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Arch
ive
TOULOUSE
Arch
ive
Ouver
te
(OATAO)
OATAOis an open access repositorythat collectsthe work of Toulouse researchers and makesit freely available overthe web where possible.Thisis an author-deposited version publishedin: http://oatao.univ-toulouse.fr/ Eprints ID : 15881
To cite this version :
Quignon, Lucie. Étude prospective secondaire visant à préciser l’influence delatempérature de conservation des urines surle profil électrophorétique des protéines urinaires sur gel d’agarose chezle chien protéinurique. Thèse d'exercice, Médecine
vétérinaire, Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse - ENVT, 2015, 100 p.
Any correspondence concerningthis service should be senttothe repository administrator: staff-oatao@inp-toulouse.fr.
REMERCIEMENTS
A
Mons
ieur
le
Professeur
Hugues
CHAP,
Professeur des Universités-Praticien Hospitalier del’Université Paul Sabatier de Toulouse Biochimie et Biologie Moléculaire
Qui nous a faitl’honneur d’accepterla présidence dujury dethèse. Hommages respectueux
***
A
Madame
le
Docteur
Rache
l
LAVOUE
,
Maitre de Conférences àl’Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse Médecine Interne
Qui a accepté d’encadrer ce projet et pour m’avoir guidé dansla réalisation de cettethèse. Qu’elletrouveicitoutel’expression de ma reconnaissance
***
A
Madame
le
Professeur
Cather
ine
TRUMEL
,
Professeur àl’Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse Pathologie Médicale des Equidés et Carnivores
Pour avoir accepté de prendre part à cejury dethèse. Sincères remerciements
TABLE
DES
MATIERES
REMERCIEMENTS ... 1
TABLE DES MATIERES ... 5
TABLE DES ILLUSTRATIONS ... 9
LISTE DES ABREVIATIONS ... 11
INTRODUCTION ... 13
PARTIE I : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ... 15
I. Le rein et l’excrétion des protéines ... 17
A. Anatomie descriptive rénale ... 17
1. Macrostructure ... 17 a. Capsule fibreuse ... 17 b. Sinus rénal ... 17 c. Parenchyme rénal ... 17 2. Microstructure ... 19 a. Le néphron ... 19
b. Les tubes collecteurs ... 21
B. Gestion rénale des protéines ... 22
1. Filtration glomérulaire ... 22
a. Structure de la membrane filtrante ... 22
b. Filtration glomérulaire selon la taille des molécules plasmatiques ... 23
c. Filtration glomérulaire selon la charge ionique des molécules plasmatiques ... 24
2. Gestion tubulaire ... 25
a. Réabsorption tubulaire ... 25
b. Sécrétion tubulaire ... 25
3. Composition physiologique des urines ... 25
II. Protéinurie ... 27
A. Définition ... 27
B. Etiophysiopathologie ... 27
1. Physiopathologie ... 27
2. Etiologies des protéinuries pathologiques du chien ... 28
a. Protéinuries pré-‐rénales ... 28
b. Protéinuries rénales ... 28
C. Intérêts de la caractérisation de la protéinurie rénale persistante ... 32
D. Méthodes de détection d’une protéinurie pathologique ... 32
III. Electrophorèse unidimensionnelle des protéines urinaires ... 35
A. Intérêts de la qualification d’une protéinurie pathologique par électrophorèse unidimensionnelle des protéines urinaires ... 35
1. Intérêt pratique ... 35
2. Intérêt diagnostique ... 35
3. Intérêt thérapeutique ... 36
B. Définition et technique de mesure ... 36
1. Définition ... 36
2. Techniques de mesure ... 37
a. Bases physico-‐chimiques ... 37
b. Protocole général ... 38
c. Méthode ... 38
C. Interprétation des profils électrophorétiques unidimensionnels ... 39
1. Principe de l’interprétation ... 39
2. Facteurs de variation pré-‐analytiques ... 41
a. Liés à la technique ... 41
b. Liés à l’animal ... 43
3. Facteurs de variation analytiques ... 45
PARTIE II : ETUDE EXPERIMENTALE ... 48
I. Contexte ... 49
II. Etude préliminaire observationnelle ... 51
A. Objectifs ... 51
B. Matériel et méthode ... 51
1. Spécimens urinaires ... 51
a. Critères d’inclusion ... 51
b. Critères d’exclusion ... 52
2. Etapes pré-‐analytiques ... 52
a. Prélèvements urinaires ... 52
b. Etapes préliminaires ... 53
c. Conservation des urines ... 53
d. Préparation des urines ... 54
3. Etapes analytiques immédiates ... 57
a. RPCU initial ... 57
b. SDS-‐AGE initiale ... 57
4. Etude analytique ... 58
a. Décongélation et homogénéisation des spécimens ... 58
b. Réalisation des RPCU et des SDS-‐AGE ... 58
C. Résultats ... 59
1. Animaux sélectionnés ... 59
2. Influence de la durée de stockage à -‐20°C ... 59
3. Influence de la nature du tube ... 60
D. Conclusions préliminaires ... 60
III. Etude principale ... 61
A. Objectifs ... 61
B. Matériel et Méthode ... 61
1. Spécimens urinaires ... 61
2. Etapes pré-‐analytiques ... 61
a. Préparation des spécimens ... 62
b. Stockage des urines entre collecte et analyses ultérieures ... 62
3. Influence de la durée de conservation des urines à la température de -‐20°C ... 62
a. Décongélation et homogénéisation des spécimens ... 62
b. Réalisation des RPCU et des SDS-‐AGE ... 63
4. Etude statistique ... 63
C. Résultats de l’étude principale ... 64
1. Animaux sélectionnés ... 64
2. Profils électrophorétique à J0 ... 64
3. Modification des profils après conservation à -‐20 °C ... 64
4. Effet des différentes variables sur l’apparition de modification de profil ... 66
a. Effets des paramètres démographiques sur la présence d’une modification du profil 66 b. Effets des facteurs de l’analyse urinaire sur la présence d’une modification du profil 67 c. Effet du type de profil sur l’apparition de la modification ... 68
IV. Discussion et limites ... 71
A. Analyse des résultats ... 71
B. Limites ... 72
ANNEXES ... 76 BIBLIOGRAPHIE ... 99
TABLE
DES
ILLUSTRATIONS
TABLE DES FIGURES
Figure 1 : dessin schématique del'organisation anatomique rénale [A. PITMANN (2015).
Néphropathiefamiliale. Europeanfamilial nephropathyfund. ] ... 18 Figure 2 : dessin schématique dela structure du corpuscule rénal [31] ... 20 Figure 3 : dessin schématique dela microstructure rénale [A. PITMANN (2015). Néphropathie
familiale. Europeanfamilial nephropathyfund.] ... 21 Figure 4 : dessin schématique dela structure dela membranefiltrante [18] ... 22 Figure 5 : dessin schématique dela structure dela membranefiltrante mettant en évidence ses
différentes propriétés defiltration [18] ... 24 Figure 6 : schéma dela dénaturation des protéines parle SDS [N.OSWALD (2008). How SDS-PAGE works. Protein analysis, detection and assay.] ... 38 Figure 7 : SDS-AGE du spécimen PROCON 20 del'étude présentantl'interprétation possible d’un profil électrophorétique ... 40 Figure 8 : gel électrophorétique de PROCON 13 J5 mettant en évidencela bande spermatique ... 44 Figure 9 : Résultats del’étude THERON et collaborateurs [39] ... 49 Figure 10 : Modifications du profil électrophorétique du spécimen PROCON 6 enfonction dela durée de conservation à -20°C ... 65 Figure 11 : répartition dela protéinurie enfonction dela présence ou del'absence de modification du profil à J15. ... 68 Figure 12 : nombre de chien présentant ou non une modification du profil enfonction dutype de profil après 15jours de conservation des urines à -20°C ... 69 Figure 13 : comparaison del'intensité d'une coloration entre deux profils d'un même animal ... 73
TABLE DES TABLEAUX
Tableau 1 : analyse cytologique du sédiment urinaire ... 56 Tableau 2 : planning prévisionnel del'étude préliminaire ... 59 Tableau 3 : planning prévisionnel del'étude principale ... 63 Tableau 4 : p-value des modèles des études del’effet del’âge et du sexe surla modification du profil électrophorétique après 1,2 ou 5jours de conservation des urines à -20°C ... 66 Tableau 5 : p-values des différents paramètres analytiques pourl'effet surla présence d'une
modification du profil électrophorétique après différents délais de conservation des urines à -20°C . 67 Tableau 6 : p-value des modèles des études del’effet dutype de profil surla modification du profil électrophorétique après 1,2, 5 ou 15jours de conservation des urines à -20°C ... 69
LISTE
DES
ABREVIATIONS
SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SDS-AGE: Sodium dodecyl sulfate agarose gel electrophoresis
IRIS: International renalinterest society GFR: Glomerular filtration rate
Alb: Albumine
GBM: Glomerular basement membrane ESL: Endothelial cell surfacelayer Qi:Plasma flow rate
A°: Angstrom
HMM: High molecular mass LMM: Low molecular mass
ACVIM: American college of veterinaryinternal medicine RBP: Retinol binding protein
RPCU: Rapport protéine sur créatinine urinaires pH: potentiel hydrogène
pHi: potentiel hydrogèneisoélectrique SDS: Sodium dodecyl sulfate
Da: Dalton
EUG: European Urinalysis Guidelines TA: Température ambiante
DU : densité urinaire
ENVT: Ecole nationale vétérinaire de Toulouse CLSI: Clinical andlaboratory standardsinstitute RCF: Relative centrifugal force
IRA:insuffisance rénale aigue
G: profil électrophorétique glomérulaire T: profil électrophorétiquetubulaire M: profil électrophorétique mixte
P: profil électrophorétique physiologique
INTRODUCTION
L’analyse qualitative des protéines urinaires est une étape essentielle en néphrologie, car elle permet une détection précoce des néphropathiestantchezl’homme quechezl’animal[21, 28, 36]. Par ailleurs,la détermination dela nature des protéines urinaires par migration électrophorétiquesur gel polyacrylamidesodiumsulfate dodecyl(SDS-PAGE) ousur gel d’agarosesodiumsulfate dodécyl(SDS-AGE)chezlechienaideraità préciserlastructure rénale lésée [5, 37, 42] avec une bonne sensibilité. La migration SDS-AGE est préférée à la SDS-PAGE du fait d’une capacité supérieure à séparer les protéines de haute masse moléculaire et d’une moindretoxicité[42]. Latechnique SDS-AGE a été préalablement validée chezle chien [42] et ses propriétés analytiques (sensibilité et spécificité pouridentifier deschiens protéinuriquesselonlaclassificationIRIS(International RenalInterest Society)) [19] ont également été récemment décrites [14].
Une étude récemment dirigée parles unités de Biologie Médicale Animale et Comparée et de Médecine Interne del’Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse a mis en évidence des modifications des profils électrophorétiques des protéines urinaires (SDS-AGE) de chiens, à même de perturber l’interprétation de cet examen, lorsqu’il était réalisé sur des urines conservées à -20°C [39]. Ces modifications ont été constatées dès la première réalisation des électrophorèses sur urines congelées à -20°C, c’est-à-dire après 15jours de conservation. Ces résultats peuvent avoir des conséquencesimportantes surles schémas expérimentaux detoute étude prospective qui utiliseraitla méthode SDS-AGE pour caractériserles protéines urinaires du chien et pourrait remettre en question la validité des résultats de certaines études rétrospectives.Ilest doncimportant de pouvoir vérifiersices dernièressont objectivables lorsquela durée deconservationà-20°Cestinférieureà 15jourset d’explorercertaines hypothèses concernantl’origine de ces modifications.
I
. Le
re
in
et
l’excrét
ion
des
proté
ines
A
.
Anatom
ie
descr
ipt
ive
réna
le
Les reins sont des organes pairs situés dans la partie rétropéritonéale de l’abdomen. Ils sont appliqués contrela paroi dorsale dela cavité abdominale, en régionlombaire crâniale [10].
1
. Macrostructure
Lereinestconstitué d’unecapsulefibreuse, d’unsinus, d’untissu parenchymateux, d’un réseau vasculaire et d’un pédicule rénal.
a
. Capsu
le
f
ibreuse
La capsule fibreuse, mince et blanchâtre, entoure complètement le rein et pénètre par le hile pours’étaler danslesinusrénal. Elleestfacilement détachable du parenchymesous-jacent chez un chien sain [2, 25].
b
. S
inus
réna
l
Lesinusrénalest unecavité profondeetallongée dansle grandaxerénal.Ilcomprendle bassinet oucavité pyéliqueetles principaux vaisseauxet nerfs del’organe. De multiples orifices permettent àl’urine d’être déversée dansle bassinet [2, 25].
c
. Parenchyme
réna
l
Le parenchymerénal présente deuxzones destructures différentes bien visiblesencoupe sagittale,àsavoir:lecortex périphérique brunfoncé occupant untiers dela hauteur etla médulla rénale blanc rosée.
Figure 1 : dessin schématique del'organisation anatomique rénale [A. PITMANN (2015). Néphropathiefamiliale. Europeanfamilial nephropathyfund. ]
Le cortex contient de multiples structures coniques dont la pointe s’oriente vers la surface de l’organe,lesrayons médullaires ou partiesradiées. Chacune decesstructuresestentourée d’une substance corticale,riche en corpusculesrénaux ettubes contournés,lelabyrinthe cortical ou partie contournée. La zone danslaquelle se développent ces structures constituele cortex profond. Cette disposition disparaît près dela capsule, au niveau du cortex superficiel.
La médullaestscindéeen unerégionexterne, voisine ducortex,et unerégioninterne. Le parenchyme cortical s’engage dans la médulla et forme des travées jusqu’au sinus rénal. Ces colonnesisolent des massifs de médullaappelé pyramidesrénales(pyramides de Malpighi) qui constituentla médulla externe. Les sommets des pyramides forment un relief arrondi dans lesinusrénal,les papillesrénales. Ellesformentla médullainterneetsontcoiffées par un diverticule du bassinet appelé calice rénal [31]. Les bases des pyramides de Malpighi marquentlalimite cortico-médullaire. L’association d’une pyramide rénale et dutissu cortical correspondant formelelobe rénal [2].
Chez les carnivores domestiques, les lobes rénaux sont entièrement confondus. Les colonnes rénales n’existent plus ou sonttrèsfines. Les pyramides sontfusionnées en une couche médullaire continue.
2
. M
icrostructure
a
. Le
néphron
i. Corpuscule rénal
La partie initiale du néphron est constituée par le corpuscule rénal (Figure 2). Ce corpuscule est une sphère présentant un pôle urinaire où s’insère le tube contourné proximal et un pôle vasculaire où pénètre l’artériole afférente et d’où émerge l’artériole efférente. Il est constitué de deux parties, le glomérule qui est la partie vasculaire et la capsule de Bowman qui est la partie épithéliale.
Le glomérulerénalestformé d’uneartérioleafférente quiforme quelquesansescapillaires (lesflocules),collectéesensuite parl’artérioleefférente. Cesystème vasculaireestsoutenu par un tissu conjonctif aussi appelé mésangium car riche en cellules mésangiales à l’origine de la synthèse d’un grand nombre de molécule (enzymes, hormones et 21 cytokines, lipides bioactifs, radicaux oxygénés).
La capsule glomérulaire (capsule de Bowman), est constituée d’une couche de cellules épithéliales,les podocytes,reposantsur unelame basale qui vaformer deuxfeuillets. Le feuilletinternelongelescapillaires partageantsa lame basaleavecces derniers. Lefeuillet externe est en continuité avec le tube contourné proximal. L’espace constitué entre les deux feuillets délimitela chambre glomérulaire où s’accumulel’ultrafiltrat primitif [10, 31].
Figure 2 : dessin schématique dela structure du corpuscule rénal [31]
Il existe donc une contiguïté entre l’endothélium vasculaire, la lame basale et les podocytes. Cetensembleconstituela membranefiltrante dont lefonctionnementsera détaillé plus bas (cf. partie I. B.).
ii. Tubule rénal
La partie distale du néphroncorrespondautubulerénal. Trois partiessont distinctes:le tubule proximal qui succède au corpuscule rénal,letubule grêle etletubule distal qui sejette dans les canaux collecteurs. Les tubules proximaux et distaux sont dotés d’un tubule droit et d’untubulecontourné. L’anse de Henlécorrespondàla partiecomposée dutubule droit proximal(branche descendantelarge del’anse), dutubule grêle et dutubule droit distal (brancheascendantelarge del’anse). L’anse de Henlé dessine une boucle plus ou moins profonde dansla médulla. Cetrajet définie deuxtypes de néphrons:
- Les néphrons à anse courte (néphrons courts) : ils représentent 80 à 90% de la totalité des néphrons. Ils ont une faible capacité de réabsorption.
- Les néphrons à anselongue (néphronslongs):ils représentent 10 à 20% delatotalité.
Ils ont une capacité de filtration et de résorptionimportante. Ils participent àla constitution du gradient osmotique cortico-médullaire [6, 31].
Figure 3 : dessin schématique dela microstructure rénale [A. PITMANN (2015). Néphropathiefamiliale. Europeanfamilial nephropathyfund.]
b
.
Les
tubes
co
l
lecteurs
Lestubes collecteurs reçoiventl’urine des néphrons etla conduisent au bassinet. Chaquetube draine plusieurstubes contournés distaux et descend dansla médulla où plusieurstubes fusionnent pour donnerles conduits papillaires qui s’ouvrent dansle bassinet au sommet dela papille [10, 31].
22
B
.
Gest
ion
réna
le
des
proté
ines
1
. F
i
ltrat
ion
g
loméru
la
ire
Lafiltrationest un phénomène passif quirésulte dela différence de pression hydrostatique entre les capillaires glomérulaires et la capsule de Bowman. Au sein des capillaires glomérulaires la pression hydrostatique est élevée car elle est transmise par l’artère glomérulaire. Elle dépend de la pression artérielle systémique, des facteurs locaux tenant à la vasomotricité des artères glomérulaires afférente et efférente et dela contractilité des cellules mésangiales. Le glomérule, de parsastructure détailléeci-dessous(cf. partieI.B.1.a), va constituer une membrane filtrante.
a
. Structure
de
la
membrane
f
i
ltrante
La membrane de filtration glomérulaire possède 3 couches, ce qui lui confère des propriétés de perméabilité sélective.
Figure 4 : dessin schématique dela structure dela membranefiltrante [18] Légende:
GFR (Glomerular filtration rate) : débit de filtration glomérulaire
[Alb] : concentration en albumine
GBM (Glomerular basement membrane): membrane basale glomérulaire
ESL (Endothelial cell surfacelayer): cellules endothéliales
Qp (plasma flow rate) :taux de filtration du plasma
L’endothélium vasculaire est constitué des cellules endothéliales et d’un revêtement glycoprotidique. Lescapillaires du glomérulerénalsont detypefenestréet possèdent des pores d’environ 60 nm de diamètre, ce qui est bientrop grand pourintervenir dansla perméabilité sélective des protéines (le diamètre del’albumine étant 3.6 nm). Ala surface de l’endothélium, setrouve une couche de glycoprotéines chargée négativement d’une épaisseur d’environ 0.5 µm.
La membrane basale est un réseau de collagène detype 4, delalaminine et des glycoprotéines chargées négativement sur une épaisseur de 240-370 nm(beaucoup plus épaisse quela membrane basale d’autres endothéliums avec une épaisseur moyenne de 40-80 nm).
Les podocytes sont de larges cellules présentant de multiples longs prolongements cytoplasmiques espacés de fentes de filtrations dont la structure est semblable à des pores de rayon compris entre 35-50 A° (Angstrom). Ils participent aussi àla sélectivité detaille. Aleur surface, unecouche de glycoprotéineschargées négativement, participantàlasélectivité de charge, permet un maintien dela structure [18].
b.
F
i
ltrat
ion
g
loméru
la
ire
se
lon
la
ta
i
l
le
des
mo
lécu
les
p
lasmat
iques
La membranefiltrante possède 2types de pores visiblesen microscopieélectronique. Les fenestrations de l’endothélium vasculaire et les fentes de filtration podocytaire. La microscopie électronique a démontré quelalame basale qui séparel’endothélium capillaire de l’épithélium urinaire possède également des pores de taille nettement inférieure aux espaces décrits précédemment. Ces pores ont été évalués à un diamètre de 20 à 40 A°.
Par conséquent,les molécules protéiques de masse moléculaire supérieure à 70 kDa, appelées protéines de haute masse moléculaire(HMM),restent danslecompartimentsanguin[31]. Seules les protéines de faible masse moléculaire (LMM) passent librement le filtre glomérulaire.
Une étude a cependant montré que deux protéines de masse moléculaire équivalente ne sont pas filtrées de la même manière en fonction de leur conformation. En effet, la bikunine qui a la même masse moléculaire quel’albumine passe 80 fois plus vitela membrane filtrante. Cela serait dû à sa conformation allongée [18].
c
. F
i
ltrat
ion
g
loméru
la
ire
se
lon
la
charge
ion
ique
des
mo
lécu
les
p
lasmat
iques
La couche endothéliale etla membrane des podocytessont constituées de glycoprotéines chargées négativement favorisant le passage des molécules neutres et des cations. Les protéines circulantes sont chargées négativement, par conséquent, elles sont repoussées versla lumière vasculaire. Ces phénomènes électrostatiques sont considérés comme plus importants queles phénomènes purement mécaniques dansla filtration glomérulaire [31].
Figure 5 : dessin schématique dela structure dela membranefiltrante mettant en évidence ses différentes propriétés defiltration [18]
Légende : VEGFR1 : récepteur à l’intégrine de type1, VEGFR2 : récepteur à l’intégrine de type 2, ESF : couche dela surface endothéliale, GBM : membrane basale glomérulaire,
En résumé, 3 propriétés des protéines sont importantes pour leur passage à travers la membrane filtrante :la charge,la masse moléculaire etla conformation [18].
2
.
Gest
ion
tubu
la
ire
a
. Réabsorpt
ion
tubu
la
ire
Après fixation spécifique au niveau dela bordure en brosse des cellulestubulaires proximales, les protéines présentes danslalumièretubulaire sont absorbées par un mécanisme actif d’endocytose. Ces protéinesseretrouvent dansleslysosomes où ellessont dégradées en acides aminés, utilisésin situ ou reconduits dansla circulation sanguine.
b
. Sécrét
ion
tubu
la
ire
Les protéines plasmatiques,filtrées parle glomérule nereprésentent que 20 à 40 % des protéines urinaires physiologiques. Différentes protéinessont doncsécrétées parles voies urinairescommela mucoprotéine de Tamm-Horsfall(uromoduline), de masse moléculaire élevée, sécrétée parletube distal etlestubes collecteurs, desimmunoglobulines sécrétées par lestubes etl’épithélium rénaux ou des glycoprotéines de poids moléculaireinférieur à 30 kDa d’origine rénal et/ou urinaire.
3
. Compos
it
ion
phys
io
log
ique
des
ur
ines
Le système urinaire est destiné à éliminer les déchets organiques sous forme liquide. L’urine estinitialement un ultrafiltrat du plasma.Il est ensuite « vidé » de différentes molécules nécessairesàl’homéostasiecommeles protéines quisontréabsorbées. L’urine primitiveest ensuite « chargée » avec des ions. C’est cette urine définitive, d’osmolarité élevée (3 000mOsm/L), quiestéliminée parle basappareil urinaire. L’urineéliminée del’organisme contient donc dessubstances organiquesetinorganiquessolublesen nombreeten quantité variables retirées du sang parles reins pour maintenirl’homéostasie.
Les urines contiennent des protéines LMM (faible masse moléculaire) commeles produits du catabolisme cellulaire, unefaible concentration d’albumine et des protéines HMM(haute masse moléculaire) sécrétées par les tubules rénaux comme les mucoprotéines et les immunoglobulines. Il va donc être important de définir et caractériser une protéinurie pathologique.
II
. Proté
inur
ie
A
.
Déf
in
it
ion
La protéinuriese définit commela présence de protéines dansles urines. Elle peut être physiologique(cf. partieI.B.3.)lorsqu’elleesttransitoireet/ouinférieureà uncertainseuil. Elle est considérée comme pathologiquelorsqu’elle est persistante et supérieur à ce seuil. Une protéinurie est considérée comme physiologique lorsqu’elle est quantitativement inférieure à un seuil qui varie selonles auteurs etles méthodes de dosages utilisés: 0.640 g/L à 0.950 g/L[3] ou encore 20 mg/kg/j[15]. Cette variabilité duseuil de décisionrésulte notamment destechniques de dosages et dela variabilitéintra-individuelle.
Elle peut aussi se caractériser par une élimination de protéines qualitativement anormales. Par exemple, la protéinurie de Bence Jones se définit par la présence de ces petites protéines (22 000 à 44 000 D) qui portentle nom du médecin anglais(Henry BenceJones) quiles a découvertes. Ces protéines sont des chaineslégères d’immunoglobulines et peuvent être observées dansles urines de patients souffrant de myélome multiple.
B
.
Et
iophys
iopatho
log
ie
1
. Phys
iopatho
log
ie
Trois mécanismes principaux peuvent expliquer une augmentation pathologique de l’excrétion protéique urinaire : l’augmentation de la filtration glomérulaire, la diminution de la réabsorption tubulaire, et une élévation de la sécrétion par l’ensemble du tractus urinaire. Cestrois mécanismes peuvent s’associer.
2
.
Et
io
log
ies
des
proté
inur
ies
patho
log
iques
du
ch
ien
Un consensus nord-américain de l’ACVIM (American college of veterinary internal medecine) [24] classeles protéinuries entrois catégories: pré-rénales, rénales et post-rénales.
a
. Proté
inur
ies
pré-réna
les
La protéinurie pré-rénale fait référence à une protéinurie résultant d’une anomalie d’un appareil autre quel’appareil génito-urinaire. On parle d’une protéinurie de surcharge qui peut être d’origine tubulaire lorsque la capacité de réabsorption est dépassée ou d’origine glomérulaire par hyperprotidémie.
Cette dernière fut initialement découverte en induisant expérimentalement de fortes concentrations de protéines plasmatiques chez le chien en les administrant par voie parentérale. Lorsquelaconcentrationsérique protéiqueaugmenteet devientsupérieurà 90 g/L,la morphologie glomérulaireestaltérée,et de grandes quantités d’albumineet d’autres protéines de haute masse moléculairesontexcrétées dansles urines. Cette protéinurieest réversiblelors de rétablissement dela protidémie dansles valeurs usuelles [32].
La nature de ces protéines urinaires varie selonle processus pathologique mis en cause. Ainsi, on détecte des protéines de BenceJoneslors de myélome multiple, dulysozymelors de leucémielymphoplasmocytaire, de protéines del’inflammationlors des grandssyndromes inflammatoires (septicémie, abcès multiples, etc…), de l’hémoglobine lors d’hémolyse intravasculaire, ou encore dela myoglobinelors de rhabdomyolyse [15].
b
. Proté
inur
ies
réna
les
Les protéinuries rénales sontle plus généralement persistantes. Elles peuvent être classées en quatre catégories selon la nature du trouble sous-jacent : fonctionnelles, glomérulaires, tubulaires ouliées à uneinflammation du parenchyme rénal.
i. Fonctionnelles
Les protéinuries dites fonctionnelles seraient en partie dues à une augmentation dela pression de filtration dansle glomérule [32].
Parmi les causes possibles des protéinuries fonctionnelles, on trouve des protéinuries pathologiques (persistantes) comme la congestion passive chronique du rein lors d’insuffisance cardiaque congestive droite, de thrombose de la veine rénale et de péricardites constrictives. Lasténose del’artèrerénale,enactivantlesystèmerénine-angiotensine,etle phéochromocytome, parl’action des catécholamines, sont aussi susceptibles de provoquer des désordres hémodynamiques de nature à engendrer des protéinuries fonctionnelles [32].
Une protéinurie fonctionnelle physiologique (non persistante) peut être due à la vasoconstrictionrénalelors destress, defièvre, d’exerciceintense ou d’exposition à des températures extrêmes.
ii. Glomérulaires
La classification des lésions glomérulaires chez le chien est définie par le dernier consensus du World small animal veterinary association renal pathologyinitiative (WSAVARI) [7]. Elle s’appuiesur descritères histologiques obtenussuiteà uneanalyse descoupes de biopsies rénales par microscopie optique, microscopie électronique à transmission et immunofluorescence. Cescritères ont permis derépartirlesaffections glomérulairesen 3 groupes principaux:la glomérulosclérose segmentaire focale,l’amyloïdose rénale etles glomérulonéphrites à médiationimmune.
La glomérulosclérose segmentaire focale estla maladie glomérulairela plus fréquente chezle chien. Elle se caractérise par une atteinte des podocytes qui se fragmentent et se détachent de la membrane basale. Une hypertrophie et un remaniement des podocytes restants permettent decombleret protégerla membrane basale. Elle peutêtre primaire ousecondaireàtoute MRC(maladierénale chronique), aux glomérulonéphrites à médiationimmune et à une hypertension.
L’amyloïdose rénale estla seconde maladie glomérulaire chezle chien. Leslésions observées sont duesà un dépôt desubstanceamyloïderéactive. Elless’observentlors de diabète ou d’hypothyroïdisme[35],lors desyndromesinflammatoireschroniques(abcès, ostéomyélite, pyomètre,lupus érythémateux systémique, pyélonéphrite, etc…) ou encore de processus néoplasique(myélome multiple,lymphome).Ilexisteaussi descas d’amyloïdosefamiliale sans causeidentifiée [35].
Les glomérulonéphrites à médiationimmune sont dues au dépôt d’immuns complexes à différents niveau de la structure du glomérule. Les origines possibles de cette catégorie sont variées. Des causes infectieuses sont impliquées comme l’endocardite, la brucellose, la dirofilariose,l’ehrlichiose,laleishmaniose,le pyomètre,la borréliose outouteinfection bactérienne chronique(gingivite, pyodermite). Des affections noninfectieuses sont aussi impliquées comme des affections inflammatoires (pancréatite, prostatite, …), des maladies à médiationimmune (Lupus érythémateux systémique), …
Il existe deux sous-catégories de glomérulonéphrites à médiationimmune:
- la glomérulonéphrite membranoproliférative caractérisée par le dépôt sous-endothéliale d’immuns complexes et une hypercellularité del’endothélium
- la glomérulonéphropathie membraneuse caractérisée par le dépôt sous-épithélial d’immuns complexes et un remodelage dela membrane basale.
Leslésions glomérulaires provoquent fréquemment des protéinuries supérieures à 50 mg/kg/j et des rapports créatinine urinaire sur protéines urinaires supérieurs à 3 [17].
iii. Tubulaires
Les protéinuries tubulaires, moins fréquentes que les protéinuries glomérulaires, s’expliquent par un défaut deréabsorption des protéinesfiltrées, ou bien parlalibérationexcessive de protéines danslalumièretubulaire. Ceslésions ou dysfonctionstubulaires sont présenteslors d’intoxications(métauxlourds, éthylène glycol, antifongiquestels quel’amphotericine B, antibiotiquestels queles aminosides,lestétracyclines), de cystinurie et delysinurie, de calcinose hypercalcémique, detubuliteinfectieuse (leptospirose, cytomégalovirose) ou encore lors d’acidose rénale tubulaire. Lors de protéinurie glomérulaire persistante, les mécanismes
deréabsorptiontubulairesontinsuffisantset dufait des phénomènes decompétition, une protéinurietubulaire peut se développer.
L’analyse qualitative des protéines urinairesexcrétées permet unecertainelocalisation des lésions. Ainsi,il a été montré que, chezle chien comme chezl’homme,la protéine deliaison aurétinol(Retinol Binding Protein, RBP)etla protéine de Tamm Horsfall pouvaientêtre utilisées respectivement comme marqueurs de lésions ou dysfonctions tubulaires proximales ou distales. En effet, la RBP est normalement totalement réabsorbée par le tubule contourné proximal : sa présence dans les urines révèle une dysfonction de cette structure. La protéine de Tamm Horsfall est synthétisée uniquement par les cellules tubulaires de la portion distale du néphron et sa sécrétion est donc diminuéelors d’atteinte dutubule contourné distal [12].
iv. Inflammation du parenchyme rénal
Le parenchyme rénal peut êtrele siège d’uneinflammation provoquant une protéinurielors de tumeur rénale, detraumatisme ou de pyélonéphrite [15].
c
. Proté
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post-réna
les
La protéinurie post-glomérulaire provient dela partie dutractus génito-urinaire située aprèsle parenchyme rénal et est,le plus généralement, non persistante.
Parmiles causes des protéinuries post-rénales ontrouveles urolithiases,lesinflammations du tractus urogénital (pyomètre, prostatite, cystite bactérienne ou médicamenteuse avec les cyclophosphamides),lestraumatismes etles néoplasies (carcinometransitionnel dela vessie). Ces protéinuries sont généralement associées à un sédiment urinaire anormal pouvant refléter la cause spécifique [15, 17].
C
.
Intérêts
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pers
istante
Depuislongtempschezlechien,la miseenévidenceetlacaractérisation dela protéinurie sont considérées comme des étapes clés des démarches diagnostique et thérapeutique lors de maladie rénale [16].
La précocité du diagnostic d’une protéinurierénale persistanteest unfacteur pronostique important de l’évolution de la maladie rénale. En effet, lorsque l’excrétion protéique urinaire estimportantelors du diagnostic del’insuffisance rénale chronique,les risques de développer des crises urémiques, ainsi queletaux de mortalité sont plus élevés [20].
C’est aussi un marqueur plus précoce que d’autres variables (diminution dela densité urinaire ouaugmentation delacréatinine) dansle diagnostic des maladiesrénalessurtoutlors de glomérulopathies familiales.
Le dépistage etla caractérisation dela protéinuries’avèrent doncindispensableslors de l’établissement du diagnostic, du pronostic etlors du choix dutraitement à mettre en place. Le vétérinaire doit donc disposer d’outilsefficaces pourla détection decetteanomalie, mais aussi connaîtreleurslimites afin d’interpréter correctementles résultats obtenus.
D
.
Méthodes
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détect
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patho
log
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Parmi les méthodes de détection de la protéinurie, certaines permettent une sem i-quantification ou quantification comme la bandelette urinaire, le RPCU (rapport protéine sur créatinine urinaires) ou l’excrétion de protéines sur 24h et d’autres permettent une qualification commel’électrophorèse des protéines urinaires unidimensionnelle (cf. III.) oula biopsie rénale. Seul le RPCU, considéré comme le gold standard pour la quantification de la protéinurieen médecine vétérinaire,sera détaillé danscette partiecomptetenu del’étude expérimentale de cettethèse. Il a été établi dansla plupart des études qu’une mesure du RPCU
à partir d’unspécimen prélevéau hasardsurlajournéeest biencorréléeàla production protéique urinaire journalière chez le chien [40]. En effet, on estime que l’élimination de la créatinine parlereinestà peu prèsconstanteenraison delastabilité desaconcentration plasmatique.
L’IRIS [24] a défini des valeurs seuil considérant qu’un chien est:
o Non protéinurique sila valeur de son RPCU est strictementinférieure à 0,2. o Douteux pourtoute valeur de RPCU comprise entre 0,2 et 0,5.
o Protéinurique sila valeur de son RPCU est supérieure ou égale à 0,5.
Ces recommandations ne sont valables que pour une protéinurie rénale persistante et non pour une valeur de protéinurieisolée.
III
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L’électrophorèse unidimensionnelle des protéines urinaires permet une qualification des protéines urinaires à faible cout et immédiate (durée totale d’une électrophorèse d’environ 2-3h). C’est une méthode disponible et ne nécessitant pas un manipulateur expérimenté.
2
. Intérêt
d
iagnost
ique
Différentes études vétérinaires récentes [5, 42]incluant respectivement 49 et 70 chiens atteints de diversesaffectionsrénales, ont démontré une bonnecorrélationentreles profils électrophorétiques des protéines urinaires et la présence de lésions à l’examen histopathologique par biopsies rénales (gold standard pourla qualification d’une protéinurie). Elles ont misenévidence quelasensibilité del’électrophorèse des protéines urinaires pour prédirela présence delésions glomérulaires est de 100% et 97%,tandis que sa spécificité est de 40% et 60%. De même, elles ont montré quela sensibilité del’électrophorèse des protéines urinaires pour prédireleslésionstubulaires était de 82% et 93%,tandis que sa spécificité était de 50 et 63% respectivement, et selonl’étude.
Néanmoins,cesétudes ontconsidéré quela présence d’une bandeisoléecorrespondantà l’albumine surles profils électrophorétiques de chiens protéinuriques (RPCU>0.5) devait être secondaire à unelésion glomérulaire. Or, cette bandeisolée peut êtreretrouvée chezles
chiens non protéinuriquesavec uneintensité plusfaible, maisaussi danslecas delésion glomérulaire outubulaire débutante.
En résumé, l’électrophorèse des protéines urinaires semble avoir des performances satisfaisantes tout en étant moins invasive que la biopsie rénale. Elle offre ainsi une alternative pourle dépistage delésion glomérulaire outubulaire.
3
. Intérêt
thérapeut
ique
Les recommandations internationales [38] préconisent actuellement de traiter les chiens présentant une protéinurie glomérulaire dès lors que le RPCU est supérieur à 0.5 quelle que soitla valeur delacréatininémie.Ilest doncimportant de diagnostiquer précocementles chiens protéinuriques présentant deslésions glomérulaires. L’électrophorèse des protéines urinairesayant des performancessatisfaisantes,lerecoursàcettetechnique peutserévéler intéressant lorsque la biopsie rénale ne peut être réalisée afin de conforter l’origine glomérulaire d’une protéinurie.
B
.
Déf
in
it
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et
techn
ique
de
mesure
1
. Déf
in
it
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L’électrophorèseest unetechnique permettantla migrationetlaséparation des particules chargées en solution sous l’influence d’un champ électrique en fonction de la charge et pour des charges identiques, en fonction de leur masse moléculaire. Lors de l’étude, seule l’électrophorèse unidimensionnelle des protéines urinaires sera détaillée.
2
. Techn
iques
de
mesure
a
. Bases
phys
ico-ch
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i. Ionisation des protéines
Les protéinessont des moléculesamphotères qui possèdent desfonctionsacides(avecles groupements carboxyles) et des fonctions basiques (avec des groupements amines). Selon le pH(potentiel hydrogène) du milieu,ellessecomportentcomme unanion(charge globale négative) ou comme un cation (charge globale positive).
Il existe un pH isoélectrique (pHi) pour chaque protéine qui correspond au pH pour lequel la molécule possèdeautant decharges positives que négatives. Troiscas defiguessont donc envisageables en fonction du pH dela solution:
o pH< pHi:la protéine se comporte comme un cation o pH=pHi:la charge globale dela protéine est nulle o pH > pHi:la protéine se comporte comme un anion
Le pHi des protéines se situe entre 2.7 et 7.3. Les solutions tampons utilisées sont généralementalcalines(pHentre 7.6et 9.8). Donc,les protéinessecomportentcomme des anions etle sens de migration se fait dela cathode versl’anodelors del’électrophorèse.
ii. Migration élécrophorétique
La migration électrophorétique, qui correspond à la distance parcourue lors de l’électrophorèse par une protéine, estfonction du champ électrique appliqué(intensité et durée d’action qui sont des variables constantes) et de la mobilité électrophorétique (µ) de la protéine.
La mobilitéélectrophorétiquecorrespondàla vitesse de déplacement dela protéinesous l’effet d’un champ électrique unitaire. Elle est définie par:
µ = q/ 6rR q: charge électrique dela protéine
r: viscosité du milieu R: rayon dela particule
Donc,la migrationélectrophorétique va dépendre delachargeéléctrique dela protéine(q) ainsi que de son rayon (R),la viscosité du milieu étant constante.
b
. Protoco
le
généra
l
L’éléctrophorèse des protéines urinairessuit unschéma général quelquesoitlatechnique utilisée. Suiteau prélèvement des urines, unecentrifugationestréalisée pourl’aliquotage. Ensuite, les urines subissent une migration puis une révélation grâce à des colorants intenses comme par exemplele violet acide, qui possèdent un seuil de détection de 15 mg de protéine /bande, soit par révélation spécifique permettant la mise en évidence des dépôts de protéines obtenus. Enfin,les profils éléctrophorétiquessontlus directement et/ou parspectrométrie permettant ainsi une appréciation qualitative et semi-quantitative.
c
. Méthode
La migration électrophorétique est fonction uniquement de la masse moléculaire des protéines, elle est donc linéaire ou unidimensionnelle. Pour ce faire, deux composantes sont utiles.
Les conditions dénaturantes parinteraction aveclesolvant,le dodécylsulfate desodium (SDS) sont la première composante. Il est un détergent fort qui fait perdre aux protéines leur structure nativetridimensionnelle en se fixant par desinteractions hydrophobes (une molécule de SDS pour deux acides aminés). Des micelles chargées négativement d’une taille proportionnelle àla masse moléculaire dela protéine d’origine se forment ainsi.
Figure 6 : schéma dela dénaturation des protéines parle SDS [N.OSWALD (2008). How SDS-PAGE works. Protein analysis, detection and assay.]
Les gels réticulés, ayant des pores calibrés, ajoutent un effet de tamisage moléculaire à celui dela migrationélectrophorétique.Ilsfreinentles molécules d’autant plus queleur masse moléculaire est élevée. Il existe différentstypes de gels:
o SDS-PAGE qui utilise un gel polyacrylamide constitué delongues chaînes formées de monomères acrylamide unis par des pontages. La viscosité du milieu, sa densité et son élasticité sont fonction dela dimension des mailles du réseau et sont doncinversement proportionnelles au nombre de pontages. Le gel est doncformé d’un gradient de polyacrylamide aux mailles de plus en plus serrées.
Ce gel est peu utilisé en pratique car la séparation des différentes protéines n’est pas très fine etle gel a des effetstoxiques potentiels [42].
o SDS-AGE qui utilise un gel d’agaroseformé delongueschaines oùalternent deux monomères(βD galactoseet 3-6anhydro-αL-galactose). Ceschainessont unies par des ponts hydrogène. La concentration en monomères augmente en continu dans l’étalement en couche mince et engendre un gradient de porosité.
Les gelsréticulés possèdent donc des pores calibrés qui créent un gradient de porosité, freinant ainsiles micelles d’autant plus qu’elles sont de haut poids moléculaire.
C
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Interprétat
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L’interprétation est fondée sur la présence ou l’absence de bande qui représente une quantité de protéines d’une masse moléculaire donnée.
Pour calibrerles masses moléculaires et permettreles comparaisons, un mélange de quelques protéines de masses moléculairesconnues,aussiappelé marqueur moléculaire,estsoumis dansles mêmes conditions, àla migration. Le marqueur moléculaire regroupelelysozyme de 14.3 kDa (kilo Dalton), la tri-phosphate isomérase de 26.6 kDa, l’albumine bovine de 66kDa et l’immunoglobine G humaine de 150 kDa. Il permet d’avoir une échelle de masse moléculaireconnue dontsacomparaisonavecles profils de migration permet d’estimerles masses moléculaires des protéines contenues dansles urinestestées.
Uneinterprétation qualitative pourl’évaluation delataille des différentes protéines présentes dans les urines est possible, permettant éventuellement de préciser la possible origine glomérulaire et/outubulaire dela protéinurie.
Pour rappel, une atteinte glomérulaire engendre une augmentation de l’excrétion urinaire de protéines de masse moléculairesupérieure ouégaleàla masse moléculaire del’albumine (68kDa),aussiappeléesles protéines HMM. Surles profilsélectrophorétiques, uneatteinte glomérulaire se traduit donc par une ou plusieurs bandes au niveau ou en dessous de l’albumine. De la même façon, une atteinte tubulaire engendre une augmentation de l’excrétion urinaire des protéines LMM (masse moléculaireinférieure à 68kDa) qui setraduit par une ou plusieurs bandes au-dessus de l’albumine sur les profils électrophorétiques. Lorsque l’atteinte est glomérulaire et tubulaire, elle se traduit par un profil électrophorétique mixteavec des bandes de protéines HMMet LMM(Figure 7). Un profilélectrophorétique n’ayant qu’une bande d’albumine ou aucune bande est considéré comme physiologique.
Figure 7 : SDS-AGE du spécimen PROCON 20 del'étude présentantl'interprétation possible d’un profil électrophorétique
Lysozyme (14.3 kDa)
Tri-phosphateisomérase (26.6 kDa) Albumine bovine (66 kDa)
Immunoglobuline G humaine (150 kDa)
Protéines LMM d’originetubulaire
Protéines HMM d’origine glomérulaire
Cette technique permet aussi une évaluation semi-quantitative grâce à l’intensité de la coloration des différentes bandes qui est proportionnelle àla quantité de protéines. Cette évaluation peut être visuelle ou par spectrométrie mais cette dernière n’est pas recommandée et semble peu fiable pourles protéines urinaires.
2
. Facteurs
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i. Méthode de prélèvement
Les urines peuventêtrerécoltées parcystocentèse, par mictionspontanée ou parsondage (cathétérisation del’urètre).
Le prélèvement par miction spontanée estla seule méthodetotalement atraumatique [30] mais elle comporte de nombreuxinconvénients. Notamment, elle exposele prélèvement à une contamination par le bas appareil urinaire, l’appareil génital et la peau. On peut donc potentiellementretrouverla présence de débriscellulaires voire de bactérieset decellules inflammatoires dansle spécimenrécolté[21]. De plus,l’urine n’est pas de composition homogènetout aulong dela miction.
Le prélèvement parcathétérisme del’urètre peutêtre nécessaire pour un diagnostic ou une thérapie (syndrome urinaire félin). Il présente l’inconvénient majeur de modifier la composition urinaire à cause de microtraumatismesinduits parle cathétérisme (d’oùla présence de sang et de cellules à la cytologie urinaire), sans oublier que les lésions causées à l’urothélium associées à un non-respect des règles strictes d’asepsie sont une cause fréquente d’infections dutractus urinaire bactérienne (20% de risque chez la femelle) [11]. Cette technique estla plus chère [31].
Le prélèvement par cystocentèse permet d’obtenir des urines stériles (à condition de respecter les règles d’asepsie). Cependant, Il existe quelques contre-indications à la réalisation de cette méthode:lors de distension anormale dela vessie [9], une vessietrop petite ou une chirurgie
récente dela vessie. Les urines prélevéessontfréquemmentcontaminées par dusang, d’où une hématurie microscopique liée à la méthode de prélèvement [27] qui pourrait néanmoins induire une augmentation dela quantité de protéines.
Cependant, peu de données sur l’influence du mode de prélèvement des urines sur les profils électrophorétiques n’ontétérépertoriéesen médecine humaine ou vétérinaire. Lechoix du mode de prélèvement des urines dans notre protocole n’a donc pas été motivé parl’influence possible surl’électrophorèse mais pour s’affranchir de contamination du prélèvement par des cellules du bas appareil urinaire.
ii. Moment du prélèvement
En médecine humaine,il est décrit quel’excrétion protéique varie de 100 à 500% au cours de lajournéeet dépend de différentsfacteurscommela prise de boisson,letaux defiltration glomérulaire,l’exercice,le repos etle régime alimentaire [34].
Il semble donc préférable de préleverles urines du matin, ce qui permet de s’affranchir d’une dilution occasionnée par une consommation d’eauimportante au cours delajournée [27].
iii. Variation àla préparation des urines
D’aprèsl’EUG (European Urinalysis Guidelines) et une étude récente [23],il est conseillé de centrifugerles urines àfaible vitesse(1000 à 1500g) afin d’éviterla présence de débris cellulaires et ainsi prévenirle développement de bactéries et une modification du profil protéique del’urine.
Une autre étude récente [42] préconisela dilution des urines dontla protéinurie est supérieure à 2000mg/L avec del’eau distillée ou du NaCl 0.9%. En effet,la méthode de colorimétrie est linéairejusqu’àceseuil,au-delàlalecture du profiletla distinction des différentes bandes deviennent difficiles.
Enfin,ilestconseillé de mesurerla densité urinaire duspécimen prélevécarla proportion d’apparition de bandessur un profil dechiensainestsignificativement(p= 0,0049) plus fréquente avec des urines concentrées qu’avec des urines non concentrées [14].
iv. Stockage et délai d’analyse
L’exposition des urines àlatempérature ambiante sur une durée de 0, 4, 8 et 24h n’affecte pas lastabilité du profilélectrophorétique des protéines urinaires[23]. De mêmela quantité de protéine n’est pas altérée àtempérature ambiante sur 24h.
Uneautreétudea montré quel’urine ne doit pasêtreconservée plus de 8hàtempérature ambiante par risque d’une augmentation de la contamination bactérienne et qu’il est préférable dela conserver à 4°C entre son prélèvement etla réalisation del’électrophorèse. Sur une durée pluslongue, une récente étude vétérinaire a étudiéles modifications des profils électrophorétiques SDS-AGE des protéines urinaires conservées àtempérature ambiante, 4°C, -20°C et -80°C. A -20°C, à partir de 15 jours, une bande de haut poids moléculaire apparait ouestrenforcée dans 65% deschiens protéinuriques maisaussi dans 60% deschiens non protéinuriques. Cependant,les profils obtenus pourles urinesconservéesjusqu’à 5joursà température ambiante et à 4°Cne semblent pas altérés. Enfin, cette étude a montré l’absence de modification du profillors de stockage à -80°C [39].
Par ailleurs, l’exposition à 2 cycles de congélation (-80°C)/décongélation (température ambiante), n’a pas démontré d’effet notable surl’interprétation qualitative des profils [23].
b
. L
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i. Le sexe
Différentes études rapportent que chezle chien,il n’existe pas de différence significative dela concentrationen protéines urinairesenfonction dusexe,sile prélèvementesteffectué par sondage oucystocentèse. Parailleurs,l’excrétion protéique urinaireestsupérieurechezle mâle sile prélèvement est effectué par miction [3, 15, 41].
Uneétude préliminairerécentesur 20chiensadultessains(RPCU<0.3) dontles urines ont subi une SDS AGE, a montré une différence qualitative du profil électrophorétique des
protéines urinairesenfonction dusexe. Eneffet, une bande defaibleintensitéet defaible masse moléculaire n’est visible que chezles chiens males entierslégèrement en dessous dela tri-phosphate isomérase (26.6 kDa) avec ou sans spermatozoïdes visibles à l’analyse cytologique du culot urinaire. Cette étude suggère que cette bande soit due à une contamination séminale et non à une atteintetubulaire [33].
Figure 8 : gel électrophorétique de PROCON 13 J5 mettant en évidencela bande spermatique
ii. Protéinurie fonctionnelle
De nombreux facteurs physiologiques et environnementaux influencent l’excrétion de protéines dans l’urine créant ainsi une protéinurie physiologique transitoire et ne correspond pas à une affectionrénale. Elle peut avoirlieulors d’exercice physiqueintense[13], de déshydratation importante, d’hématurie si le volume de sang est supérieur à 10% du volume urinairetotal [1], detempérature extérieure élevée ou encore de stress [9].
Par conséquent, sile prélèvement unique àlieulors de ce genre de situation, on peut avoir une protéinurieinterprétée àtort comme pathologique. L’évaluationsur 24 heures permet de
limiter ces erreurs d’interprétation. La protéinurie détectée aura donc moins de chance d’être d’origine physiologique.
Bien qu’aucune donnéeactuelle nesoit disponible, on pourraitsupposer qu’une protéinurie fonctionnelle puisse perturberl’interprétation d’un profil électrophorétique.
3
. Facteurs
de
var
iat
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ana
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iques
Parmi les facteurs de variations analytiques non spécifiques de l’électrophorèse des protéines urinaires SDS-AGE, on retrouve classiquement la température ambiante du laboratoire, ainsi quelesinstruments,lelot deréactifetle manipulateur. Eneffet,ce dernier paramètreest important puisquela préparation des gelsinclusla manipulation de petits volumes (5µL).
Certains facteurs de variations analytiques plus spécifiques sont à prendre en compte. Lors de la réalisation des électrophorèsesil estimportant de sélectionnerle mode de migration spécifique aux protéines urinaires. En effet, sila vitesse de migration esttrop élevée,il y aura une mauvaiseséparation des protéines etinversement,sila vitesse de migration esttrop faible,les protéines onttendance à diffuserlatéralement surle gel.
La coloration est aussitrèsimportante pourlalecture des profils. La préparation d’un colorant permet de réaliser dix gels par SDS-AGE et au fil des électrophorèses, la coloration devient moins intense. Ceci peut diminuer la sensibilité de l’électrophorèse puisque certaines bandes de faibleintensité seront moins visibles ou ne seront pas révélées parla coloration.
I
. Contexte
Cette partie expérimentale permet de préciser les résultats de l’étude de THERON et collaborateurs [39] dans laquelle une modification du profil électrophorétique suite à une conservation des urines à -20°C pendant 15 jours a été mise en évidence. L’apparition ou le renforcement d’une bande de haute masse moléculaire (Figure 9) est notée en comparaison avecle profil électrophorétique obtenuimmédiatement aprèsle prélèvement.
Figure 9 : Résultats del’étude THERON et collaborateurs [39]
En pratique vétérinaire,les électrophorèses des protéines urinaires sont souvent réalisées dans un second temps, suite au diagnostic d’une protéinurie rénale persistante, afin de préciser la localisation de la lésion, adapter le traitement et permettre de réaliser un suivi adapté. Les urines peuvent donc être conservées pour une durée variable à -20°C ou à 4°C avant la réalisation de cette électrophorèse,letemps de déterminerle RPCU.
J0 J15 Marqueur moléculaire
-20°C -80°C
Modification du profil à -20°C par rapport à J0
Par ailleurs, en cas d’étude rétrospective et pour prévoirle protocole d’une étude prospective, il estimportant de maitriserles facteurs de variations pré analytiques.
Cette étude expérimentale a pour but de préciserles modifications du profillors d’une conservation des urines à -20°C en abordant différents points:
- la durée minimale deconservation des urinesà-20°Caprèslaquelle on peut voir apparaitre ces modifications
- l’influence dela nature dutube dansl’apparition des modifications.
II
. Etude
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L’étude préliminaire observationnelle a pour objectif d’évaluer:
- l’effet d’une durée courte de stockage des urines à -20°C sur l’interprétation de SDS-AGE urinaire de chiens protéinuriques en comparant des profils obtenus après conservation des urines à -20°C à J5 et J15 par rapport au profil obtenu à J0.
- l’influence de la nature du tube choisi pour la conservation des urines sur l’interprétation de SDS-AGE urinaire de chiens protéinuriques en comparant des profils obtenusaprèsconservation des urines à -20°CàJ5etJ15 parrapportàJ0. Cette étude sefait en 2temps avecla comparaison de profils électrophorétiques obtenussur urines conservées dans destubes Eppendorf classiques® et des tubes Nunc Cryotubes® puisla comparaison des profils obtenus à partir de spécimens conservés dans des tubes Eppendorf classiques® et des tubes Eppendorf Protein Lobind®.
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Les animaux sont inclus uniquement après complète information du propriétaire et la signature du « Formulaire de consentement éclairé » (Annexe 1).
Tout chien présenté en consultation àl’ENVT(Ecole nationale vétérinaire de Toulouse) nécessitant pour raison médicale (investigation d’une maladie rénale ou avec potentielle implicationrénale)laréalisation d’uneanalyse d’urinecomplèteetl’évaluation du RPCU peut êtreinclus dansl’étude.
Chaque animalinclus dansl'étude a une fiche d'accompagnement de prélèvement (surlaquelle est inscritle nom du propriétaire, son nom d’usage, son numéro d'identification ENVT et son numéro d’identification pourl'étude) et une fiche d'analyse (surlaquelle n’est mentionnée que son numéro d'étude) visibles en annexes 2, 3 et 4.
Dans le cadre de la phase 1 comparant les tubes Eppendorf classiques® et les Nunc Cryotubes®,les chiens sontidentifiés dela façon suivante; « de CONG 1 à CONG X ». Pour préserverl'anonymat, seull’identification del'étude est présente surles résultats d'analyses. Dans le cadre de la phase 2 comparant les Eppendorf classiques ® et les Eppendorf Protein Lobind ®,les chiens sontidentifiés dela façon suivante; « de EP PROCON1 à EP PROCON X ». Pour préserverl'anonymat,seull’identification del'étudeest présentesurlesrésultats d'analyses.
b
. Cr
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Aucuncritère d’exclusioninitiale n’estétabli. Plusieurscritères d’exclusionaulaboratoire sont définis :
- présence d’un sédiment urinaireinflammatoire (nombre de cellulesinflammatoires par champ > 5)
- présence d’une bactériurie
- présence d’une protéinurie quantitative àl’inclusion < 500 mg/L - présence d’un RPCUinitial < 0,2
- présence d’un RPCU initial compris entre 0.2 et 0.5 associé à une protéinurie < 800 mg/L.
2
. Etapes
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a
. Pré
lèvements
ur
ina
ires
Le prélèvement urinaire est effectué par cystocentèse échoguidée par Le Dr V. Fabres ou L. Quignon, étudiante en 5ème année, sousla supervision d’un Dr vétérinaire, au sein del’ENVT. En effet, bien que le RPCU ne soit que minimalement affecté parle mode de récupération en
cas d’absence deinflammation[4],le prélèvement parcystocentèse permet des’affranchir d’une contamination parle bas appareil urinaire etl’appareil génital.
Pour chaque chien, un volumetotal de 6 mL minimum d’urine est collecté.
b
. Etapes
pré
l
im
ina
ires
i. Bandelette urinaire
Uneanalysechimique urinaireestréalisée pourchaqueanimal,au moyen d’une bandelette urinaire (Urine Reagent Strip for urinalysis URS-10, Teco Diagnostics, Anaheim CA, USA) dontles résultats sont reportés dansla fiche analytique (Annexes 3 et 4) de chaqueindividu.
ii. Densité urinaire (DU)
Une goutte d’urine est déposée sur la zone de lecture du réfractomètre optique Atago T2-NE (Atago Co. Ltd., Tokyo,Japan)avantlacentrifugationafin de permettrela mesure dela densité urinaire. La valeur obtenue est consignée dansla fiche analytique (Annexes 3 et 4).
c
. Conservat
ion
des
ur
ines
Dansla périodeimmédiate suivantla récupération,les urines sont conservées dansla seringue plastique de 10 mL puis portées au Laboratoire Central de l’ENVT accompagnées du consentement éclairé (Annexe 1) et des fiches de prélèvement et d’analyse (Annexes 2, 3 et 4). Les urines collectées par cystocentèse sont alorstransférées dans destubes à fond conique. Ces derniers sont pré-identifiés par le numéro « CONG X » pour l’étude comparant les tubes Eppendorfclassiques®etles Nunc Cryotubes®et parle numéro « EPPROCON X » pour l’étude comparantlestubes Eppendorf classiques® etlestubes Eppendorf Protein Lobind®.
Un délai maximal de deux heures est respecté entre collecte et analyse ainsi que recommandé par le CLSI (Clinical andlaboratory standrardsinstitute) [8]. Danstousles cas,le délaile plus court possible est recherché.
