Rôle des anomalies de TET2 dans la transformation tumorale lymphoïde et myéloïde

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Rôle des anomalies de TET2 dans la transformation

tumorale lymphoïde et myéloïde

Lucile Couronné

To cite this version:

Lucile Couronné. Rôle des anomalies de TET2 dans la transformation tumorale lymphoïde et myéloïde. Sciences agricoles. Université Paris Sud - Paris XI, 2012. Français. �NNT : 2012PA11T059�. �tel-00766575�

1

UNIVERSITƒ PARIS XI

FACULTƒ DE MƒDECINE PARIS-SUD

2012

N¡É..

THéSE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE LÕUNIVERSITƒ PARIS XI

Ecole doctorale : CancŽrologie, Biologie, MŽdecine, SantŽ

Champ disciplinaire : Biologie cellulaire et molŽculaire

PrŽsentŽe et soutenue publiquement par

Lucile COURONNƒ

Le 15 octobre 2012

R™le des anomalies de TET2

dans la transformation tumorale lympho•de et myŽlo•de

Directeur de thse : Dr Olivier BERNARD

JURY

PrŽsident : Pr Eric SOLARY

Rapporteur : Pr Karen LEROY

Rapporteur : Dr Jean-Pierre DE VILLARTAY

Examinateur : Pr Philippe GAULARD

Examinateur : Dr Christian BASTARD

Directeur de thse : Dr Olivier BERNARD

2

Mes sincres remerciements

A Olivier, mon directeur de thse, qui mÕa guidŽe tout au long de ces trois

annŽes passŽes ensemble, mÕa appris la rigueur du raisonnement scientifique, mÕa

aidŽe ˆ concrŽtiser mon projet professionnel et peut tre le plus important, mÕa

donnŽ envie de continuer la recherche, ici ou ailleurs É

Aux membres de mon Jury,

A Monsieur le Professeur Eric Solary pour avoir acceptŽ dÕen tre le prŽsident,

A mes rapporteurs, Madame le Professeur Karen Leroy et Monsieur le

Docteur Jean-Pierre De Villartay, pour avoir lu avec attention mon travail de thse et

mÕavoir donnŽ de prŽcieux conseils,

A Monsieur le Professeur Philippe Gaulard qui mÕa fait partager son

expŽrience et ses connaissances dans le domaine si complexe des lymphomes,

A Monsieur le Docteur Christian Bastard, qui me conna”t depuis que je suis

Ç toute petite È et reprŽsente tout lÕattachement que je porte ˆ Rouen, en particulier ˆ

lՎquipe du centre Henri Becquerel. Merci de mÕavoir fait dŽcouvrir le monde de la

biologie molŽculaire et de lÕoncogŽnŽtique et de mÕavoir ainsi mis un pied ˆ lՎtrier !

Pour continuer sur les Rouennais, un grand merci ˆ Messieurs les

Professeurs HervŽ Tilly et Fabrice Jardin ainsi quÕau Docteur Philippe Ruminy, qui

chacun ˆ leur faon, mÕon fait apprŽcier et aimer lÕhŽmatologie adulteÉ ce qui nՎtait

pas gagnŽ pour une pŽdiatre !

Je remercie Žgalement chaleureusement toutes les personnes qui mÕont

accompagnŽe dans cette aventure depuis deux ans,

Tout dÕabord les Docteurs Virginie PŽnard-Lacronique et Thomas Mercher

pour leurs conseils avisŽs. Thomas, je mÕexcuse pour toutes les fois o je suis venue

te poser des questions mais cÕest un peu de ta faute, tu as toujours rŽponse ˆ tout !

Les locataires du Ç bureau des Žtudiants È, Vinciane, Paola, Clarisse,

Frederik, Elena et Cyril, et aussi SŽbastien : merci pour tous les bons moments

passŽs ensemble et dŽsolŽe pour mes Ç r‰leries È concernant le mŽnage et le

rangement du labo !

3

Enfin les filles de lÕ Ç aquarium È : CŽcile pour tes raccourcis dans les

protocoles, ta bonne humeur communicative, et surtout ton rire reconnaissable entre

tous , Laurianne, ma Ç petite sÏur È de thse pour ton aide au quotidien et toutes

nos discussions au dessus des planches ˆ dissection, et bien sžr VŽronique,

toujours lˆ, toujours disponible, merci de mÕavoir ŽpaulŽe, ŽcoutŽe, rŽconfortŽe

parfois, bref dÕavoir veillŽ sur moi tout au long de ces annŽes.

Un dernier mot pour mes proches,

Tout dÕabord mes parents, pour leur soutien indŽfectibleÉ Aprs la pŽdiatrie,

cÕest finalement lÕhŽmatologie ; aprs la clinique, cÕest recherche ˆ plein temps

pendant 3 ans ; une thse jÕen ai dŽjˆ une mais jÕen veux une deuxime É Pas

toujours facile de me suivre ! Merci pour avoir toujours respectŽ mes choix

personnels et professionnels. JÕespre vous avoir rendu fiersÉ

Enfin je remercie Franois, mon marathonien de cÏur et dÕesprit, qui mÕa

appris lÕimportance de ne pas partir trop vite pour ne pas sÕessouffler en chemin,

dÕattendre le bon moment pour attaquer mais aussi de savoir Ç sprinter È quand la

ligne dÕarrivŽe est en vue. Avec toi, pas besoin de Ç cardio È ni de GPS, je te suis les

yeux fermŽs Éet mme jusquՈ New York !

4

SOMMAIRE

1. INTRODUCTION ... 1

1.1. HŽmatopo•se ... 1

1.2. HŽmopathies myŽlo•des ... 2

1.2.1. Classification ... 2

1.2.2. Mutations du gne TET2 dans les hŽmopathies myŽlo•des ... 4

1.2.2.1. FrŽquences des mutations TET2 dans les hŽmopathies myŽlo•des .... 4

1.2.2.2. CaractŽristiques cliniques et biologiques associŽes aux mutations

TET2 ... 5

1.2.2.3. CaractŽristiques cytogŽnŽtiques et molŽculaires associŽes aux

mutations TET2 ... 6

1.2.2.4. Impact pronostique des mutations TET2 ... 8

1.3. HŽmopathies lympho•des ... 9

1.3.1. Classification et gŽnŽralitŽs ... 9

1.3.2. Description des principaux PTCL ...11

1.3.2.1. ALCL ... 11

1.3.2.1.1

ALCL ALK+ ... 11

1.3.2.1.2

ALCL ALK- ... 12

1.3.2.2. AITL ... 13

1.3.2.2.1

Aspects clinico-biologiques ... 13

1.3.2.2.2

Aspects histologiques et cytogŽnŽtiques ... 13

1.3.2.2.3

La cellule tumorale dÕAITL ... 13

1.3.2.3. PTCL, NOS ... 14

1.3.2.3.1

Aspects clinico-biologiques ... 14

1.3.2.3.2

Aspects histologiques et cytogŽnŽtiques ... 15

1.3.2.3.3

La cellule tumorale de PTCL, NOS ... 16

1.4. ProtŽines TET ...17

1.4.1. Structure des protŽines TET ...17

1.4.2. Fonction des protŽines TET : lÕhydroxylation des mŽthylcytosines ...18

1.4.3. R™le des protŽines Tet dans les cellules ES murines ...20

1.4.3.1. R™le de Tet1 dans les cellules ES murines ... 20

1.4.3.2. R™le de Tet2 dans les cellules ES murines ... 24

1.4.4. R™le de Tet3 dans le zygote ...25

1.4.5. R™le de TET2 dans lÕhŽmatopo•se ...27

1.4.5.1. Expression des Tet au cours de lÕhŽmatopo•se murine ... 27

1.4.5.2. Analyse in vitro par des approches de RNA interfŽrence ... 28

1.4.5.3. Analyse in vivo par des modles murins dÕinvalidation de Tet2 ... 28

1.4.5.4. ConsŽquences des mutations TET2 chez les patients ... 30

1.5. DNMT3A ...31

1.5.1. Mutations du gne DNMT3A dans les hŽmopathies myŽlo•des ...32

1.5.1.1. Description des mutations DNMT3A ... 32

1.5.1.2. ConsŽquences des mutations DNMT3A ... 32

1.5.2. R™le de Dnmt3a dans lÕhŽmatopo•se ...33

1.5.3. ConsŽquences de la mŽthylation dnmt3a-dŽpendante sur l'expression des

gnes ...35

5

2. OBJECTIFS ...37

3. RESULTATS ...38

3.1. Article 1 : Analyses of TET2 mutations in post myeloproliferative neoplasm

acute myeloid leukemias ...38

3.2. Article 2 : TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities

in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis...43

3.2.1. LÕinactivation de Tet2 entra”ne des anomalies de lÕhŽmatopo•se chez la

souris ...43

3.2.2. LÕinactivation de TET2 constitue un ŽvŽnement rŽcurrent durant la

lymphomagense humaine ...44

3.3. Article 3 : Recurrent TET2 mutations in peripheral T-Cell lymphoma correlate

with TFH-like features and adverse clinical parameters ...79

3.4. Article 4 : TET2 and DNMT3A mutations in human T-cell lymphoma ...91

4. DISCUSSION ET PERSPECTIVES ...101

4.1. Implication de la CSH au cours de la pathogense des hŽmopathies

lympho•des ...101

4.1.1. CSH et LLC ...101

4.1.2. CSH et lymphomes ...103

4.1.3. Gnes mutŽs dans les hŽmopathies myŽlo•des et lympho•des ...104

4.2. HŽtŽrogŽnŽitŽ tumorale ...105

4.2.1. HŽtŽrogŽnŽitŽ intratumorale ...105

4.2.2. HŽtŽrogŽnŽitŽ intertumorale ...107

4.3. Poursuite du travail ...107

4.3.1. ModŽlisation du processus de lymphomagense in vivo ...107

4.3.2. ModŽlisation de la coopŽration oncogŽnique TET2-DNMT3A ...109

4.3.3. Analyse du r™le de Tet2 dans la diffŽrenciation lympho•de ...110

4.4. Identification des mutations de TET2 chez les patients : perspectives ...110

4.4.1. Perspectives diagnostiques ...110

4.4.2. Perspectives thŽrapeutiques ...110

4.4.3. Association des mutations TET2, IDH2 et DNMT3A ...111

5. CONCLUSION ...114

1

ABRƒVIATIONS

a.a : acide aminŽ

ChIP-seq : Chromatin ImmunoPrecipitation-sequencing EBV : Epstein-Barr Virus

EFS : event-free survival

IGH : cha”ne lourde dÕimmunoglobuline Kb : kilobase

KO : knock out

LDH : lactate dŽshydrogŽnase OS : overall survival

PCR : polymerase chain reaction PFS : progression-free survival RC : rŽmission complte Sh RNA : small hairpin RNA Si RNA : small interfering RNA TCR : T-cell receptor

1. INTRODUCTION

1.1. HŽmatopo•se

LÕhŽmatopo•se se dŽfinit p constante et rŽgulŽe des diffŽrent faon hiŽrarchique qui, ˆ partir de engendre des progŽniteurs, des Selon le modle Ç classique myŽlo•de dÕautre part se dŽvelopp (Figure 1, modle A).1 Depuis, souris, tels que le progŽniteur LM diffŽrencier en progŽniteurs lymp granulocytes-macrophages (GMP Žgalement ŽtŽ proposŽes en parti directement dÕune cellule souche h

Figure 1 : Modles de diffŽrenciation A : Modle classique. B et C : Modle LT-HSC : long-term hematopoietic s multipotent progenitor; LMPP : lym progenitor; CMP : common myeloid megakaryocyte/erythroid progenitor; B

e dŽfinit par lÕensemble des mŽcanismes qui assuren s diffŽrentes cellules sanguines. Elle constitue un sys ˆ partir des cellules souches hŽmatopo•Žtiques (CSH) teurs, des prŽcurseurs et enfin des cellules diffŽrenc

ssique È de diffŽrenciation, les lignages lympho•de e dŽveloppent ˆ partir dÕun mme progŽniteur dit

Depuis, dÕautres types de progŽniteurs ont ŽtŽ ide gŽniteur LMPP (lymphoid-myeloid prime progenitor) c iteurs lymphoides communs (CLP) mais aussi en pro ges (GMP) (Figure 1, modle B).2,3 Des voies al es en particulier pour la lignŽe mŽgacaryocytaire qui p le souche hŽmatopo•Žtique (Figure 1, modle B).4

Žrenciation hŽmatopo•Žtique.3 : Modles alternatifs.

topoietic stem cell; ST-HSC : short-term hematopoietic s PP : lymphoid primed multipotent progenitor; CLP : co n myeloid progenitor; GMP : granulocyte/macrophage pro rogenitor; B : B-cell; T : T-cell.

1

ui assurent la production itue un systme dŽcrit de ues (CSH) multipotentes, s diffŽrenciŽes matures. lympho•de dÕune part et dit multipotent (MPP) nt ŽtŽ identifiŽs chez la rogenitor) capable de se ussi en progŽniteurs des s voies alternatives ont ytaire qui pourrait dŽriver

topoietic stem cell; MPP : CLP : common lymphoid ophage progenitor; MkEP :

2

Les mŽcanismes contr™lant les fonctions des CSH et l'Žquilibre entre diffŽrenciation et autorenouvellement font intervenir de nombreux facteurs de transcription, des facteurs de croissance et Žgalement le microenvironnement des CSH. De nombreux gnes mutŽs ou remaniŽs au cours des processus tumoraux codent pour des protŽines qui participent au contr™le de la diffŽrenciation hŽmatopo•Žtique normale. Une des approches pour dŽcouvrir de nouveaux gnes dont les produits sont impliquŽs dans le contr™le de lÕhŽmatopo•se normale et pathologique, consiste donc en lÕanalyse du gŽnome des cellules tumorales des hŽmopathies malignes.

1.2. HŽmopathies myŽlo•des

1.2.1. Classification

Les hŽmopathies malignes humaines se rŽpartissent en deux groupes, selon la voie de diffŽrenciation qui est affectŽe : les hŽmopathies myŽlo•des dÕune part et les hŽmopathies lympho•des dÕautre part. Au sein des pathologies myŽlo•des, la classification 2008 de lÕOrganisation Mondiale de la SantŽ (OMS) distingue les leucŽmies aigu‘s myŽlo•des (LAM), les syndromes myŽlodysplasiques (SMD), les syndromes myŽloprolifŽratifs (SMP), les formes Ç frontires È myŽlodysplasiques-myŽloprolifŽratives (SMD / SMP) qui comprennent les leucŽmies myŽlomonocytaires chroniques (LMMC) et les hŽmopathies myŽlo•des associŽes ˆ une Žosinophilie.5

Selon lÕOMS, les LAM se dŽfinissent par la prŽsence de plus de 20% de blastes dans la moelle osseuse. Ces entitŽs se caractŽrisent par une prolifŽration et un blocage de la diffŽrenciation. Elles proviennent de la transformation dÕun progŽniteur myŽlo•de ou dÕune CSH. On distingue les LAM de novo des LAM secondaires se dŽveloppant ˆ la suite dÕun traitement ou correspondant ˆ des transformations de SMP ou de SMD. Six groupes ont ŽtŽ individualisŽs : les LAM avec anomalies gŽnŽtiques rŽcurrentes (rŽarrangements des gnes RUNX1, CBFB, RARA, MLL, mutations de NPM1, CEBPA), les LAM avec dysplasie multilignŽe, les LAM post chimiothŽrapies, les prolifŽrations myŽlo•des associŽes au syndrome de Down (trisomie 21), les leucŽmies ˆ cellules dendritiques et des LAM Ç non classŽes È qui comprennent en particulier certaines ŽrythroleucŽmies et leucŽmies aigu‘s

mŽgacaryoblastiques.6

Le groupe hŽtŽrogne des SMD est considŽrŽ comme dŽrivant d'une anomalie clonale de la CSH qui entra”ne une dysplasie dÕune ou plusieurs lignŽes associŽe ˆ une apoptose intramŽdullaire.7 Une cytopŽnie pŽriphŽrique est observŽe du fait de lÕinefficacitŽ de lÕhŽmatopo•se. Certaines anomalies molŽculaires ont ŽtŽ dŽcrites dans les SMD, soit associŽes ˆ certains sous-types (5q-) soit ˆ la transformation aigu‘ (mutations de RUNX1,

3

N-RAS, JAK2, KIT).8Hormis les mutations de gnes dont les produits interviennent dans la rŽgulation ŽpigŽnŽtique de la structure chromatinienne et que je prŽsenterai plus loin, il a ŽtŽ rapportŽ trs rŽcemment un nouveau groupe de mutations affectant les gnes codant pour

des protŽines du complexe du spliceosome (SF3B1, SRSF2, ZRSR2, U2AF1, U2AF35

)

mutations sont observŽes chez environ 35 ˆ 40% des patients atteints de SMD.9-13

Les SMP rŽsultent de lÕexpansion clonale d'un progŽniteur myŽlo•de avec une relative prŽservation de la diffŽrenciation et regroupent : les leucŽmies myŽlo•des chroniques (LMC), les polyglobulies primitives (PV), les thrombocytŽmies essentielles (TE) et les splŽnomŽgalies myŽlo•des ou myŽlofibroses primitives (MFP).

Les LMC sont dŽfinies par le chromosome Philadelphie qui rŽsulte dÕune translocation t(9;22)(q34;q11). Cette translocation fusionne les gnes BCR et ABL114 et aboutit ˆ lÕactivation constitutive de lÕactivitŽ tyrosine kinase dÕABL1.15

Les PV, TE et MFP sont les trois principaux SMP BCR-ABL1 nŽgatifs. Des mutations activatrices du gne JAK2 sont observŽes dans la majoritŽ de ces SMP, la plus frŽquente Žtant la mutation JAK2V617F.16-18 Des mutations du gne codant pour le rŽcepteur ˆ la thrombopo•Žtine MPL ont aussi ŽtŽ dŽcrites.19

Ces SMP peuvent Žvoluer vers une leucŽmie myŽlo•de aigu‘ ou vers une myŽlofibrose (MF). La dŽcouverte de la mutation JAK2V617F a permis de mieux comprendre leur pathogense.16 Cette mutation est en effet observŽe dans plus de 95% des PV et dans la

majoritŽ des TE (60%) et des PMF (50%).20 De plus, diffŽrents modles de souris montrent

que l'expression de JAK2V617F suffit ˆ reproduire une maladie de type PV qui peut Žvoluer vers une myŽlofibrose.16,21

Dans la majoritŽ des cas de PV et de PMF, la mutation JAK2V617F est observŽe sous forme homozygote ; ceci rŽsulte le plus souvent dÕune recombinaison mitotique aboutissant ˆ la perte de la copie sauvage et ˆ la duplication de la copie mutŽe. A lÕopposŽ, dans les TE, la mutation est le plus souvent hŽtŽrozygote.22 Ces observations suggrent un lien entre la Ç quantitŽ È de JAK2V617F et le phŽnotype clinique.

Cependant, dans certains cas de SMP, des anomalies cytogŽnŽtiques peuvent tre observŽes en plus large proportion que la mutation JAK2V617F elle-mme.23 Certains patients avec un SMP JAK2V617F positif ne prŽsentent plus la mutation lors de la transformation aigu‘.24 Ces constatations suggrent fortement l'existence de mutations

somatiques prŽcoces Ç prŽJAK2 È.23,24

Les mutations rŽcemment dŽcrites du gne Ten-Eleven-Translocation (TET)2 dans les SMP,

les SMD, et les LAM primaires et secondaires25-31 constituent un exemple de mutation

4

1.2.2. Mutations du gne TET2 dans les hŽmopathies myŽlo•des

Le gne TET2 fait partie dÕune famille de 3 membres. Le membre fondateur TET1, situŽ en 10q21, a ŽtŽ identifiŽ en tant que partenaire de MLL dans une translocation (10;11) (q22;q23) prŽsente dans des leucŽmies aigu‘s ;32,33 TET2 et TET3 sont respectivement situŽs en 4q24 et 2p13. Le gne TET2 comprend 11 exons et sՎtend sur plus de 150 kb. La protŽine TET2 est codŽe par les exons 3 ˆ 11 et comporte 2002 acides aminŽs.

Des mutations inactivatrices de ce gne ont ŽtŽ dŽcrites dans diffŽrentes pathologies myŽlo•des avec des frŽquences variables.

1.2.2.1.

FrŽquences des mutations TET2 dans les hŽmopathies myŽlo•des

Les mutations de TET2 affectent toutes les rŽgions du gne. Tous les types de mutations sont observŽs : insertions ou dŽlŽtions avec dŽcalage du cadre de lecture (frameshift), mutations affectant les sites dՎpissage, mutations faux-sens et mutations non-sens. La prŽsence de mutations entra”nant un dŽcalage du cadre de lecture et/ou lÕapparition dÕun codon stop suggre que les anomalies de TET2 conduisent ˆ lÕinactivation du gne. LÕobservation de deux mutations de TET2 chez la moitiŽ des cas mutŽs31 suggre que les deux copies de TET2 pourraient tre inactivŽes, aboutissant ˆ une perte totale de fonction. NŽanmoins, la prŽsence d'une seule mutation chez lÕautre moitiŽ des patients indique Žgalement un effet dÕhaplo-insuffisance.30,31,34

LÕensemble de ces donnŽes permet dÕenvisager TET2 comme un nouveau gne suppresseur de tumeur35 rŽgulant lÕhŽmatopo•se physiologique, et ses anomalies comme des Žvnements gŽnŽtiques prŽcoces dans les pathologies myŽlo•des.

La grande majoritŽ des mutations TET2 est acquise. Dans les SMP familiaux, les mutations de TET2 observŽes sont toutes somatiques. Un seul cas de mutation germinale a ŽtŽ formellement identifiŽ36 mais lÕanalyse dÕun tissu constitutionnel ne pouvant tre rŽalisŽe chez tous les patients, les mutations germinales de TET2 sont probablement sous-estimŽes.

Les mutations de TET2 ont tout dÕabord ŽtŽ identifiŽes dans des pathologies myŽlo•des de lÕadulte. Elles sont observŽes avec une frŽquence globale de 18%, allant de 3% pour les LMC jusquՈ 43% pour les LMMC. (Tableau 1)

5

SMD 6-26% 17% 27,29-31,37,38 LMMC 20-50% 43% 25,27,29,31,38-41 SMD / SMP autres que LMMC 31-33% 31% 27,29 PV 10-16% 13% 25,28,31 TE 4-11% 7% 25,28,31 MFP 8-25% 17% 25,28,31 MF post SMP 14-33% 17% 28,31 LMC 2-4% 3% 42,43 Mastocytose 29% 29% 26 LAM de novo 12-23% 15% 25,27,44-47

LAM 2aires post SMD ou SMD / SMP 22-43% 24% 29

LAM 2aires post SMP 17-32% 26% 28,48

LAM 2aires post traitement 9% 9% 49

Tableau 1 : FrŽquence des mutations de TET2 dans diverses pathologies myŽlo•des.

Concernant les patients pŽdiatriques, peu dՎtudes ont ŽtŽ rŽalisŽes mais il appara”t que les mutations de TET2 sont des Žvnements rares dans le processus de transformation tumorale. Aucune mutation de TET2 nÕa ŽtŽ dŽcrite dans les LAL-B pŽdiatriques50 et dans les leucŽmies juvŽniles myŽlomonocytaires.51,52 Elles ne touchent que 4% des patients atteints de LAM.50

1.2.2.2.

CaractŽristiques cliniques et biologiques associŽes aux mutations

TET2

Les caractŽristiques cliniques et biologiques au diagnostic des patients mutŽs pour

TET2 et atteints de pathologies myŽlo•des sont rŽsumŽes dans le Tableau

2

Globalement, les patients mutŽs pour TET2 semblent plus ‰gŽs que les patients sauvages.28,37,38,40,44,45,47,49 Il nÕy a pas de prŽdominance de genre.37,38,40,44,45,49 Au sein des SMD et formes frontires SMD / SMP telles que les LMMC, aucune diffŽrence notable concernant le sous-type selon les classifications FAB ou OMS, le score pronostique IPSS (International Prognostic Scoring System) ou encore le traitement antŽrieur reu nÕest mise en Žvidence.37,38,40

Concernant les LAM de novo, les patients porteurs dÕune mutation de TET2 ont un taux plus ŽlevŽ de leucocytes et de LDH.44,45 Au niveau des sous-types cytologiques FAB, il appara”t que les mutations de TET2 sont rares dans les LAM de type M3.44,47En revanche, si lÕon exclut les FAB M3, les mutations de TET2 touchent tous les sous-types sans diffŽrence significative.44 Il nÕexiste pas de diffŽrence sur les critres cliniques et biologiques au diagnostic que le patient soit porteur dÕune ou de deux mutations.44

6

Pathologie CaractŽristique Impact RŽfŽrences

SMP Age plus ŽlevŽ 28

SMD

Age controversŽ 37,38

Taux de blastes controversŽ 30,37

CytopŽnies controversŽ 29,30,37,53

Sexe non 37,38

Classification FAB non 37

Classification OMS non 37,53

IPSS non 37,38,53

Traitement antŽrieur non 37,38,53

LMMC

Age controversŽ 38,40

Sexe non 40

CytopŽnies non 40

Taux de blastes non 40

Classification FAB non 40

Classification OMS non 40

LAM 2aires post SMD et

post traitement

Age plus ŽlevŽ 49

Taux de leucocytes plus ŽlevŽ 49

Taux de monocytes plus ŽlevŽ 49

Taux de plaquettes moins ŽlevŽ 49

Sexe non 49

Traitement antŽrieur non 49

Taux d'hŽmoglobine non 49

Taux de blastes non 49

LAM de novo

Age plus ŽlevŽ 44,45,47

Taux de leucocytes plus ŽlevŽ 44,45

FAB M3 moins frŽquent 44,47

Taux de blastes controversŽ 44,45

Sexe non 44,45

Taux dÕhŽmoglobine et de plaquettes non 44,45

Classification FAB hors M3 non 44

Tableau 2 : Paramtres cliniques et biologiques analysŽs dans la littŽrature chez les patients mutŽs pour TET2.

1.2.2.3.

CaractŽristiques cytogŽnŽtiques et molŽculaires associŽes aux

mutations TET2

LÕassociation Žventuelle des mutations TET2 ˆ des aspects cytogŽnŽtiques ou molŽculaires particuliers dans les pathologies myŽlo•des est reportŽe dans le Tableau 3.

Brivement, dans les syndromes myŽlodysplasiques (SMD) et leucŽmies myŽlomonocytaires chroniques (LMMC), les mutations de TET2 ne sont pas associŽes ˆ une

7

cytogŽnŽtique spŽcifique.29,37,38 ,40En revanche, dans les leucŽmies aigu‘s myŽlo•des (LAM), quÕelles soient secondaires ou de novo, on observe une association significative entre la prŽsence de mutations TET2 et un caryotype normal.44,45,47,49

Au sein des LAM de novo, les mutations de TET2 ne sont pas associŽes aux mutations

de FLT3, CEBPA, MLL, AML 1, KIT, WT1, N ou Kras.25,44,45,47Une Žtude rapporterait une

co-occurrence des mutations de TET2 avec des mutations dÕASXL1.44 Les mutations de TET2

et dÕIDH1-IDH2 sont quasi mutuellement exclusives.44,45,47 Enfin, elles seraient associŽes au

sous groupe Ç risque favorable È chez les patients avec LAM ˆ caryotype normal.45

Pathologie CaractŽristique Impact RŽfŽrences

SMD CytogŽnŽtique non 29,37,38

LMMC Mutations CBL association aux mutations CBL

39 CytogŽnŽtique non 40 LAM 2aires post SMD et post traitement

CytogŽnŽtique association ˆ un caryotype normal 49

Mutations FLT3 non 49

Mutations NPM1 non 49

Mutations Kit non 49

Mutations N ou K ras non 49

Mutations WT1 non 49

LAM de novo

CytogŽnŽtique association ˆ un caryotype normal 44,45,47 Caryotype normal association au risque favorable 45 Mutations ASXL1 association aux mutations ASXL1 44 Mutations IDH1/2 mutuellement exclusives 44,45,47,54

Mutations NPM1 controversŽ 25,44,45,47

Mutations CEBPA non 25,44,47

Mutations FTLT3 non 25,44,45,47

Mutations MLL non 25,45

Mutations AML1 non 44

Mutations Kit non 44

Mutations WT1 non 44,45

Mutations N ou K ras non 44

Tableau 3 : CaractŽristiques cytogŽnŽtiques et molŽculaires analysŽes dans la littŽrature chez les patients mutŽs pour TET2.

8

1.2.2.4.

Impact pronostique des mutations TET2

LÕobservation de mutations frŽquentes du gne TET2 a conduit ˆ se poser la question de leur impact pronostique (Tableau 4).

Pour les PV, les MFP et les mastocytoses, la prŽsence de mutations TET2 ne semble pas influer sur le pronostic.26,28 Concernant les LMMC, Kohlmann et al39 rapportent une meilleure OS chez les patients mutŽs contrairement ˆ lՎtude de Kosmider et al40 qui montre une moins bonne survie des patients TET2 mutŽs avec LMMC-1. Pour les SMD, les donnŽes publiŽes montrent aussi des discordances, avec une Žtude retrouvant une moins bonne OS chez les patients mutŽs pour TET237 et une autre ne mettant pas en Žvidence dÕimpact pronostique.38

Chez les patients avec LAM de novo, il ne semble pas y avoir dÕimpact des mutations TET2 sur le pronostic.44,46,47 Aucune diffŽrence de survie nÕest mise en Žvidence entre les

patients porteurs dÕune mutation TET2 et ceux porteurs de deux.44 Le groupe du CALGB a

montrŽ quÕau sein dÕun sous-groupe particulier de LAM de novo, les LAM ˆ caryotype normal risque favorable, lÕobservation de mutations de TET2 impacte la survie globale, la DFS et le taux de RC.45 Au sein des LAM ˆ cytogŽnŽtique intermŽdiaire, Chou et al44 ont identifiŽ 3 groupes de patients : les TET2 mutŽs / FLT3 mutŽs qui ont un mauvais pronostic, les TET2 sauvages / FLT3 sauvages qui ont un bon pronostic, et les TET2 mutŽs / FLT3 sauvages ou TET2 sauvages / FLT3 mutŽs qui ont une survie intermŽdiaire. Par ailleurs les auteurs montrent que la prŽsence de mutations de TET2 nÕinfluence pas la survie dans le groupe avec marqueurs molŽculaires de bon pronostic (CEBPA mutŽ ou NPM1 mutŽ / FLT3 sauvage). En revanche, en lÕabsence de ces derniers, elle grve le pronostic.44 En tenant compte de la prŽsence ou non de mutations FLT3, NPM1, CEBPA et TET2, Chou et al ont proposŽ un score corrŽlŽ au devenir pour les LAM ˆ cytogŽnŽtique intermŽdiaire.

Pathologie Impact pronostique RŽfŽrences Nombre de

patients analysŽs SMD controversŽ 37 38 96 320 LMMC controversŽ 39 40 81 88 PV non 28 89 MFP non 28 60 Mastocytose non 26 42

LAM 2aires post SMD

ou post traitement non

49

247

LAM de novo non

44 46 47 486 147 605 LAM de novo ˆ caryotype normal

moins bonnes DFS, OS et moins bon taux de RC pour les Ç risque favorable È

45

437 Tableau 4 : Impact pronostique des mutations TET2.

9

1.3. HŽmopathies lympho•des

1.3.1. Classification et gŽnŽralitŽs

Au sein des hŽmopathies lympho•des matures, la classification OMS 2008 distingue : les prolifŽrations matures B, les prolifŽrations matures T/ NK, les lymphomes de Hodgkin, les nŽoplasies ˆ histiocytes et cellules dendritiques et enfin les lymphoprolifŽrations post transplantation.55

Les lymphoprolifŽrations matures T/ NK comprennent 3 groupes :56 ¥ les lymphomes T pŽriphŽriques (PTCL)

¥ les lymphomes T primitivement cutanŽs type Syndrome de SŽzary ou mycosis fungo•de

¥ les leucŽmies T :

o leucŽmies granulaires ˆ cellules T o leucŽmies ˆ cellules NK

o leucŽmies prolymphocytaires T

Nous nous sommes focalisŽs sur le groupe hŽtŽrogne des lymphomes T pŽriphŽriques, qui compte pour moins de 15% de lÕensemble des lymphomes non Hodgkiniens57 et dont certaines sous-entitŽs sont encore mal caractŽrisŽes sur le plan molŽculaire. La prŽvalence des principaux types de PTCL est rapportŽe dans le Tableau 5. La Figure 2 reprŽsente la diffŽrenciation normale T et NK et indique de quel type cellulaire pourrait dŽriver chaque entitŽ de PTCL.

Type PrŽvalence

Lymphome T pŽriphŽrique non spŽcifiŽ (PTCL, NOS) 26 %

Lymphome T angio-immunoblastique (AITL) 18 %

Lymphome NK / T extra-ganglionnaire de type nasal 10 %

LeucŽmie / lymphome T de l'adulte HTLV1 + 10 %

Lymphome anaplasique ˆ grandes cellules (ALCL) ALK+ 7 % Lymphome anaplasique ˆ grandes cellules (ALCL) ALK- 5 %

Lymphome T associŽ ˆ une entŽropathie 5 %

Lymphome anaplasique ˆ grandes cellules cutanŽ primitif 2 %

Lymphome T hŽpatosplŽnique 1 %

Lymphome T sous-cutanŽ ˆ type de panniculite 1 %

Autres entitŽs et cas non classŽs 15 %

10

Si lÕon exclut les lymphomes anaplasiques ˆ grandes cellules ALK+, les lymphomes T pŽriphŽriques sont globalement associŽs ˆ un mauvais pronostic (Figure 3).

Figure 3 : Courbe de survie des patients atteints de PTCL.57

Deux scores pronostiques peuvent tre utilisŽs : lÕIPI (International Prognostic Index),

applicable ˆ tous les lymphomes non Hodgkiniens et le PIT (Prognostic Index for PTCL-U)59

spŽcifique des PTCL et qui tient compte de 4 paramtres : lՉge, le taux de LDH, le Ç performance status È, et la prŽsence dÕun envahissement mŽdullaire.

11

1.3.2. Description des principaux PTCL

Les trois types histologiques de PTCL les plus frŽquents en Europe et AmŽrique du Nord sont le lymphome T pŽriphŽrique non spŽcifiŽ (PTCL, NOS), le lymphome T angio-immunoblastique (AITL) et le lymphome anaplasique ˆ grandes cellules (ALCL).

1.3.2.1.

ALCL

Deux sous-type dÕALCL sont dŽcrits : les ALCL exprimant la protŽine ALK (ALK+) et ceux ne lÕexprimant pas (ALK-).

1.3.2.1.1 ALCL ALK+

Les ALCL ALK+ touchent principalement des enfants et de jeunes adultes, se caractŽrisent cliniquement par de nombreuses adŽnopathies, des atteintes extra-ganglionnaires frŽquentes (peau, os et tissus mous), la prŽsence de sympt™mes B (fivre), un stade avancŽ chez la moitiŽ des patients et sont associŽs ˆ un bon pronostic.58

Les cellules tumorales sont ALK+, CD30+, EMA+, CD3- et expriment souvent le CD2, le CD4, le CD45 mais aussi des antignes de lymphocytes T cytotoxiques comme TIA-1, granzyme B et perforine.58

Sur le plan cytogŽnŽtique, il est observŽ une translocation impliquant le gne ALK (2p23) qui signe le diagnostic. La premire dŽcrite, qui est Žgalement la plus frŽquente, est la translocation t(2;5)(p23;q35) qui fusionne le gne ALK au gne NPM1.60,61 DÕautres partenaires dÕALK ont par la suite ŽtŽ rapportŽs (Tableau 6). Dans tous les cas, la fusion entra”ne une activation constitutive de la tyrosine kinase ALK.62

Translocation Gne partenaire FrŽquence

t(2;5)(p23;q35) Nucleophosmin (NPM1) 75%

t(1;2)(q25;p23) Tropomyosin 3 (TPM3) 10-20%

t(2;3)(p23;q11) TRK fused gene (TFG) 2-5%

inv(2)(p23q35) ATIC (Pur H gene) 2-5%

t(2;17)(p23;q23) Clathrin heavy chain (CLTC) 2-5%

t(2;22)(p23;q11.2) Myosin heavy chain (MYH9) rare

t(2;17)(p23;q23) ALK lymphoma oligomerization partner on

chromosome 17 (ALO17) rare

t(2;19)(p23;p13.1) Tropomyosin 4 (TPM4) rare

t(2;X)(p23;q11Ð12) Moesin (MSN) rare

12

1.3.2.1.2 ALCL ALK-

Les ALCL ALK- affectent des individus plus ‰gŽs, avec de moins frŽquentes atteintes extra-ganglionnaires. Le pronostic des ALCL ALK- est moins bon que celui des ALCL ALK+ mais reste meilleur que celui des PTCL, NOS.

Les cellules tumorales sont ALK- CD30+. Les antignes pan-T sont plus souvent exprimŽs dans les tumeurs ALK- que les tumeurs ALK+, contrairement aux marqueurs cytotoxiques et ˆ lÕantigne EMA qui le sont moins. Les ALCL ALK- peuvent tre difficiles ˆ distinguer de certains PTCL, NOS exprimant fortement le CD30+.58

RŽcemment il a ŽtŽ dŽcrit un rŽarrangement rŽcurrent du locus 6p25 prŽsent chez environ 25% des patients atteints dÕALCL ALK-, quÕils soient de type systŽmique ou cutanŽ. Cette translocation affecte dans 1/3 des cas le gne IRF4 et dans 2/3 des cas le gne DUSP22.63-66 Le facteur de transcription IRF4/MUM1 est connu pour tre un important rŽgulateur de la diffŽrenciation lympho•de normale, fortement exprimŽ dans les plasmocytes et les lymphocytes T activŽs.67 Dans la majoritŽ des translocations impliquant IRF4, le partenaire nÕest pas identifiŽ et lÕexpression dÕIRF4 ne semble pas dŽrŽgulŽe.63 En revanche, quand le gne affectŽ en 6p25 est DUSP22, son partenaire se situe dans plus de la moitiŽ des cas en 7q32.3 ˆ proximitŽ du site fragile FRA7H et du gne codant pour le miRNA MIR29. La translocation (6;7)(p25.3;q32.3) conduit ˆ la sous-expression de DUSP22 et ˆ la

surexpression de MIR29.63

Les rŽarrangements du locus 6p25 ne surviennent quÕoccasionnellement dans les autres entitŽs de PTCL63-66 et leur dŽtection peut donc aider au diagnostic diffŽrentiel, en particulier pour certaines lymphoprolifŽrations CD30+ de la peau. Une translocation impliquant le locus 6p25, la t(6;14)(p25;q11.2) a tout de mme ŽtŽ rapportŽe chez deux patients atteints de PTCL, NOS avec phŽnotype Ç cytotoxique È et dans ce cas, fusionnait le gne IRF4 au locus du TCR.64

Des aberrations chromosomiques sont dŽtectŽes dans deux tiers des cas et diffrent de celles observŽes chez les patients ALK+.68 Les analyses transcriptomiques rŽvlent une signature molŽculaire commune aux ALCL ALK+ et ALK- mais identifient Žgalement un set de gnes spŽcifiques dont lÕexpression diffre entre les deux sous-types.69,70

13

1.3.2.2.

AITL

Les lymphomes T angio-immunoblastiques (AITL) reprŽsentent par ordre de frŽquence le deuxime lymphome T pŽriphŽrique (PTCL) au monde et le premier en Europe et AmŽrique du Nord (25 ˆ 30% des PTCL).

1.3.2.2.1 Aspects clinico-biologiques

Les AITL sont principalement observŽs chez les patients de 60-70 ans et se prŽsentent

cliniquement par des adŽnopathies gŽnŽralisŽes, une hŽpatosplŽnomŽgalie, et des

sympt™mes B (fivre, perte de poids, Žruption cutanŽe, arthralgies). Sur le plan biologique, une hypergammaglobulinŽmie polyclonale et une anŽmie hŽmolytique auto-immune sont frŽquemment retrouvŽes.58 La survie globale des AITL est proche de celle des PTCL, NOS, dÕenviron 30% ˆ 5 ans et leur mŽdiane de survie ne dŽpasse pas 3 ans.71

1.3.2.2.2 Aspects histologiques et cytogŽnŽtiques

Sur le plan histologique, les AITL se caractŽrisent par :72

¥ un infiltrat polymorphe associant en proportions variables des cellules tumorales T de taille moyenne avec noyau rond ou lŽgrement irrŽgulier et cytoplasme clair, de petits lymphocytes, des histiocytes, des cellules ŽpithŽlio•des, des immunoblastes, des Žosinophiles et des plasmocytes

¥ une hyperplasie vasculaire avec vaisseaux ramifiŽs

¥ une prolifŽration pŽrivasculaire de cellules folliculaires dendritiques

¥ la prŽsence de grandes cellules B souvent infectŽes par lÕEBV, qui ressemblent aux cellules de Reed Sternberg. LÕabondance de ces cellules B ne corrle pas avec le pronostic71 mais avec la dŽtection chez un tiers des patients dÕune clonalitŽ ou oligoclonalitŽ B.73

Le compartiment tumoral est souvent moins reprŽsentŽ que lÕinfiltrat rŽactionnel.

Des aberrations chromosomiques clonales sont observŽes dans plus de 90% des cas. Il sÕagit principalement de trisomies 5, trisomies 21, gain du 3q, 5q et perte du 6q.74 Il nÕest que trs peu observŽ de translocations impliquant le locus du TCR.

1.3.2.2.3 La cellule tumorale dÕAITL

Les cellules tumorales dÕAITL sont gŽnŽralement CD4+ CD8- !" + mais dans certains

cas nÕexpriment que faiblement des marqueurs pan -T comme le CD3, le CD4 ou le CD758

Elles expriment frŽquemment le CD1075 et BCL676, des marqueurs du centre germinatif. Elles expriment Žgalement des marqueurs caractŽristiques des lymphocytes T follicular

14

helpers (TFH), tels que CXCL13, PD1, ICOS, PD200, SAP, et CMAF.77-80Les TFH sont des

cellules CD4+CD57+CXCR5+CCR7- qui se situent dans les centres germinatifs des ganglions au sein desquels ils aident les cellules B au cours des dernires Žtapes de leur maturation en induisant lÕexpression dÕAID.81

Les analyses immunohistochimiques ont par la suite ŽtŽ complŽtŽes par des Žtudes transcriptomiques. Celles-ci confirment que la contrepartie Ç normale È des cellules tumorales dÕAITL correspond bien aux lymphocytes TFH. Il existe en effet une signature molŽculaire commune entre les cellules dÕAITL et les TFH.82,83

LÕensemble de ces donnŽes a permis dÕaider au diagnostic et ˆ la classification. En effet, des marqueurs TFH comme CXCL13 ou PD1 ont ŽtŽ validŽs en tant que nouveaux biomarqueurs dans le diagnostic immunohistochimique des AITL et permettent en particulier de faire le diagnostic diffŽrentiel avec dÕautres entitŽs de PTCL.62

Le fait que les cellules tumorales dÕAITL dŽrivent trs probablement de TFH normaux est un premier pas vers la comprŽhension de la pathogense des ces maladies. NŽanmoins, les altŽrations molŽculaires ˆ lÕorigine de la transformation des TFH en cellules tumorales dÕAITL ne sont pour lÕinstant pas connues. DÕautres mŽcanismes interviennent trs

probablement au cours du dŽveloppement des AITL.72 Le microenvironnement tumoral

semble jouer un r™le important puisque prs de 90% de la signature molŽculaire des AITL sont dus aux cellules non tumorales.82 Par des boucles de rŽgulation autocrines et/ou paracrines, celui-ci est trs probablement ˆ lÕorigine du syndrome inflammatoire et des manifestations cliniques et biologiques dysimmunes observŽes chez les patients. Les virus EBV et HHV6B sont souvent retrouvŽs dans les cellules B rŽactionnelles. Ces observations suggrent quÕils ne sont pas directement responsables de la transformation tumorale T mais quÕils peuvent, via la modulation de production de certaines cytokines, chŽmokines, rŽcepteurs de membrane, jouer un r™le dans le dŽveloppement du microenvironnement et ainsi favoriser la progression tumorale.

1.3.2.3.

PTCL, NOS

Les lymphomes T pŽriphŽriques non spŽcifiŽs (PTCL, NOS) sont les plus frŽquents mais aussi les plus hŽtŽrognes des PTCL. Le diagnostic des PTCL, NOS est en rŽalitŽ un diagnostic dÕexclusion des autres PTCL.

1.3.2.3.1 Aspects clinico-biologiques

Les PTCL, NOS concernent souvent des patients de plus de 70 ans et se caractŽrisent cliniquement par des adŽnopathies gŽnŽralisŽes avec des stades avancŽs dans 65% des

15

cas, mais aussi un envahissement extra-ganglionnaire frŽquent. Biologiquement, on peut observer une Žosinophilie et un syndrome dÕactivation macrophagique.58 Le pronostic des

PTCL, NOS nÕest pas trs bon, avec une survie globale ˆ 5 ans dÕenviron 25-30%.58

1.3.2.3.2 Aspects histologiques et cytogŽnŽtiques

Les cellules tumorales de PTCL, NOS sont des cellules ˆ cytoplasme clair CD4+ CD8-. Les autres antignes T sont variablement exprimŽs avec une perte frŽquente du CD7 et plus rarement une perte du CD2, CD3 ou CD5. LÕEBV peut tre dŽtectŽ dans une proportion variable de cellules tumorales mais Žgalement dans des cellules B adjacentes. Sur le plan histologique, une augmentation de la vascularisation et une Žosinophilie peuvent tre observŽes.58,72 Des variants morphologiques ont ŽtŽ dŽcrits :

¥ le PTCL, NOS lymphoŽpithŽlio•de (lymphome de Lennert) caractŽrisŽ par un infiltrat dÕhistiocytes et de petits lymphocytes cytotoxiques le plus souvent CD8+

¥ le PTCL, NOS folliculaire avec une structure architecturale mimant celle du lymphome B folliculaire

La cytogŽnŽtique retrouve frŽquemment des caryotypes complexes. La premire translocation dŽcrite dans les PTCL, NOS est la translocation (5;9)(q33;q22) qui fusionne le gne IL-2-inducible T-cell kinase (ITK) situŽ sur le chromosome 5 avec le gne spleen tyrosine kinase (SYK) localisŽ sur le chromosome 9.84 Cette translocation semble associŽe ˆ un sous-groupe particulier, le PTCL, NOS folliculaire puisquÕelle est observŽe chez 20% des patients prŽsentant ce sous-type.85 Elle nÕest jamais dŽtectŽe dans les AITL. La protŽine de fusion rŽsultante est une tyrosine kinase active et son r™le oncogŽnique a ŽtŽ Žtabli in vivo. En effet, les souris surexprimant la fusion ITK-SYK dŽveloppent des lymphomes qui ressemblent aux PTCL, NOS.86,87 Une Žtude avait observŽ et ce, en dehors de toute translocation, une phosphorylation et une activation de SYK dans plus de 90% des cas de PTCL tous confondus88 mais cette frŽquence nÕa pas ŽtŽ retrouvŽe par dÕautres groupes.89,90 A lÕinstar des AITL, les translocations impliquant le locus du TCR sont trs rares dans les

PTCL, NOS.62

Les dŽsŽquilibres observŽs en CGH diffrent de ceux retrouvŽs dans les AITL ou les ALCL. Il sÕagit de gains rŽcurrents des 1q, 3p, 5p ,7q, 8q, 17q et 22q et des pertes du 6q, 10p et 13q.74,91,92

Au total, si lÕon exclut les cas particuliers des PTCL, NOS folliculaires avec translocation ITK-SYK, aucune anomalie molŽculaire rŽcurrente nÕest pour lÕinstant dŽcrite chez la plupart des patients avec PTCL, NOS.

16

1.3.2.3.3 La cellule tumorale de PTCL, NOS

Sur le plan du profil dÕexpression, les cellules des PTCL, NOS semblent se rapprocher des cellules CD4+ ou CD8+ activŽes et se caractŽrisent par une sous-expression de gnes associŽs ˆ la prolifŽration, ˆ lÕapoptose, ˆ lÕadhŽsion cellulaire et au remodelage de la matrice et par une surexpression de la voie PDGFR!.93 Certains profils semblent corrŽlŽs ˆ la survie : la surexpression de la voie NFkappa B est associŽe ˆ un bon pronostic,94 contrairement ˆ la surexpression dÕune signature de prolifŽration qui elle, est associŽe ˆ un mauvais pronostic.95 Les analyses transcriptomiques ont permis Žgalement dÕidentifier un sous type particulier de PTCL, NOS qui prŽsente un profil dÕexpression proche de celui des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques et qui est associŽ ˆ un moins bon pronostic.96

Enfin, il semble exister des formes frontires entre les PTCL, NOS et les AITL, sur le plan histologique mais aussi molŽculaire. En effet, on retrouve chez certains PTCL, NOS CD30- une signature TFH.82

Le Tableau 7 rŽsume les caractŽristiques molŽculaires principales des PTCL, NOS, AITL et ALCL. EntitŽ de PTCL Aspects gŽnŽtiques et molŽculaires Implications diagnostiques et thŽrapeutiques PTCL, NOS t(5;9)(q33;q22) (SYK-ITK) (variant

folliculaire) Inhibiteurs de SYK et PDGFRA

activation de SYK

activation de PDGFR!

AITL signature TFH Utilisation des marqueurs TFH pour le diagnostic

ALCL, ALK+ t(2;v)(p23;v)

PossibilitŽ d'utiliser des petites molŽcules inhibitrices dirigŽes contre

les protŽines de fusion ALK

ALCL, ALK- rŽarrangement du locus IRF4

Valeur de la FISH IRF4 pour le diagnostic diffŽrentiel entre ALCL cutanŽs et autres lymphoprolifŽrations

primitives cutanŽes CD30+

Tableau 7 : Principaux aspects gŽnŽtiques et molŽculaires des 3 entitŽs les plus frŽquentes de PTCL avec leurs potentielles implications diagnostiques et thŽrapeutiques.62

17

1.4. ProtŽines TET

1.4.1. Structure des protŽines TET

Les protŽines TET comportent 3 membres : TET1 (2136 a.a), TET2 (2002 a.a), et TET3 (1660 a.a).97 La protŽine TET2 sÕexprime de manire ubiquitaire, contrairement ˆ TET1 et TET3 dont lÕexpression est tissu-spŽcifique. Elles sont apparentŽes aux enzymes JBP (J-binding protein) 1 et 2 qui catalysent la conversion des thymines en hydroxymethyluraciles (hmU) chez les trypanosomes. Structurellement, elles appartiennent ˆ la superfamille des oxygŽnases dŽpendantes du 2-oxoglutarate (2OG) et du Fe(II).98

En plus de leur domaine catalytique constituŽ de feuillets " (double-stranded "-helix ou DSBH), les protŽines TET ont en commun une rŽgion riche en cystŽine. Toutes comportent 3 sites de liaison au Fe(II),!(TET1 : a.a 1672, 1674, 2028 ; TET2 : a.a 1382, 1384, 1884 ; TET3 : a.a 942, 944, 1538) et un site de liaison au 2-oxoglutarate (TET1 : a.a 2043, TET2 : a.a 1896, TET3 : a.a 1553).97

La sŽquence protŽique de TET1 rŽvle la prŽsence de 3 signaux de localisation

nuclŽaire (Figure 4).98 La protŽine TET1 prŽsente Žgalement un domaine CXXC situŽ en

N-terminal, qui est absent des protŽines TET2 et TET3.97,99 Les domaines CXXC sont des domaines de liaison ˆ lÕADN, en particulier au niveau des ”lots CpG dŽmŽthylŽs.100 La particularitŽ du domaine CXXC de TET1 est quÕil se lie ˆ la fois aux cytosines non modifiŽes

mais Žgalement aux cytosines mŽthylŽes et hydroxymŽthylŽes.101,102

La protŽine TET2 ne comporte pas de domaine CXXC. Cependant, le gne CXXC4 est situŽ Žgalement en 4q24 ˆ environ 650 kb en amont du gne TET2. On peut donc supposer quÕune inversion chromosomique ancestrale aurait dŽtachŽ le domaine CXXC de TET2 pour en faire un gne distinct. Selon Iyer et al, lÕinteraction entre les protŽines CXXC4

et TET2 au sein dÕun mme complexe conduirait ˆ une fonction correcte de TET2.103

En rŽsumŽ, TET1 semble se lier directement ˆ lÕADN via son domaine CXXC, ce qui lui permettrait dÕexercer son activitŽ enzymatique dans des rŽgions spŽcifiques du gŽnome. En revanche, les donnŽes actuelles concernant TET2 et TET3 ne sont pas aussi claires et lÕon peut supposer que ces deux protŽines se fixent de manire indirecte ˆ lÕADN au sein de complexes dont les diffŽrents membres nÕont pour lÕinstant pas ŽtŽ identifiŽs.

Figure 4 : ReprŽsentation schŽmatiqu

1.4.2. Fonction des protŽin

Durant le dŽveloppement, le diverses cellules dont le profil dÕe modifications spŽcifiques de l ŽpigŽnŽtiques. Celles-ci sont la exactement le mme gŽnome prŽs

Chez le trypanosome, les thymidines, qui sont ensuite gly impliquŽes dans la rŽpression tra parasite.104 Les protŽines de permettent lÕhydroxylation des 5 hydroxymŽthylcytosines (5hmC)

Les 5hmC ont ŽtŽ identifi comptent pour 0,17% de lÕensemb sont prŽsentes dans 0,6% du bien que faible, est ˆ rapporter ˆ bases du gŽnome chez les mamm

La conversion en 5hmC co active ou passive (Figure 5). ŽpigŽnŽtique de la transcription.

Les 5hmC ne sont pas rec effet de dilution, les divisions cellu ˆ une dŽmŽthylation passive.

hŽmatique de la structure des protŽines TET.97

des protŽines TET : lÕhydroxylation des mŽthylcytos

pement, les cellules souches et les progŽniteurs se d profil dÕexpression gŽnique est rŽgulŽ au moins en de lÕADN et de leurs histones appelŽes ci sont largement responsables du fait que des

nome prŽsentent des phŽnotypes tout ˆ fait distincts. some, les enzymes JBP1 et JBP2 catalysent lÕhyd

nsuite glycosylŽes. Ces thymidines modifiŽes (base ression transcriptionnelle des gnes codant pour les es de la famille TET ne sont pas actives sur les th ion des 5-mŽthylcytosines (5mC) ce qui conduit ˆ la fo

hmC).98,105

identifiŽes comme une nouvelle marque ŽpigŽ e lÕensemble des bases des cellules embryonnaires e

6% du gŽnome des cellules de Purkinje murines.107

rapporter ˆ celui des 5mC qui reprŽsentent 1% de lÕ les mammifres.108

mC constituerait une Žtape vers la dŽmŽthylatio Les protŽines TET seraient donc impliquŽes dan scription.

nt pas reconnues par lÕenzyme Dnmt1 durant la rŽpl isions cellulaires conduiraient ˆ la perte progressive de

18

Žthylcytosines

iteurs se diffŽrencient en moins en partie par des appelŽes modifications que des cellules ayant distincts.

nt lÕhydroxylation des fiŽes (bases J) seraient nt pour les antignes du sur les thymidines mais duit ˆ la formation de

5-que ŽpigŽnŽti5-que. Elles onnaires eucaryotes106 et

107

Ce pourcentage, t 1% de lÕensemble des

ŽmŽthylation, quÕelle soit liquŽes dans la rŽgulation

rant la rŽplication ;109 par ressive des 5mC et donc

19

Les protŽines Tet jouent Žgalement un r™le dans la dŽmŽthylation active, et ce par lÕintermŽdiaire de plusieurs voies :

¥ Outre leur capacitŽ dÕhydroxymŽthylation des 5mC, il a ŽtŽ rŽcemment montrŽ que les protŽines de la famille Tet sont capables de poursuivre lÕoxydation des 5hmC en 5 formylcytosines (5fC) et 5 carboxycytosines (5caC).110,111 Les 5fC et 5caC peuvent ensuite tre excisŽs par des DNA glycosylases comme la thymine DNA glycosylase (TDG), conduisant ˆ la formation dÕun site abasique.112 Ce site est par la suite reconnu par le complexe BER (Base Excision Repair) qui rŽintroduit une cytosine. ¥ Les 5hmC peuvent tre dŽaminŽes par les enzymes de la famille AID / APOBEC

pour produire des 5hmU.113 Le mismatch 5hmU / G est ensuite rŽparŽ par lÕaction

successive des DNA glycosylases puis du BER.114

Figure 5 : ReprŽsentation des voies possibles de dŽmŽthylation active ou passive induites par la conversion des 5mC en 5hmC.115

DÕautres voies de dŽmŽthylation active ont ŽtŽ proposŽes :

¥ Une dÕentre elles pourrait consister en lÕaction dÕune dŽcarboxylase qui convertirait les 5caC en cytosines.115

¥ On peut Žgalement envisager que les 5hmC puissent tre excisŽes par des 5hmC glycosylases spŽcifiques, qui permettraient ensuite au site abasique dՐtre reconnu par le BER.116

¥ Le complexe NER (Nucleotide Excision Repair) qui ne reconna”t pas de lŽsions spŽcifiques de lÕADN mais plut™t des lŽsions plus Žtendues comme par exemple des pontages avec des molŽcules exognes, pourrait directement exciser les brins dÕADN

20

Enfin, indŽpendamment de leur r™le dans le processus de dŽmŽthylation, les 5hmC pourraient Žgalement avoir un effet propre en empchant la fixation de certains effecteurs protŽiques tels que les Ç methyl-CpG-binding proteins È109,117 ou au contraire en recrutant dÕautres complexes tels que Uhrf1 ou Mbd3.118,119

1.4.3. R™le des protŽines Tet dans les cellules ES murines

Tet1 et Tet2 sont bien exprimŽs dans les cellules souches embryonnaires (ES) murines, ˆ la diffŽrence de Tet3.98,105,120

1.4.3.1.

R™le de Tet1 dans les cellules ES murines

Un ŽvŽnement caractŽristique lors de la diffŽrenciation des cellules ES est lÕinactivation des gnes de pluripotence tels que Nanog et Oct4, qui est partiellement due ˆ la mŽthylation de leurs promoteurs. Les hauts niveaux dÕexpression de Tet1 et de 5hmC dans les cellules ES en comparaison ˆ ceux des cellules diffŽrenciŽes98,105,120 suggrent que Tet1 pourrait agir comme un rŽgulateur de lÕautorenouvellement des cellules ES en prŽvenant la mŽthylation des gnes de pluripotence par lÕhydroxymŽthylation.121

Par des techniques de ChIP-seq, il a en effet ŽtŽ mis en Žvidence que Tet1 se situe principalement au niveau des rŽgions promotrices de gnes de pluripotence comme Nanog, Tcl1 et Esrrb.122 Cependant, il ne semble pas y avoir dÕeffet de lÕinactivation de Tet1 par shRNA sur lÕexpression des gnes de pluripotence ni sur la morphologie des cellules ES.120,123,124 Les souris inactivŽes pour Tet1 sont viables et fertiles avec tout de mme quelques individus de plus petite taille.123 La perte de Tet1 nÕaffecterait donc pas la pluripotence des ES et serait compatible avec un dŽveloppement embryonnaire et postnatal normal. NŽanmoins, une Žtude rapporte que la rŽduction de lÕexpression de Tet1 dans les cellules ES murines par ShRNA conduit ˆ une augmentation de la mŽthylation au niveau du promoteur de Nanog ce qui entra”ne une rŽduction de son expression et une diminution de lÕautorenouvellement des cellules ES.105 De plus, des analyses de lÕexpression des gnes spŽcifiques de lignage et de tŽratomes montrent que le knock down de Tet1 par ShRNA augmente la diffŽrenciation spontanŽe des cellules ES vers le trophoectoderme et le mŽsoendoderme.120,124,125

En rŽsumŽ, la contribution de Tet1 ˆ la maintenance et ˆ la diffŽrenciation des cellules ES murines nŽcessite dՐtre clarifiŽe.

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Plusieurs Žquipes ont tentŽ de dŽterminer o se localisent les 5hmC dans le gŽnome des cellules ES et o se fixe prŽfŽrentiellement la protŽine Tet1.

Il est ˆ noter que lÕapproche classique dՎtude de la mŽthylation par Ç bisulfite genomic sequencing È ne permet pas de distinguer les 5mC de ses dŽrivŽs oxydatifs (5hmC, 5caC, 5fC). Des techniques plus prŽcises de dŽtection des 5mC et 5hmC ont donc ŽtŽ dŽveloppŽes (TLC (thin-layer chromatography) assay, spectroscopie de masse, anticorps dirigŽs contre les 5mC ou 5hmC, Tet-assisted bisulfite sequencingÉ)106,115 mais il nÕexiste pas encore de consensus clair sur la mŽthode ˆ choisir. Ceci peut expliquer un manque de cohŽrence des rŽsultats entre les diffŽrentes Žtudes.

Globalement, ˆ la diffŽrence des 5mC, les 5hmC sont peu retrouvŽes dans les rŽgions dÕhŽtŽrochromatine comme les sŽquences rŽpŽtŽes mais sont principalement observŽes dans les rŽgions promotrices des gnes et au niveau des sŽquences rŽgulatrices distales.101,106,124-127

La rŽduction de lÕexpression de Tet1 dans les cellules ES murines par une approche de RNA interfŽrence entra”ne une diminution du niveau global de 5hmC de 30 ˆ 50%105,123 et

une diminution de 20 ˆ 40% de 5hmC pour les gnes associŽs ˆ Tet1.101,124 Les effets sont

plus modestes concernant la mŽthylation globale de lÕADN puisque que la perte de Tet1 nÕentra”ne quÕune lŽgre augmentation du niveau global de 5mC. NŽanmoins certaines Žtudes rapportent des augmentations du niveau de 5mC aprs knock down de Tet1 au niveau de certains gnes.101,120,123,124,128 Ces rŽsultats peuvent sÕexpliquer de deux faons : soit dÕautres voies sont impliquŽes pour rŽguler les niveaux de 5hmC-5mC dans les cellules ES, soit lÕactivitŽ de dŽmŽthylation de Tet1 ne sÕexerce pas globalement sur lÕensemble du gŽnome mais plut™t sur des loci spŽcifiques.

Dans les cellules ES, les promoteurs riches en ”lots CpG se caractŽrisent par un niveau ŽlevŽ de 5hmC101,124-126,128 et par la prŽsence de Tet1.101,124,128 Deux catŽgories de gnes sur lesquels se fixe Tet1 peuvent schŽmatiquement tre dŽcrits :101,108,124,127,128

¥ Les gnes dont lÕexpression dŽpend directement de lÕabsence ou de la prŽsence de Tet1, c'est-ˆ-dire que leur expression varie lorsquÕon inhibe Tet1 par des techniques de RNA interfŽrence. Ils sont de deux types :

! Les gnes rŽprimŽs par Tet1 se caractŽrisent par une rŽgion promotrice riche en ”lots CpG, des niveaux ŽlevŽs de 5hmC au niveau du site initial de transcription, une trimŽthylation de H3K4 (H3K4me3) et H3K27 (H3K27me3), et lÕassociation au complexe rŽpresseur Polycomb PRC2. Ces gnes sont essentiellement des gnes Ç bivalents È rŽgulant la diffŽrenciation et le dŽveloppement.

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! Les gnes activŽs par Tet1 se caractŽrisent par une rŽgion promotrice riche en ”lots CpG, des niveaux ŽlevŽs de 5hmC au niveau des corps des gnes et une trimŽthylation de H3K4 et H3K36 (H3K36me3). Il sÕagit plut™t de gnes de mŽnage.

¥ Les gnes dont lÕexpression est indŽpendante de lÕabsence ou de la prŽsence de Tet1. Dans ce cas, leur expression nÕest pas modifiŽe aprs knock-down de Tet1, suggŽrant que Tet1 influence lÕaccessibilitŽ ˆ la chromatine indŽpendamment de son activitŽ sur la rŽgulation transcriptionnelle. Ils sont Žgalement de deux types :

! Les gnes rŽprimŽs se caractŽrisent par la marque univalente H3K27me3.

! Les gnes activŽs sont associŽs ˆ des niveaux ŽlevŽs de H3K4me3 et H3K36me3.

Dans les cellules ES murines, il appara”t donc que Tet1 joue un r™le dÕactivateur mais aussi de rŽpresseur transcriptionnel (Figure 6).

Il rŽprime un certain nombre de gnes, essentiellement des gnes impliquŽs dans la diffŽrenciation, via deux mŽcanismes :

¥ en recrutant le complexe rŽpresseur PRC2. Il existe en effet une superposition entre le set des gnes surexprimŽs aprs knock down de Tet1 et celui des gnes surexprimŽs dans les cellules inactivŽes pour PRC2. Ces donnŽes sont en faveur dÕun r™le potentiel de Tet1 dans la rŽpression liŽe ˆ PRC2.128 De plus, la capacitŽ ˆ se lier ˆ la chromatine des membres du complexe PRC2 est diminuŽe dans les cellules inactivŽes pour Tet1 suggŽrant un r™le de Tet1 dans le recrutement de PRC2. Bien quÕaucune interaction stable entre Tet1 et PRC2 nÕait ŽtŽ pour lÕinstant dŽmontrŽe,124,128 on peut supposer que Tet1 facilite indirectement la liaison de PRC2 ˆ la chromatine en diminuant les niveaux de mŽthylation de lÕADN aux niveaux des gnes associŽs ˆ PRC2 (Figure 6A).

¥ en recrutant directement le complexe de co-rŽpression Sin3A.124 Il a en effet ŽtŽ montrŽ une interaction directe de ces 2 protŽines ainsi quÕune superposition entre les gnes surexprimŽs aprs knock down de Tet1 et ceux surexprimŽs aprs knock down de Sin3A (Figure 6B).

Durant la diffŽrenciation des cellules ES, lÕexpression de Tet1 diminue, entra”nant une levŽe dÕinhibition et la transcription de ces gnes.

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Par ailleurs, Tet1 exerce Žgalement la fonction dÕactivateur transcriptionnel pour dÕautres gnes. Les effets sur lÕactivation de la transcription sont moins prononcŽs que sur la rŽpression. Il nÕexiste en effet pas de corrŽlation directe entre les gnes rŽprimŽs aprs knock down de Tet1 et ceux avec de profondes modifications de leurs niveaux de 5hmC et 5mC.124 Tet1 semble activer lÕexpression de deux types de gnes :

¥ les gnes dits de mŽnage riches en ”lots CpG : Tet1 empche une hypermŽthylation aberrante de leurs ”lots CpG pour quÕils restent ˆ lՎtat actif aussi bien dans les cellules ES que dans les cellules plus diffŽrenciŽes (Figure 6C).121

¥ les gnes de pluripotence pauvres en ”lots CpG : au cours de la diffŽrenciation normale, ces gnes subissent une mŽthylation de novo et sont ainsi rŽprimŽs (Figure 6D).115,121 Tet1 les protge de la mŽthylation dans les cellules ES.

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En rŽsumŽ, Tet1 se lie principalement ˆ des promoteurs riches en ”lots CpG qui sont pour la plupart hypomŽthylŽs, suggŽrant que Tet1 joue un r™le important pour maintenir les ”lots CpG ˆ lՎtat dŽmŽthylŽ dans les cellules ES. Les ”lots CpG sont en thŽorie protŽgŽs de la mŽthylation par des niveaux ŽlevŽs de trimŽthylation de H3K4 (H3K4me3), connue pour inhiber sŽlectivement le recrutement des Dnmt de novo.129,130 NŽanmoins, la dŽrŽgulation de la mŽthylation de H3K4 ou lÕaugmentation de lÕactivitŽ des Dnmt peut entra”ner la mŽthylation aberrante des ”lots CpG. Williams et al 121 proposent que Tet1 est ˆ lÕorigine de la conversion des 5mC en 5hmC, puis un mŽcanisme de dŽmŽthylation active ou passive conduit ˆ restaurer lՎtat dŽmŽthylŽ des ”lots CpG. Ainsi la protŽine Tet1 serait impliquŽe dans un processus haute fidŽlitŽ de rŽgulation de la mŽthylation de lÕADN en prŽvenant lÕaccumulation de mŽthylation aberrante des ”lots CpG (Figure 7).

Figure 7 : R™le de Tet1 dans la maintenance du processus de mŽthylation/ dŽmŽthylation des cellules ES murines.121

1.4.3.2.

R™le de Tet2 dans les cellules ES murines

Tet1 et Tet2 sont tous deux exprimŽs dans les cellules ES.120 Au cours de la diffŽrenciation des cellules ES, leur expression diminue, alors que celle de Tet3 augmente. Inversement, lÕexpression de Tet3 diminue alors que celle de Tet1 et Tet2 augmente lors de la reprogrammation de fibroblastes en IPS (Induced Pluripotent Stem cells). Ces donnŽes indiquent que Tet1 et Tet2 sont associŽs ˆ un Žtat de pluripotence.120

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La diminution de lÕexpression de Tet2 par RNA interfŽrence entra”ne une diminution du niveau de 5hmC dÕenviron 40 ˆ 50%, ce qui est comparable ˆ la rŽduction provoquŽe par lÕinactivation de Tet1. La diminution combinŽe de lÕexpression de Tet1 et Tet2 conduit ˆ une baisse de 75-80% du niveau de 5hmC, indiquant que Tet1 et Tet2 sont ˆ lÕorigine de la plus grande partie du pool de 5hmC dans les cellules ES.120

Seuls 3 groupes ont tentŽ de prŽciser le r™le de Tet2 dans les cellules ES. Ito et al105 ont montrŽ que le knock down de Tet2 ne modifiait pas la morphologie des cellules ES murines. LÕanalyse par RNA seq de double knock down Tet1-Tet2 dans des ES murines indique que plusieurs gnes de pluripotence sont rŽprimŽs en lÕabsence des protŽines Tet.125 Enfin, lÕinactivation de Tet2 seule par ShRNA tendrait ˆ biaiser la diffŽrenciation des cellules ES vers le neuroectoderme.120

Compte tenu du faible nombre dՎtudes, il est difficile de tirer des conclusions. Ces rŽsultats semblent suggŽrer que la protŽine Tet2 nÕest pas indispensable ˆ la pluripotence des cellules ES mais pourrait jouer un r™le dans la diffŽrenciation normale des cellules ES. A la diffŽrence de Tet1, aucune Žtude nÕa pour lÕinstant dŽterminŽ quels Žtaient les gnes associŽs ˆ Tet2 dans le gŽnome des cellules ES et quel pouvait tre le r™le de Tet2 (activateur ou rŽpresseur) sur la rŽgulation transcriptionnelle de ces gnes.

1.4.4. R™le de Tet3 dans le zygote

Tet3 est bien exprimŽ dans les ovocytes et les zygotes unicellulaires, contrairement ˆ Tet1 et Tet2.105

Par des techniques dÕimmunoprŽcipitation utilisant des anticorps spŽcifiques des 5mC et 5hmC, il a ŽtŽ montrŽ que le niveau de 5mC du pronucleus paternel diminue rapidement

juste avant la premire division131,132 alors que le niveau de 5hmC augmente au moment de

la premire division.133,134 Ce phŽnomne semble du ˆ l'activitŽ de Tet3, dont l'expression est forte dans les ovocytes et les zygotes unicellulaires mais rapidement en diminution aprs le stade Ç 2 cellules È. Des analyses en immunofluorescence confirment en effet que juste aprs la fŽcondation, Tet3 se dŽplace du cytoplasme zygotique vers le pronucleus paternel135 o il y convertirait les 5mC en 5hmC (Figure 8).

Le gŽnome maternel est quant ˆ lui protŽgŽ de la dŽmŽthylation et conserve un haut niveau

de 5mC136 jusquՈ la premire division. Son niveau de 5hmC reste bas durant les premires

divisions et jusquÕau stade Ç blastocyste È (Figure 8).133,134

Aprs la premire division, les 5mC du gŽnome maternel et les 5hmC du gŽnome paternel sont progressivement perdues par un phŽnomne de dilution liŽe ˆ la rŽplication.115,137 Puis

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les profils de mŽthylation sont rŽtablis par lÕactivitŽ des DNA mŽthyltransfŽrases de novo Dnmt3a et Dnmt3b (Figure 8).138

Figure 8 : Evolution des niveaux de 5mC et 5hmC des gŽnomes maternel et paternel durant le dŽveloppement prŽ-implantatoire.115 TE : trophoectoderm. ICM : inner cell mass.

Afin de mieux caractŽriser le r™le de Tet3, le groupe de Gu et al135 a dŽveloppŽ un modle conditionnel dÕinvalidation hŽtŽrozygote, la dŽlŽtion homozygote Žtant lŽtale au stade nŽonatal. LÕinactivation de lÕallle maternel de Tet3 conduit chez le zygote ˆ une rŽduction de la dŽmŽthylation de loci spŽcifiques du gŽnome paternel comme les transposons Line1 et certains gnes de pluripotence (Oct4 et Nanog).135 LÕinactivation de Tet3 ne semble pas avoir dÕeffet sur la maturation des cellules germinales maternelles, sur la fŽcondation ou la prŽ-implantation. NŽanmoins la dŽlŽtion de Tet3 dans des cellules primordiales germinales maternelles ou dans des ovocytes en croissance entraine aprs fŽcondation, des anomalies du dŽveloppement embryonnaire. Ces rŽsultats suggrent que la perte du Tet3 maternel retarde lÕactivation de lÕallle paternel de gnes importants pour le dŽveloppement et plus

globalement bloque la reprogrammation du gŽnome paternel.135

Au total, Tet3 joue donc un r™le critique dans la reprogrammation ŽpigŽnŽtique du zygote en initiant la conversion des 5mC en 5hmC.