de 1940, Pedro Dot a développé des rosiers miniatures par hybridation avec des hybrides de Thé (Haudebourg, 1998). Il a obtenu de belles variétés, dont beaucoup sont encore commercialisées. Son expérience a permis d’établir que le nanisme est un caractère dominant et que, lorsque des rosiers nains sont croisés avec des hybrides de Thé, la chance d’obtenir un rosier miniature est élevée. Dans les années 50, l’Europe a délaissé ce type de rosier, contrairement aux Etats-Unis où leur succès restait important. La différence de niveau de vie de la population y était sans doute la cause. Le rosier miniature est, avant tout, un produit de consommation citadine, très souvent destiné à être vendu et cultivé en pot, pour égayer les intérieurs, balcons et terrasses. Cependant, depuis la fin des années 70, l’augmentation du niveau de vie des Européens a permis aux rosiers miniatures de faire leur réapparition.
C.
Importance économique
La rose est vendue sous plusieurs formes : en fleurs coupées pour agrémenter les bouquets, en bottes destinées au jardin, mais aussi en potée où les rosiers miniatures tiennent une grande part dans cette catégorie. Les fleurs de roses sont utilisées également en parfumerie, mais aussi en alimentation (confiserie, thé, confiture) ou encore pour leurs vertus médicinales.
Le rosier, représenté par plus de 35 000 variétés, est l’une des plantes ornementales cultivées parmi les plus vendues dans le monde. Les surfaces de production destinées à la culture de roses représentent 25% des fleurs coupées. Ainsi, 8 milliards de tiges fleurs coupées, 80 millions de plantes en pots et 220 millions de rosiers de jardin sont vendus annuellement dans le monde. Le marché de la rose, qui a généré 758 millions d’euros en 2006, provoque une grande concurrence internationale due à l’abondance de l’offre de roses. C’est la culture de fleur qui se développe le plus dans le monde. Les
Synthèse bibliographique
10 principaux pays producteurs sont traditionnellement localisés en Europe comme les Pays Bas, l’Italie et la France. Cependant, on assiste à l’émergence de la production de certains pays d’Amérique latine comme l’Equateur et d’Afrique tel que le Kenya où les surfaces cultivées ont triplé entre 1994 et 1997. Ce récent développement de la culture de rosier a pu voir le jour grâce notamment à l’amélioration des techniques de production et des conditions de transport (Oniflor-TNS Sofrès, 2004).
La production française de rosiers en 2001 comprend 300 ha cultivés essentiellement sous serre. Le bassin majeur de production en France se situe dans la région PACA (Provence, Alpes, Côte d’Azur). Contrairement à la tendance mondiale, en France la production diminue depuis quelques années. De plus, la balance commerciale est en déficit. Ainsi, les importations sont plus de 22 fois supérieures aux exportations. Malgré la balance commerciale négative, la rose ne cesse de prendre de l’importance par rapport aux autres fleurs en France. Elle détient la première place des importations de fleurs pour la France. De 1993 à 2006, la part des rosiers n’a quasiment pas arrêté de croître passant de 12,5% à 29,2% représentant 117,7 millions d’euros. Concernant les exportations, la part de l’ensemble des fleurs fraîches a augmenté jusqu’en 1998 puis a fortement diminué (-60%) jusqu’en 2006. Cette tendance est surtout due à la baisse des surfaces de production. Les Pays-Bas sont le premier fournisseur, tandis que la Suisse, suivie de l’Italie, sont les principaux clients de la France (Viniflor- TNS Sofrès, 2008).
En France, la production de rosier miniature, principalement en Mode Cultural Long (MCL), ne représente que 25% de la demande du marché national (l’importation atteint 6 millions unités par an). Parallèlement, les pays de l’Europe du Nord (Pays-Bas, Danemark…) assurent la majeure partie de la production en Mode Cultural Court (MCC).
D.
Connaissances sur le génome du rosier
Le génome du rosier est relativement petit, de l’ordre de 560 Mpb pour environ 30 000 gènes. Par comparaison, Arabidopsis thaliana présente un génome de 120 Mpb et 25 000 gènes tandis que le maïs (Zea mays) possède un génome de 2 500 Mpb. Le génome du rosier est organisé 7 chromosomes. La plupart des rosiers cultivés sont tétraploïdes (4 x 7), alors que les rosiers sauvages sont généralement diploïdes (2 x 7) comme R. gallica et R. foetida. Cependant, il existe aussi des tri-, penta- (R. canina), hexa- et octa-ploïdes.
11 Le génome du rosier n’est pas séquencé. Cependant, différentes bases d’EST (Expressed Sequence Tag) sont regroupées sur le site URGI (Unité de Recherche Génomique-Info) public (http://urgi.versailles.inra.fr/GnpSeq) ou sur le site GDR (Genome Database for Rosaceae ; http://www.bioinfo.wsu.edu/gdr) (Jung et al., 2008). Parmi les plus importantes, il existe celle de Lyon (Channelière et al., 2002) avec 1 794 EST impliquées dans la production de parfum provenant de pétales de la variété diploïde Old Blush, aussi appelée Parson’s Pink China, (R. chinensis). On retrouve aussi celle d’Israël (Guterman et al., 2002) comptant 2 100 gènes liés également au parfum. Cette base d’EST a été produite sur deux variétés tétraploïdes de R. hybrida, dont l’une est odorante et l’autre non odorante (Fragrant Cloud et Golden Gate respectivement). La base d’EST d’Angers (Foucher et al., 2008), plus récente, est aussi l’une des plus importantes avec 5 000 EST formant 2 556 éléments d’unigènes. Contrairement aux deux autres bases, elle a été réalisée à partir d’apex de deux variétés, Black baccara (R. hybrida, tétraploïde) et Bagatelle (R. wichuraiana, diploïde) : elle contient des gènes supposés intervenir dans le développement du bourgeon et dans l’initiation florale. Au total, 4 765 séquences d’unigènes sont disponibles sur la base de données du rosier, représentant le 5ème des gènes potentiellement exprimés. Ces séquences sont déterminantes pour l’étude de gènes d’intérêt.
Afin d'élargir la base d'EST disponible, un projet français est actuellement en cours (annexe 1). Cette étape préliminaire permettra d'aboutir à terme au séquençage complet du génome du rosier. Il sera alors destiné à devenir la plante modèle des ornementales ligneuses.
Depuis quelques années, la cartographie génétique des plantes s’est considérablement développée. Le rosier, qui est l’un des modèles de plantes ornementales ligneuses, n’échappe pas à cette règle. La cartographie peut permettre une avancée considérable dans la connaissance du génome du rosier notamment par le développement de marqueurs moléculaires (notamment à partir d’EST) et la recherche de QTL (Quantative Trait Loci) facilitant le travail des sélectionneurs. Par exemple, les QTL étudiés chez le rosier sont impliqués dans différents aspects tels que la résistance aux maladies (Linde et al., 2004 ; Dugo et al, 2005) ou le contrôle de la floraison (Hibrant Saint Oyant et al., 2008). Tous ces critères tendent à améliorer la qualité esthétique globale de la plante.
Début d’été Fin d’été Début printemps Floraison
Culture en 10 mois
Figure 4 : Culture du rosier miniature en MCL (10 mois). Après le bouturage, les rosiers
subissent une taille afin d’induire la formation de ramifications. Puis, les plantes sont soumises à des températures basses (entre -5 et 10°C) pendant 3 mois, avant le débourrement dès le retour des conditions printanières. Enfin, une deuxième taille est réalisée avant la floraison.
Figure 5 : Concentration des nutriments (A : sucres ; B : acides aminés) dans la sève xylémienne avec différents modes de culture (d’après Michonneau, 2002).
o ct n o v déc jan fév m ar av r m ai ju in juil aoû t sep 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0
co nd itio ns natu relles M C C M C L C o n ce n tr a ti o n e n a c id e s a m in é s to ta u x e n n m o l. m l -1
oct nov déc jan fév mar avr mai juin juil août sept 0 1000 2000 3000 4000 5000 conditions naturelles MCC MCL C o n ce n tr a ti o n e n s u c re s to ta u x e n n m o l. m l -1 Débourrement
Bouturage 1ère taille Période hivernale 2ème taille
12
II. Qualité architecturale des rosiers
A.
Qualité esthétique
La qualité esthétique est souvent un concept subjectif qui diffère d’un consommateur à l’autre. Cependant, l’aspect esthétique d’un produit doit satisfaire la majorité des goûts des acheteurs afin d’assurer une bonne rentabilité économique. Chez les végétaux d’ornement, l’aspect global de l’esthétisme recherché passe par plusieurs composantes, notamment la vigueur, le port, le pouvoir florifère et l’aspect architectural des plantes.
Le rosier miniature n’échappe pas à cette règle. Il doit répondre à des critères horticoles bien précis en terme de taille, de ramifications et de pouvoir florifère. Ainsi, ce type de rosier ne doit pas dépasser une hauteur de 40 cm et doit présenter de nombreuses ramifications munies de nombreuses fleurs. Afin de parvenir à la qualité architecturale souhaitée, le mode de culture peut influencer l’apparence des rosiers miniatures.
B.
Influence du mode de culture sur l’architecture du rosier
miniature
1. Le Mode Cultural Long (MCL)
La culture des rosiers miniatures en MCL s’étend sur une période de 10 mois (figure 4), et est soumise aux conditions climatiques hivernales (entre -5 et 10°C) assurant une vernalisation. Ces conditions entraînent un arrêt de la croissance végétative impliquant des changements physiologiques et morphologiques après le retour des conditions printanières. En effet, pendant la période de froid, il y a une mise en réserve de substances nutritives. Puis, à la reprise de la végétation, de mars à juillet (figure 5), ces substances nutritives (notamment des sucres et acides aminés) vont se concentrer dans la sève xylémienne (Michonneau, 2002). Ces changements saisonniers sont bénéfiques pour la qualité architecturale du rosier miniature. Ainsi, les tiges portant de nombreuses fleurs sont plus courtes et rigides (Michonneau, 2002).
Malgré l’obtention des qualités horticoles recherchées, le MCL des rosiers miniatures empêche une production en continu. Ainsi, la commercialisation n’est possible qu’une fois par an, uniquement au printemps. Par conséquent, le MCC offre de nombreux avantages.
4ème semaine 7ème semaine 9ème semaine Floraison
Culture en 4 mois
Figure 6 : Culture du rosier miniature en MCC (4 mois). Les rosiers subissent une
1ère taille et une 2ème taille à 4 et 7 semaines respectivement après le bouturage. La floraison a lieu après plusieurs semaines d’intenses applications de régulateurs de croissance.
Bouturage 2ème taille
Distançage des pots
1ère taille Contrôle de la croissance par
13
2. Le Mode Cultural Court (MCC)
La culture des rosiers miniatures en MCC s’étend sur une période de 4 mois (figure 6) en conditions semi-contrôlées (température, lumière et humidité). La courte période de production permet une rentabilité plus élevée avec la possibilité d’effectuer plusieurs cycles de culture. Cependant, l’architecture des rosiers en MCC est d’une qualité inférieure à celles des rosiers produits en MCL. Les rosiers sont moins trapus, moins ramifiés et moins florifères que les rosiers du MCL. De plus, les tiges sont frêles et allongées. De ce fait, le poids des fleurs n’est pas propice au maintien d’un port robuste et vertical du rosier miniature.
Ces modifications morphologiques défavorables des rosiers en MCC peuvent s’expliquer par deux raisons. La première est due à l’absence de vernalisation et par conséquent de l’absence de variations saisonnières au niveau du taux des sucres. En effet, il apparaît clairement que la concentration en sucres en MCC est beaucoup moins élevée dans la sève xylémienne qu’en MCL (figure 5) (Michonneau, 2002). En MCC, la teneur en sucres est constante tout au long de l’année, tandis qu’en MCL une accumulation des sucres s’effectue à la fin de l’hiver et au printemps. Or, l’apport de nutriments est un paramètre déterminant pour de nombreux phénomènes comme la croissance et la morphogenèse des végétaux (Gibson, 2005). Dans la serre, le réglage de la photopériode en jours longs favorise la synthèse des gibbérellines, ce qui pourrait être la deuxième explication. En effet, les gibbérellines à activité biologique, connue pour engendrer l’élongation des tiges, ont un fort impact sur l’architecture de la plante (Wang et Li, 2008).
Figure 7 : Métabolisme de la principale voie des gibbérellines (GA) et action du paclobutrazole. Les groupes fonctionnels qui sont introduits ou modifiés à chaque étape sont
indiqués en rouge et les GAs biologiquement actives sont surlignées en vert. Les enzymes qui catalysent ces réactions sont : (1) ent-copalyl diphosphate synthase ; (2) ent-Kaurene synthase ; (3) ent-kaurene 19-oxidase ; (4) acide ent-Kaurenoic 7β-hydoxylase ; (5) GA12 -aldehyde synthase ; (6) GA7-oxidase (GA7ox) ; (7) GA13-hydroxylase (GA13ox) ; (8) GA20-oxidase (GA20ox) ; (9) GA3 β-hydroxylase (GA3ox) ; (10) GA2-oxidase (GA2ox). Le paclobutrazole inhibe la conversion du ent-kaurene en acide ent-kaurenoique par blocage de la monoxygénase à cytochrome P450 (d’après Hedden et Phillips, 2000).
