1.4. Protines TET 17 !
1.4.5. Rle de TET2 dans lÕhmatopose 27 !
1.4.5.1. Expression de
Les 3 gnes Tet sont exp variables. De faon globale, T
Si lÕon sÕintresse plus prcis les progniteurs immatures LSK progniteurs mylodes ; elle res granulocytes matures. Tet2 expression augmente dans les pr dans les cellules B matures. LÕexp des progniteurs T doubles nga dans les doubles positifs CD4+CD simples positifs CD8+ (Figure
Figure 9 : Expression des membres mthode de RT-PCR quantitative. GMP : granulocyte-monocyte progen lymphoid progenitor ; ESC : embryo positive ; DP : CD4+CD8+ double po positive.
ET2 dans lÕhmatopose
ression des Tet au cours de lÕhmatopose murine
sont exprims au cours de lÕhmatopose mais Tet2 est plus exprim que Tet1 et Tet3 (Figure plus prcisment aux diffrents lignages, Tet2 est bien tures LSK (Lin-Sca+Ckit+) ; son expression se main elle reste leve dans les monocytes mais dim sÕexprime dans les progniteurs lymphodes c ans les prcurseurs B prcoces de la moelle osseuse ures. LÕexpression de Tet2 diminue durant le dveloppe ubles ngatifs du stade DN1 DN4 puis son express fs CD4+CD8+ et simples positifs CD4+, elle tend dim Figure 9).139
membres de la famille Tet au cours de lÕhmatopo antitative.139 LSK : Lin-Sca+Ckit+ ; CMP : common
progenitor; MEP : megakaryocyte-erythroid progenitor embryonic stem cell ; DN : double negative ; ISP double positive; CD4+SP : CD4+ simple positive; CD8+S
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murine
mais des degrs Figure 9).
est bien exprim dans n se maintient dans les mais diminue dans les des communs ; son lle osseuse puis diminue dveloppement prcoce n expression augmente tend diminuer dans les
se murine selon une mon myeloid progenitor ; progenitor; CLP : common ; ISP : immature simple ; CD8+SP : CD8+ simple
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1.4.5.2. Analyse in vitro par des approches de RNA interfrence
LÕinactivation de TET2 in vitro par des approches de RNA interfrence (siRNA ou shRNA) a permis de mieux comprendre son rle dans lÕhmatopose.
Le knock down de TET2 entrane :
¥ dans les progniteurs hmatopotiques prcoces murins,139 lÕexpansion et la diffrenciation des monocytes-macrophages en prsence de G-CSF et G-MSCF. ¥ dans les progniteurs hmatopotiques prcoces humains,140 une diffrenciation
anormale avec expansion du lignage mylomonocytaire aux dpens de la lymphopose et de lÕrythropose.
De plus, le knock down de Tet2 dans des cellules primaires de moelle osseuse de souris par Sh ou SiRNA conduit aprs culture en mthylcellulose et/ou en milieu liquide, une augmentation du pourcentage de cellules CKit+. La perte de Tet2 permet donc de maintenir les cellules dans un tat plus immature.54,141 Moran-Crusio et al ont montr galement que les cellules invalides pour Tet2 supportaient plusieurs passages in vitro, suggrant un effet direct de la perte de Tet2 sur lÕautorenouvellement.141
1.4.5.3. Analyse in vivo par des modles murins dÕinvalidation de Tet2
Le rle de Tet2 au cours de la diffrenciation hmatopotique a t tudi dans divers modles murins dÕinvalidation de Tet2,141-146 dont deux dvelopps au laboratoire.144
Cinq modles viables ont t actuellement publis et ont permis dÕanalyser le rle de Tet2 au cours de lÕhmatopose adulte (Figure 10) :
¥ un allle Ç gene trap È avec une cassette LacZ-GFP au niveau de lÕATG du gne dans lÕexon 3143
¥ un allle Ç gene trap È avec une cassette LacZ dans lÕintron entre les exons 9 et 10144 ¥ un allle conditionnel Lox-Lox ciblant lÕexon 3 (le premier et le plus grand exon
codant)141
¥ un allle conditionnel Lox-Lox ciblant lÕexon 11 (qui code pour la moiti du domaine catalytique de lÕenzyme)144
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Figure 10 : Reprsentation de la structure du gne Tet2 et des diffrentes rgions cibles par les modles murins dÕinvalidation de Tet2. Les losanges indiquent les sites dÕinsertions des cassettes Ç gene trap È ; les flches horizontales montrent les sites Lox. Les deux modles dvelopps au laboratoire sont indiqus en orange.La perte de fonction de Tet2 est associe une baisse du niveau global de 5hmC dans les cellules hmatopotiques murines.142-144
Tous les modles murins dÕinactivation de Tet2141-146 prsentent globalement le mme
phnotype : amplification du compartiment des progniteurs multipotents et cellules souches hmatopotiques, augmentation des capacits dÕautorenouvellement (passages des cellules in vitro et greffes comptitives), hmatopose extra-mdullaire (splnique essentiellement), anomalies des diffrenciations mylode, lymphode B et T.
Avec une latence variable selon les modles (8 20 semaines), une fraction des souris invalides pour Tet2 dveloppe une maladie ressemblant la leucmie mylomonocytaire
chronique humaine (monocytose persistante, splnomgalie, dysplasie de plusieurs lignes
mylodes). Bien que ce soit la pathologie prdominante, dÕautres maladies ont t dtectes comme des syndromes mylodysplasiques prdominance rythrode ou des syndromes myloprolifratifs.143
Ces tudes confirment le rle suppresseur de tumeur de Tet2 et indiquent que sa dltion est suffisante pour permettre la transformation mylode. Cependant la latence de dveloppement suggre que des lsions gntiques additionnelles cooprent probablement avec la perte de Tet2.
Les souris htrozygotes pour Tet2 dveloppent les mmes maladies,141,144 suggrant
un effet dÕhaplo-insuffisance, ce qui est cohrent avec le fait que les patients sont souvent porteurs dÕune seule mutation TET2.
Bien que les trois gnes Tet soient exprims dans les progniteurs hmatopotiques, la perte de Tet2 nÕentraine pas dÕaugmentation de la transcription de Tet1 ou Tet3.141-144 Ces
donnes indiquent que la rduction dÕune des protines Tet est suffisante pour entraner des changements dans le niveau de 5hmC et le dveloppement de maladies mylodes. Ceci pose la question de la redondance fonctionnelle des protines Tet et incite explorer le rle de chacune de ces protines dans les cellules hmatopotiques.
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Outre les 5 modles murins dÕinvalidation de Tet2 prcdemment dcrits, un 6me modle a permis dÕtudier le rle de Tet2 au cours de lÕhmatopoise fÏtale. Deux groupes145,146 ont utilis ce modle qui comporte un allle Ç gene trap È avec une cassette LacZ situe dans lÕintron 2 juste en amont de lÕexon 3.147 Ces souris ont une mortalit prinatale importante et la plupart des individus ne vivent pas plus dÕune semaine. La cause exacte de cette surmortalit nÕest pas connue. Les auteurs ont donc essentiellement tudi lÕhmatopose au niveau du foie fÏtal. Les anomalies retrouves au niveau du foie fÏtal sont identiques celles observes dans la moelle des souris des autres modles dÕinactivation de Tet2, savoir : diminution du niveau de 5hmC, expansion des compartiments des LSK, progniteurs multipotents et mylodes, augmentation de lÕautorenouvellement, anomalies de diffrenciation mylode.145,146
1.4.5.4. Consquences des mutations TET2 chez les patients
Les mutations de TET2 observes chez les patients sont associes une diminution de lÕactivit catalytique de TET2 et un taux plus bas de 5hmC.139,140,148 En revanche, les consquences des mutations de TET2 sur le profil de mthylation du gnome restent dfinir. Certains dcrivent une signature pigntique de type hypermthylation avec une cinquantaine de rgions diffrentiellement mthyles.54 Pour dÕautres, la perte de fonction de TET2 est associe une diminution globale de la mthylation.139 Il faut noter que les cohortes analyses ne sont pas comparables (398 patients avec leucmie aigu mylode au diagnostic54 versus 88 patients avec des pathologies mylodes diverses (LMMC, LAM, SMP, SMD)139) et que les techniques dÕanalyse de la mthylation diffrent entre les deux tudes.
Les mutations IDH1 R132 ont t initialement rapportes chez des patients atteints de gliomes ; elles affectent plus de 70% des cas de tumeurs crbrales de bas grade (telles que les astrocytomes) et de glioblastomes secondaires drivant des tumeurs gliales de bas grade.149-152 Puis des mutations dÕIDH1 mais aussi dÕIDH2 ont t dcrites chez les patients atteints dÕhmopathies mylodes : leucmies aigus mylodes (LAM) de novo et secondaires (15 30% des cas),153-156 syndromes mylodysplasiques (SMD) et syndromes
myloprolifratifs (SMP) (5% des phases chroniques et 20% des formes transformes).154-159
Chez les patients atteints de LAM, il a t rapport que les mutations de TET2 et dÕIDH1-2 sont mutuellement exclusives.44,45,47,54 Ceci a conduit plusieurs groupes sÕintresser au lien potentiel entre ces 2 protines et leur participation au processus de transformation.
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Les enzymes IDH sont des enzymes dpendantes du NADP, qui catalysent la dcarboxylation oxydative dÕun isocitrate en !-ketoglutarate ou oxoglutarate,150,155 ce dernier tant un des cofacteurs des enzymes de la famille TET. Les mutations IDH1 et IDH2 sont des mutations dites Ç gain de fonction È. En effet, les mutants IDH1 et IDH2 acquirent une
nouvelle fonction enzymatique : elles transforment lÕ!-ktoglutarate en 2-
hydroxyglutarate.153,156,160 LÕhydroxyglutarate vient antagoniser lÕoxoglutarate et inhibe la fonction enzymatique de TET2, conduisant une rduction de lÕhydroxymthylation.54,161 Par ailleurs, les mutants TET2 et les mutants IDH se caractrisent par une signature commune dÕhypermthylation.54
LÕexpression ectopique de mutants IDH in vitro ou le knock down de Tet2 par ShRNA ont les mmes effets sur la diffrenciation hmatopotique, savoir une augmentation du compartiment des progniteurs / cellules souches et une inhibition de la diffrenciation
mylode normale.54
Au total, les mutations IDH1-IDH2 et la perte de TET2 partagent un mme mcanisme de transformation caractris par une diminution de lÕhydroxymthylation.