Production, purification et caracterisation d'hemolysines de Treponema hyodysenteriae

(1)

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PRCDUCl'ICN, PURIFlCATlOO El' CARJlCI'ERISATICN D' HEM)LYSINES DE 'l'REPCX'ID1A HYWYSENl'ERIAE

par

BENJ!T PICARD

Thèse soumise à la faculté des étudès' graduées,

et de la rechercœ â titre d'exigence partielle

en vue de l'obtention d'un diplâœ de

Docteur en Philosophie (Ph.D.)

Départeœnt de L-ticrobiologie

campus Macdonald de l'Université M:Gill

lvbntréal, Québec 1 canada

e

B. Picard

août 1984

- ,

..

(2)

..

....

(

Ph.D. BEIDrr PICARD Microbiologie

PRŒ>OCTICN, PURIFlCATICN El' CARACTERI~TIOO

D' HE-DLYSINES DE TREPONEMA HYŒ>YSENIERIAE

Les conditions de prcduction, en milieu liquide, d'activit€

_,

hém:>lytique par des cellules proliférantes de Trepcl!'lEma hycx:1ysenteria.e

et de Treponsna. imocens sant décrites.

?\

pertir d'une culture de

!.'

hyodysenteriae effectuée avec l' addi ~on d'acide ribonucléique, deux hénolysines sont dérontrées

dans ie surnageant. Pour chacune d' elle, une métb::xie de purification

est proFCsée penœttant l'obtention de deux prép3.ration h€rrolyt~ques

h:m:lgènes' en filtration ITOiéculaire et en électropll:?>r~se. U_ne

héIrolysine est associée à l'acide rib::mucléique (HN) tarrlis que

l'autre est associée à l'albumine sérique bovine (HP). Elles

pë!rtagent certaines propriétés cœmunes: leur synthèse est .inhil:ée _,0 _~ _, par le chloramphénicol, elles ne sont ni protéolytiqùes, ni

phospholipas~ques, ni sensibles à l'oxygène; leur act\v~té ne

nécessite pas de

cat~ons

bivalents et est insensible à\Jeffet de l'EDTA; elles lysent toutes les espèces dl érythrocytes testées

(boeuf, cheval, lapin, flOU ton et FOrc). Elles diffèrent par la

(3)

t

(

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,

.

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la stabii'ité il. la t:enpl!rature et il. dilfêrents pH ainsi

t

pal; le

tÏPe

de sensibilité aux enzyrœs protéol}tiques. .-

'~

LI isolanent et l'utilisation d' lUle souche IlU.1tante nan-hémolytique

a penni.s de démJntrer une relation entre la p:rte du pJUVOir

f

térolytique et la perte du IXJUVoir entérotaxique dans des segments

ligaturés d' intestin grêle de lapin.

(4)

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Ph.O. BEWIT PICARD Micrd:>iology

PlUX.L'TIOO, PURIFICATION AW CHAAACTEru:ZATION

OF HEM)LYSms FRœ 'l'REPCNF.MA HYCDySEN!'ERIAE

'!he corili. tions by which the pMuction, in liquid tœdia, of

~stances with he!rolytic activity by growin:J cells of Trepanera

hJ'C?C!Xsenteriae arrl Treponana innocens are described.

FrOn a culture broth of T. hycrlysenteriae to which ril:xj>nucleic

1

acid has been added at inxulation t.ime, t\IO harolysins are sh:lwn

in the supernatant. For each of then, a p.rrification schare allowi.n;

the obtention of an h::Irogeneous harolytic preparation by gel

filtra-tion

am

electropooresis, is proposed. One harolysin is asscx::iated

with rilimucf acid (!lN) while the other is, associated witll. txwine

serum a1.burnirl (HP).

'l'hE:y

share sane properties: their synthesis is blockec1 by chloramphenicol, they do net have proteolytic or

phos-pholipasic activities, they are insensitive ta oxygen.and the+r

activity does not require bivalent cations or is sensitive ta

,

~-.

EDTA' 5 actioni they are lytic to aH red blcx::d. ce11' s type tested

(beef, herse, pig, rabbit, sheep). They differ by'ttle size of

tpeir awarent rrolecular weight, their rrcde Qf action, the

stabi-lit Y of their activity to temperature and pH and, their pattern

of sensitivity to proteolytic enzymes.

"

,

1

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1 1

1

~ 1 1 1 i , • i 1

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(5)

• VI

'n1e isolation of a no.n-he!!olYtic nutant strain

of T. hycdysenteriae ans its use in a rabbit's ligated

ileal loop IOOdel bas s~ that there is a relation

between the loss of the hEIoolytic activityand the loss

of the enterotaxic activity.

•

,

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l, t ~ '. 1 Il, _ )1. Il UUll . . . . 1 ( 1 1 %GU;;4 0 _ : un if ']

.

L'auteur d~sire re~ercier toutes les personnes qui

ont cQntribu~, de pr~s ou de loin, à la r~alisation de ce

travàil et particuli~remeht:

Feu le docteur Sa;ir,A. sah~, avec qui j'ai

effectué sous sa direction la majeure partie de ce projet,

1 {

pour m'avoir initié

a

la recherche en bactériolog~H des

anaérobies et avoir été mon mentor.

1

Le·do~teur Réjean Beaudet, professeur au éentre 1 de recherche en baatériologie de llInstf-tut Armand Frappis+"

1

pour m'avoir guidé dans la derni~re phase de cette recherche

.

et m'avoir prodigué de judicieux conseils pour la

présenta-"

tion de cette th~se.

---Les docteurs Robert A. McLeod et Roger Knowles

qui furent, tour

A

tour, directe~r du. département de micro-f

biologie du campus Macdonald de l'Université McGill"

pour m'avo~r permis l'accês

A

une formation acaaémique

sans nulle autre pareille au Canada.

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1

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~ ~ ~ ~ ... If~~~'i --jto:.:: ~..4-'t"1-~~'-~f-~""'f!!.t'~~""1'l!~"....j~""~"'"III.~3Ui'SIl'~:atÇCJ~~H;;;"~&.!.~fiI?,11t5~~J(j.lfll aw.

,

t .Le docteur Vincent Portelance, directeur du

..

Centre de recherche en bact~~iologie de l'Institut

Armand-Frappier, et le docteur Aur~e Beauln~s,

(lirecteur de l ' Insti tut Armand-Frappier, po'ur m'avoir

permis de participer, en tant qu'étudiant, à la vie

de cette institution de savoir et

_.

d'e~seignement.

.

_ Madame Nicole Daigneault-Sylvestre et

monsieur Serge Durand qui furent techniciens assignés

au docteur Saheb et qui f.urent pour moi des camarades,

collègues et des enseignants très appréciés.

___ -.", 1

M~s collègues étudiants gradués du Centre de

recherche en ~actériologie (Richard 'Degré, Daniel

Dubreuil, Michel Frenette, Lucie Lafond et André Morin)

avec qui j'ai pu partager les hauts et les bas de la

vie d'un étudiant-chercheur et à qui je garde toute

-mon amitié. VIII • 1 _ _ _ _ _ _ _

"

.

(8)

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A_Ids: 2 52LPiaMas . _ _ tlbU 4%1 e Il ASa a ₁ ₁ ₁

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.

CONTRIBUTIONS

.

A~L'AVANCEMENT DES CONNAISSANCES

!

1. L'amli1iorati'on

dès

conditions de culture perme'ttant .

.

la croissance et la production' h~molytique de

T. hyodysente.riae addïtionn~ d'ARN • .' '

.

,

2. La mise en ~viden~e de ~'effet. de l ' addition d' ARN

"

----

---'_ ...

--et d' Allli-core sur la produ~tion l1êmolytique de

.

~

• l , 'il

T. ~nnocens.,

3. La mise ~ën évidence' de l'effet _,

.

de l ' addi tion' de

peptone phytone. et d'ARN-core sur ·la production

h€molytique _d~ ~. hyodysenteriae.

4. L'€laboratlon d'une m~thàde de purification,de

l' hli!molysine HN.

,

.

5. La mi se en' évid';:nce de la ·p;rêsence \, d' une _.

deuxi~me

,

hémolysine dahs .les su;rnagiants d~ éulture de

T. hyodysenteriae

addition~é

dJARN

"

6. L'~laboration d'une méthode de purification de

Il

_.

t.

.

l' hémolysin~ HP.

7. La mise en évidepce de la relation qui existe' entre

... ,

l'albumine sérique 'povine et le complexe' HP.

8. L'€tude comparative des caract~ristiques des hêmolysines

HN et HP. -,

9 L" isolement d'une souche mutante de -

!t.'

:hyodysenteriae

" non' hémolytique. ,... o "

.

,

.

'-... i

(9)

t

,

\

10. La mise en €vidence de la relation qui existe entre

la perte de pouvoir hémolytique et la perte du pouvoir

entérotoxique de

!.'

hyodysenteriae dans ~es segments

ligaturés d'intestin grêle de lapin.

! ,1

.

!

•

x • 1

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(10)

'.

Il

TABLE DES MATIERES

RESUME •..

ABSTRACT ...•....

REMERCIEMEN1'S .. i .

~

CON~RIBUTION

_,

AU PROGRES DES CONNAISSANCES.

_,

, ,

.

TABLE DES MATIERES.

l

..

'

LISTE 'DES TABLEAUX.

. ... .

LIS~E DES FIGURES ••

.

"

..

. ...

'"

... .

~REVIATIONS •••••••••• •. *8* • • • *, • • ,. • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1. II. 'IÎido INTRODUCTION •.. ~~ •• ~ ..•. REVUE DE LITTERATpRE ••.••

.

. .

.

...

... 2.1 Les spiroch~tes ~G • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 2.1.1 position taxonpmique ••••• i . h

2. 1. 1. 1 Le genre, Spl.roc aeta •••••.•••••••••.•••••

.

' 2 . 1 • 1. 2 Le genre '. c'tiSj!ispira • • • • • . . . .. 1 2.1.1.3 Le genre Treponema .••••

.

. .

. . .

. .

.

. . . .

. .

.

2.1.1.4 Le genre Borre1i,a •••••• 2.1.1.5 Le genre Leptp~pira •••

...

2.1.2 Les trépon~mes pathog~nes et non

pathog~nes ..•

. . . .

. .

.

_"

, '

2.1.2.1 T. hyodysenteria~: •.

...

2.1.2.1.1 Eti~logie de la dys~nterie porcine •.•••

10 10

1.0

2.1.2.1.2 Epidé~iologie de la dysenterie porcine. 13,

(11)

(

XII Page 2.1.2.1.3 Aspects de la pathogénie de la dysenterie porclne... 15

2.2 Les toxines bact€riennes... 18

2.2.1 Types de localisations cellulaires

(Raynaud et Alouf, 1970) •••...•.••... 19

2.2.1.1 Les endotoxines de nature prot€ique... 19

2.2.1.2 Les toxines prot€iques v€ritab1es

(Raynaud et ai., 1955a) •.•••• " •• '. •••• . • • 20

2.2.1.3 Les toxines protéiques que l'on retrouve

~ la fois dans le milieu extrace11ulaire

et dans la cellule ,bactérienne pe~dant

la phase active de croissance •.••••••.•• 2.2.1.4 Le complexe toxique

protéino-" polysaccharidique de la paroi des

21

bactéries à Gram n€gatif ••••. -. • • • • • • • • . • 21

2.2.2 Classification mu1tifactorie11e... 22

2.2.2.1 Les phosphplipases hémolytiques.~... 29

2.2.2.2 Les hémolysines activées par les

r

groupements thiols.... •••••••••••••••••• 33

2.2.2.3 Les toxines non classifiées:... 35

iii l D

, ~,

• 1

(12)

r

!-' f '. ; , ~ ... ,,,"l'1ftrlfP~-n'~!~PWf;9(.lttCf''Q~~J::;;wt''-g$4i #r':;-W#)U~M.#;{~.'v."""~~lIJlt"'tt~~~WJI .. _~~~.,.:,,, ___ _ JI

(

• c

2.2.3 Les hémolysines chez les spiroch~tes •••••••

2.2.3.1 Le genre Leptospira ••••.••..••••••••••••• 2.2.3.2 Le genre Treponema •.••.•••••••••••••••••• III. MATERIEL ET METHODES •••••.•..••••...•.••••••••••. 3.1 Production d'activité hémolytique •••••..••••.

3.1.1 Souches ~actériennes •..•••••.••••••••••••••

3.1.2 Milieux de culture ••••••••••••..•••••••.•••

3.~.2.l Milieu solide •••••••.••.•••...•••••••••••

.

3.1.2.2 Milieu liquide pré-réduit s~ériiisé de

façon anaérobie (PRSA) ••••••• ,~ •••••••.•••

3.1.3 Conservation des souches ••••••••••••••••••• 3.1.4 Conditions de culture ••••••••••••••••••••••

3.1.5 Préparation des additifs ••••••••••••• 0 • • • • • •

3.1.5.1 ARN~ ARN-core . . . • . . . • . • . . .

3.1.5.2 Peptone phytone •••• ," ••••••••••• " " •••••••• 3.1.6 Enumération bactérienne •.•••••••••••••••••• 3.1.6.1 Compte des unités viables •••••••••••••••• 3.1.6.2 Enumération microscopique (Schenberg,

1967) . . . • . • • . . . . • • . . . • . . • . . . . • . 3.1:7 Dosage de l'activité hémolytique •••••••••.•

XIII

(13)

c "

XIV

Page

3,.1.iV • .1 Préparation de la suspension

d'érythrocytes . . . . 51

.

3.1.7.2 Détermination du titre hémolytique... 51

3.1.7.3 Calcul du tltre hémolytique... 52

'3.2 Purification des hémolysines . . • . • . . . . • . . . 5.3

3~2.l Hémolysine associée à l'ac~de

ribonucléique (HN) . . . • . . . •

a...

53

3.2.1.1 Centrifugation du milieu de culture •.•...

3.2.:1.'.2 Préc"ipitation acide •... , . . . • . . • . .

3; 2 . 1. 3 Précipitation au sulfate d' arrrronium . . . • . . . .

53

54 54

3.2.1. 4, ,Dialyse et lyophilisation... 54

,

3'.2.1.5 l\dsorption sur DEAE Sephacel . . . ,. . . 55

3.2.1.6 Filtration moléculaire sur Ultrogel

" il

AcA 44 . • • • • • • • • • • • • • • • • . • • • • • • • • • • • • • • • • •

3.2.2 Hémolyslne associée à une fraction

'A

56

prdtéique (HP)"... 56

3.2.2.1 Gentrifugation du milieu de culture... '56

3 . 2 . 2 . 2 préc~pltatlon au sulfate cl' arrrronium. . . . . . 57

3.2.2.3 Filtration moléculalre sur Sepharose 6B.. 5~

3.2.2.4 Stabilisat,i.on de l'act.lvité hémolytique

(14)

L

3.2.3 Estimations de la composition chimique •••••

3.2.3.1 Prot~ine ••••••••••••••.•.••••••.•••••••••

3.2.3 .. 2 Acide ribonucléique ••..• : .... , •••••••••• • ,.t

3. 2 • t3 • 3 Sucre . . . .

3.2.4 Critères d'homogénéit~ •...•••••••••••••••..

3.2.4.1 Filtration moléculaire ••.••••••••••••••••

3.2.4.~ Electrophorèse en gel de polyacrylamide •.

3.-.f.4.3 Electrophorèse en gel de

polyacrylaihide avec SOS ••••••••••••••••••

3.2.4.4 Electrophorèse en gel d' agarose ••••••• ' •••

3.2.4.5 Coloration des gels . . . )

3.2.4.6 Détermin~ion de l'identitê antigénique

xv

' g e 59 59 59 60 60 60 60 61 61 61

par immunodiffusion radiale... 63

3.3 Carkctéri'sation des activités' h'êmo1ytigtres ••. 3.3.1 Cinétique de production ••••.•••••••••••••••

64 64

3.3.2 Cinétique de l'activité hémolytique... 65

3.3.3 Mode d'action des h~molysines: effet de ?

la température... 65

•

3.3.4 Stabilité des hémolysines ~ différentes

températures et, cinétique d'inactivation." 66

3.3.5 Stabilité au pH... ·67

,1

ï

-1

1 f 1 l, 1

(15)

/ XVI

Page

"3.3.6 Effet àes èations bivalents et ,de l'EDTA... 68

3.3.7 Effet des phospholipides et du

cholestérol sur l'activité des hémolysines

HN et HP... 68

3.3.8 Effet de différents enzymes sur l'activité

.. h~rnolytique ••...••••..• •••••••••••• ~... 69

3.3.9 Effet du chloramphénicol sur l'évolution de

d'activité hémolytique... 71

3.3.10 Détermination du spectre hémolytique... 71

3.3.11 Estimations du poids moléculaire apparent. 72

3.3.ll.l·Filtration moléculaire... 72

3.3.11.2 Electrophor~se en gel de polyacrylamide

avec SDS •••.••••••••• • "'. • • • • • • • • • • • • • • •.• • • 73

3.3.12 Détermination de l'identité antigénique de

l'hémolysine HP par immunodif~usion

.

radiale . . . " .. ~ . . . . 74

3.3.13 Na~ure de l'activité hémolytique... 75

3.3.l3~1 Effet d~un agent réducteur... 75

3.3.13.2 Détermination du pouvoir protéolytique.. 75

3.3.1'3.3 Détermination d' une activité

phospholipasique. • • • • • . • • •.• • • • • • • • • • • • • • 76

3.4 Infection expérimentale ~ ~ se~ents

<-

ligaturés d'intestin grêle de lapin ... . 77

1

(16)

,

f,

~

.

XVII ~ ~-"

('"

.

~

-Page IV. RESULTATS •••.••. _ • . . • • . . . • • • . • . . • • . . • • • • . . • . . • • . . .

,

r

4.1 Production de l'activité hémolytique ..• ~~ ••.

~

79

f

4.1.1' T. h:l0d:lsenteriae en milieu de base . . .

4.1. 2 T. hxodxsenteriae avec addition d'ARN •...••

4.1. 3 T. hyodxsenteriae avec addition d'ARN-core.

4.1. 4 T. innocens en milieu de, base . . .

4.1. 5 T. innocens avec addition·d'ARN ••.•••..••••

4.1.6 T. innocens avec adqition d·ARN-core ...• 4.1.7 T. hyodysenteriae avec variations de la

composition en peptones du milieu de

79 81 82 82 82 96 culture . • . . . • . . . • · •....••...•.• 87

4.L.B'!~ hyodysenteriae avec variations de

l'agitation et de la température

. d'incubation . . . 4 • • • • • • • • • • • • • • ~... 91

4.l.~.1 Effet de 1'agitation dg milieu de cultu~e •. 91 4.1. 8.2 Effet de la température; d' incuba'tion ...•. ' 93 4 • l • 9 S ornrna ire. . . . . . . .. . "'.,. . . . .. .. .. . .' . . .. . . .. .. .. . . . .. . .". 9 3

4.2 Purification de l'activité hémolytique . . . • . 95

~ ~---

--~~~~--4'.2.1 L'a'ctivité hémolytique asso~iée à l'ARN (HN). ,95

4.2.1.1 Précipi~ation en milieu acide . . . ~ ..•• 96'

4.2.1.2 ?récï;:'l.tation au sulfate d'ar.r.oniun. ••...•••...•. 97

4.2.1.3 Chromatographie sur échangeur d'ions

(DEl'Œ Sephacel) ... : ... . • 1 . . 97

(17)

, ,

~)f.! l'~-;~ '''''~''.1~.'r'~l'-'l'1.~·f'i''':4..q,''-'S,t~ ~~""~M,t-,l-"""'!"'''I,~''l!~r~'''»~:J ~~".j."Iq..~~."..,.J.'i/~~~~ .. ifA~--r;~~"'''':~~~~_~-'

t.

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4.2.1.4 Filtration moléculaire sur Ultrogel

XVIII'

Page

AcA 44... . . . . ,.... 101

4.2.1.9 Homogénéité .de a préparation et

nature chimique •..••••.• ~... 101

4.2.1.6 Détermination d'un poids moléculaire

apparent. ,.. .. . ... . .. . . .. .. . . .. ... . .. .. . . . . 106

4.2.2 Indications sur la prés~nce d'une seconde

hémolysine. . . . . . . . . . . . . . . . . . 106

4.2.2.1 Cinétique d~ production des activités

ht§molytiques . . . . 109

_.

4.2.2.2 Stabilisation de l'activité hémolytique.. 110

4,.2.3 Purification de l ' hémolysine Çls~ociée A une

fraction protéique (HP)... 117

4 • 2 . 3 . 1 Précipitation au sulfate d' amroniun •••••••.•••• ~ 119

4.2.3.2 Filtration moléculaire sur Sepharose 6B.. 119

4.2.3.3 Homogénéité de la préparation et

l!ature chimique ...

t. •••.••• ...

120

4.2.3.4 Détermination d'un poids moléculaire

apparent . . . ~ . . . ,. . . . 124

~

4.2.4 Identité immunologique... 124

4.2.4.1 Entre HN et HP... 124

",4.2.4.2 Entre HP et le milieu de culture ••..•••• ~ 130

(18)

(-.'

,

.

(

v.

•

XIX

'"

,

...

•

Page -'

4.3.2

Cinétique de l'activité hémolytique... 133

4.3.3 'Etude du mode d'action •••••••• ~.... •••••••• 140

, 4.3.4 Stabilité en fonction de

1~

température et

cinétique d'inactivation... 146

.

'

4.3.5 Stabilité au pH... 146

4.3.6 'Effet des cations bivalents et de l'~DTA... 150.

4.3.7 Effet du cholestérol, et des phospholipides. 151

'"

4.3.8 Effet de traitements enzymatiques •••••••••• 151

.

4 • 3 • 9 Effet du chloramphénicol •••••• ,!, • • • • • • • • • • • • • 156

4.3.10 Nature de l'activité hémolytique... 156

4.3.11 Infection expérimentale de segments iigaturés d'intestin grêle de lapin

par

!.

hyodysenteriae et

!.

innocens... 164

DISCUSSION ••••••••••.••••••.• ~ • . . . AN'NEXE- I . . . : 168 176 , AN'NEXE

II...

177

•

AN'NEXE. I I I . . . ~ . . . , . . . l" . . . • ' . 182 ANNEXE

IV...

186 1 BIBLIOGRAPHIE . . . '. • • • • • 187

\

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1

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(19)

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~'l~ ~'~'~~f'i'" eH"""/ ~"';l<''''·(~'' , ~. ~ ... rr: .... ~~} ... :-'" ... ~,.~ rH -1 .... ~w .. "'rf!V.t'~~('!·III".f!'1~~'ti.'J...~IO,.-.. ~7't.,... ... ~~~'I"1";"~1"";.'~~,.. _" ... , t< ... ,...?"_._?' ...

-, ,

LISTE DES TABLEAUX

T~eau page

1. Classification des principales exotoxines

pro-téiques d'origine bactérienne (selon Daline et

F inch, 1 9 7 9 ) . . . 23

2. Bactéries produisant une activité

phospholipase C . . . 30

3. Spécificité de substrat de différentes

phospholipases C (M~llby, 1978)... 34

4. Espèces bactériennes produisant des toxines

cytolytiques activées par des groupementp

thiols (Alouf, 1977)... 36

5. Spectre hémolytique, apr~s l heure à 37°C de

.

surnageants de culture de différentes souches

.

'

de

!.

hy-odysenteriae (A) et de

!.

in'nocens (B)

cultivées en milieu TSB-PRSA en présence d'ARN

(1%, plv), exprimé en pourcentage de l'acti~i

té obtenue par l'espèce d'érythrocyte la plus

sensible. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

(20)

(

,-..-

...

,

.

,

Tableau.

6. Effet de l'addition de différentes

concentra-7.

tions d'ARN sur le rendement _, c~llula~re et

l'aètivité hémolytique de T. hyodysenteriae

PM 25 cultivé à 37°C en milieu TSB-PRSA •••••••

Effet de l'addition de différentes conc~tra~

,tions d'ARN-core sur le rendement cellulaire

et l'activité hémolytique de

!.

hyodysenteriae

PM 25 cultivé à 370C en milieu TSB-PRSA •....• !

,

8. Effet de l'addttion de dir'férentes

concentra-tions d'ARN sur le renaement cellulaire et _",

• l'activité hémolytique de T. innocens PA 2

page,

80

"

---83

cultivé 1 à 370C en milieu TSB-PRSA •••••••••••• ~ 84'

9,. Effet de l'addition de différentes

concentra-tions dlARN-core sur le rendement cellulai~e

et l'activité hémolytique de

!.'

innoc'ens PA 2

cultivé à 37°C en milieu TSB-PRSA... 85.

10. Effet "de la modification qualitative de la

composition en peptone (;atio phytone/

, ~

tryptone) du milieu TSB-PRSA sur le rendement

cellulaire et l'activité hêmo~ytique de

T. hyodysenteriae PM 25 ~tivé à 370C en

milieu TSB-PRSA additionné d'ARN (1%,

plv) ••••

88

1 l

1 J

1. ,

(21)

"

.

(

Tableau

11. Effet de l'ad~ition de différentes

concéntra-tions de phytone sur le rendement cel~ulaire et

" l'activité hémolytique de T. hyodysenteriae

PM 25 cultivé à 37°C en milieu TSB-PRSA

add-i-XXII' '

page

tionné.d'ARN (1%, p/v) .••••••.••.•••...•• ~.... 90

12. Effet dé l'agitation sur le rendement cellulaire

.

et l'activité pémolytique d~

!.

hyodysenteriae

PM 25 cultivé à 37°C en milieu TSB-PRSA

additionné d'ARN (1%, plv) ••... , •••.• , ..•.•• -, ,92

13. Effet de deux températures d' incubation

.

su~ le'-- . _.~

rendement cellulaire et l'activité hémolytique

de T. hyodysenteriae PM 25~ult~vé en milieu

TSB-PRSA additioh.né d' _,

ARN

(1%, plv) ••••••• '. ~ • • 94

~

14. Purification de l'hémolysine HN de

---

!.

hyodysenteriae PM 25 •••••••••••••••••••••••

..

15. Effet'de la gélatine et du glycérol sur la

stabilisation de l'activité hémolytique

_..

HP de

9,8

"

.

!.

hyodysenteriae "PM 2 5 . . . 115

16. Effet comparatif de différents sels sur la

,

stabilisation de l'ac~ivité hémolytique de

T. hyodysenteriae PM 25 .••••••••.•.••••••••••• ' 116

--.,...

'. o •

.

' ,

.

(22)

.

--, , 1 • _ 0

t

" 0',

(

..

", ,

.

~ -~~-~----.... -~-~--~- --~-~._-~-

.

__

... _---~-- -..-.

- -

.... --~-- -~ ~---.-.-...---XXIII Tableau page , 17. Purification de l'h€molysine HP de 18

,

T. hyodysent.er i'ae P~f 25~' ;-. : ••••••••••• ~ ••••••• o

Spectr~ h€molytique des hémolysines purifiéès

HN et HP deoT. hyodysenteriae PM 25, exprim€

en pourcentage de

l'activi~)hémOlyti~ue

obte-nue par l'esp~ce d'érythropyte,la plus $ensi~

ble apr~s incubation d,une heure à 37oC •••••••

19. Etude du mode d'action de l"hémolysine HN de

T. hyodysente'riae PM 29 à différentes

tempé-ratures en fonction du .temps .•••••••• ' ••••••••••

20. Etude du mode d'action de l'hémolysine HP de

T. hyodysenteriae PM 25 à différentes

tempé-118

132.

142

ratures en fonction du temps •• c • • • • • • • • • • • • ~ • • • "143

21. Etude du mode d'action des hémolysines HN et

HP,de T. hyodysenteriae PM 25 à différentes

températures en fonction du temps... •.••••••••• 144

22. Evolution de l'activité hémolytique des

hémo-•

,

lysines HN et HP de'!. hyodysenteriae PM 25 ___ , .

"- .

en fonction de la tem~érature ••••••••••••••••• 147

23.- Effet des cations bivalents et de l'EDTA sur

l'activité hémolytique des hémoly~ines RN et

HP de, T. hyodysenteriae PM 25 •••••••••.• ~ •••• '. 152

..

l' Il 1 1 1

,1

1·,

./

(23)

l

(

.

{)

"

XXIV Tableau pag~

24. Effet du cholestérol et des phospholipides sur

l'activité des hémolysines HN et HP de

T. hyodysenteriae PM 2 5 . . . 154

25. Effet de traitements enzymatiques sur l'activité

des hémolysines HN et HP de

!.

hyodysenteriae

~-PM 25 . . . "._... 155

26. Effet de la cystéine sur l'activité des

hémo-lysines RN et HP de

!.

hyodysenteriae PM 25 •.. 163

27. Infection expérimentale de segments ligaturés

o d'intestin grêle de lapin p~r T. hyodysenteriae

et T. l..nnocens ... .

.

165 ~I

(24)

1 \ .,

t.

Figure 1. 2. 3. 4 •.

LISTE DES ,FIGURES

...

Profil d'élution de l'hêmolysine HN de

!.

hyodysenteriae PM 25 sur DEAE Sephacel •••••

Profil d'éluti~n de l'hémolysine RN de

!.

hyodysenteriae PM 25 sur Ultrogel AcA 44 •••

_..

Electrophor~se en gel de polyacry1amide (10%),

....

pH 8.9 de l'hémolysine HN de

!.

hyodys~nteriae

PM 2,5 (50 llg de protéine): apr~s fil'Cration

moléculaire sur ,Ul trogel AcA 44 •••••••••..••••

t

Electrophor~se en gel d'agarose (1%, plv) A

pH 8:4 de l'hémolysine HN de T. hyodysenteriae

PM 25 (50 llg de protéine) apr~s filtration •

)

moléculaire sur U1trogel AcA 44 ••• , ••••••••• ~ ••

page 100 103

.

, b • f ' ,105 .,

5. Détermimitïon du poids "moléculaire él;pparent de,·,.J' '"

, ' ,

, , " f

1 • hémolysine HN de T. hyodys'ent'eri'ae PM: ,~5 pàr

~iltration _~ moléculaire sur Ultrogel AcA 44 ••••

j \ t 108

6. CinétJqu~ de production des hêmolysines HN et _• _, _p

.

I(P--<le

!.

hyodysenteriae PM 25 cultivé '~ 37°C

l ,

sans agitation en mili,eu TSB-PRSA additionné

d'ARN (1%, p/v) •••••••• ' ••••• ~... 112 ; , , o '. , (

î

l

,

f

i '

1 J

1 1

i

1 ! 1

(25)

i '

(

,

" _•' " ,. Figure

7. Electrophorèse en gel d'agarose (1%, pH 8.4)

.

,de la production hémolytique représentative

d'une cul t'ure de!. hyodysenteriae PM 25 dan,s

un milieu TSB-PRSA à 370C sans agitation,

XXVI

page

sans (A) et avec addition d'ARN

(B)...

113

B. Profil d'é1ution de l'hémolysine HP de

\

!.

hyodysenteriae PM 25 sur Sepharose 6B... 122

9. E1ectrophorèse en gel de po1yacry1amide (10%,

plv) avec SDS de L'hémolysine HP de

~

!.

hyodysente~iae PM 25 (50 ~g de protéine)

après fi1tratrop moléculaire sur Sepharose 6B. 123

10. Détermination- du poids moléculaire apparent

de l'h~mo1ysine'~p de

!.

hyodysenteriae PM 25

par filtration molé~u1aire sur Sepharose 6B •..

Il. Détermination dû poids moléculaire apparent

de l'hémo1ysi~e HP de !. ?yodysenteriae PM 25 par électrophorèse en gel de po1yaery1amide

126 .

'avec SDS . . . t • • • • • • • • ~. • • • • • • • • • • • . . . • • • • • • • • 128

1 ~. 1

12. tcienti té i~uno1ogique des hémo1y:sines HN et

, HP de T. hyodyqente+iae PM 2,5 .•• _-;- ~ • '" ••• '.. •• • • . 130

.

, \ "

.

,

(26)

,J'\W·'!':1~~,""~~m:t, • .tW~~J,«W\iellJ!J!II!II".j(illlt~J~($1II""~1"\>i'1Jl11l!111!11!f1~~"':'I'~'"~~_" .... ,,; " ... _.~" __ .~'"'_

Figure

13.

"

!dentité immunologique de la fraction

anti-génique de l' hémolysine HP de

!.

hyodysen'teri'ae'

~' XXVII

" pag~

'PM 25 •••...•..•••...•.•.•...••.••.... ft • • • • • • 131

14. Cinétique de lyse d'érythrocytes de iapin en "

fonction du temps par l' hémoly~ine HN dd'e

!.

hyodysenteriae PM 2!i à 37°C •.••••••.• (. •• •• ' ',1'3'5

15. Cinétique de lyse d'éry~hrocytes ?e lapih en,

fonction du temps par 1 'hé,molysine HP de _

!.

'hyodysenteriae,PM 25 à 37 C . . . .. o

16. Stabilité à différents pH des 'hémolysines HN

1

et HP de T. hyodysenteriae PM 25 apr~s 15

,

minutes ~ 25°C ... • ' • . ~ ... .

17. Effet ~u chloramphénicol sur l'évolution de

18.

. l'activité hémolytique de T. ,hyodYsenteriae

" " , d

, PM 25. cultivé en milieu TSB-PRSA ~ ,37 C.~ •••••

Effet, du chloramphénicol sur l'évolution de

l'activité' hémolyti~ue de T. hyodysenteriae

PM 25 cu~tivé en milieu TSB:PRSA additi~é

o d'ARN ,-(1%, plv) A 37 'c ....•••••••....•••••••••

J

138 , 158 160 .' ,

l

(27)

" .. ifl." ' . '! Jf'., ~";~ "'tif '. ,

(

• b Figure

19.' Cin~tique d'inactivation il 37°C de l'activité

hémolytique de sprnageants de culture de

!.

hyodysenteriae PM ~5 cultivé en milieu

TSB-PRSA et en milieu TSB-PRSA additionné

d'ARN (1%, plv) . . . .

..

, ' XXVIII page 162

(28)

., (

.'

, .1 t -~ ---~- -~ .. --_---.... ,...- -.' ABREVIATIONS

ARN: acide ribonUCléiqur ~

ARN-core: fraction non aigestible par la·~ibohücl~ase

pancréatique de l'acide ribonucléique

DEAE: diéthylaminoéthylcellulose :t.

EDTA: acide (éthylènedinitrilo)-tétraacétique

PBS: phosphate bufferea saline/tampon phosphate salin

PBSA: PBS additionné d'albumine

PRSA: pré-réduit stérilisé de façon anaérobie

TEMED: N,N,N'

,N'-tetr~thYlétbYl~ne~ne

Tris: base Trizma (Sigma)'

TSB: trypticase soy broth

_.

SOS: dodécy~ sulfate de sodium

J • ,"

.

"

..

, , , ~ ,

.

_,.

"

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", .' :

.

'

.

-.'

1 1 • •. 1 ,

.

,

..

'

.

" .'

..

(29)

" ?

.

(

..

., I. INTRODUCTION

Les tréponèmes forment un groupe de bactéries anaé-robies dont la majorité des espèces sont des const}tuants normaux de la flore buccale et intestinale de la plupart des espèges animales, y compris l'homme.

Au niveau du gros intestin, la présence de spirochètes a été décrite chez l'homme (Harland et Lee, 1967), le singe

(Takeuchi ~ al., 1971), le porc (Taylor et Blakemore, 1971),

le chien (Leach et al." 1973), le rat (Davis et al., 1972)

.et la sO'..1ris (Savage et al., 1971). La localisation dé ces

bactéries dans l~intestin varie selon l'espèce an~male= chez

la souris les spirochètes ne sont"pas associés aux ce,ll ules

épi théli-ales (Savage et al., 1971; Davis et al., 1973) alors

•

que chez le singe et le rat l'association est superficielle

.

';. (Takeuchi' et al., 1971; Davis et al.,~ 1972) et. que chez le

porc, ces gçrmes sont pré~ents à la ~urface et dans les

cellules épithéliales (Taylor et B1akemore, 1971; GlOCr

et ~., 1974).

1.

De tous les tréponèmes in~estinaux CORnus, un seul,

Tr~ponema hyodysenteriae est ~c~nsidsré pathogène CSmibert,

..

1971; Harris, Glock, Christensen et Kinyon, 1972; Harris,

.

"

..

Î

1 1 1 i ,

f

(30)

1:

~,,; '{ t-

e

" , ~~

l

i

(

, ,1

Kinyon, Mullin et Glock, 1972; Smibert et Claterbaugh Jr.,

1972; Harris# 1974; Kinyon et Harris, 1974). En effet, les

.'signes cliniques et les l€sions caract€ristiques de la

dy-senterie porci~e aiguê ont pu être reproduits par

inocula-tion orale de cette bactérie 'à des porcs conventionnels et

.

'''''',

qnotobiotes (Taylor et, Alexander, 1971; Glock et ~arris,

1972;' Harris, Glock, Christensen et Kinyon, 1972; Akkermans _,

et ~ornper, 1973; Hamdy et Glenn, 1974~ Hughes ,et al., 1975)

et, on a retrouvé ce germe en grandes quantit€s au niveau dû

\ côlon et du caecum des porcs malades. Les travaux r€cents

tendent toutefois â démontrer que cette pathog€nie peut @tre le réspltat d'un synergisme entre!. hyodysenteriae et

d'autres composantes de la microflore intestinale (Meyer

et al., 1975; Brandenburg et al., 1977; Harris et al.~ 1978;

Meyer, 1978; Whipp et al., 1979). Nonobstant les progr~s

réalisés dans l'élucidation de l'€tiologie, peu de faits

nous permettent d~ comprendre par quel(s) mécanisme(s) cette

maladie est induite. Les différents mécanismes qui furent

sugg€rés pour expliquer l'initiation de cette colite sont:

l'invasion des cellules épithé~ia.les par le spiroch~te, la

production de cytotoxine par le trépon~me ou d'autres

bacté-ries anaérobies et, finalement l'initiatio~ de

l'infiltra-tion de la muqueuse par une toxine provenant du trépon~me

ou d'une autre bactérie (Taylor et, Blakemore, 1971; Glock

l '

(31)

~t HarFis, 1972; Kent et Moon, 1973; Hughes et al., 1975;

wilcock et Ola der, 1979).

L'hypothè e considérant la présence d'une cytotoxine

e'st basée·' sur 1- apparition souda:ine de nécrose coagulative 3

de la muqueuse, restreinte aux zones où i l existe une

pro-lifération massive de spiroch~tes et, auquel s'ajoute l~nca

paciœ de démontrer l'invasion de cellules saine~ par les

spiroch~tes ou d'autres bactéries. Il a été Suggéré que la

nécrose es~ restreinte à la partie superficielle de

l'épi-thélium parce que des variation subtiles du

microenviron-nement côlonïque permettait la présence de

!.

hyodysenteriae

et de sa (ses) toxine(s) à des concentrations adéquates,

seulement dans les zones 9 environnant l'épithéliun

superfi-ciel (Kent et Moon, 1973; Hughes et al. i. 1975)·.

L'hypo-th~se d'une invasion cellulaire est basée sur la

démonstra-tion de la présence de spirochètes à l'intérieur de

cellu-les épithéliacellu-les du côlqn en dégénérescence (Taylor et

Blakemore, 1971; Glock et Harris, 1972). Enfin l'hypoth~se

émise concernant l'initiation de l'infiltration de la muqueuse

causée par une (des) .toxine (s) refOse sur l'observation fréquent~' de caillots dans les vaisseaux sanguins de la ml..XJUè~e côlonique· de fOres atteints de dysentet<ie fOrcine (Kent et M:lon, 1973).

(32)

,

~

;

.

t

~ , ~

.

J

(

1

mm.II,."

Il

U

:W'SJliiU4Mm 2i2!tlt5ltBiI •• _. .~ S"'tii!iSMIL 1 JIBI _{" • ---}M!II _ ,aP!J~$.I. _{_ _}_{H!U#J . .}_:a4i4?U"""h

&Zj;i

.-/

4

De plus, considêrant le fait qUi

!.

hyodysenteriae

est hêmolytique en cu~ture sur g~lose au sang et que

plusieurs auteurs ont êtabli une corr~lation entre le type

hémolytique de

!.

hXQdysenteriae et son pouvoir

entéro-pathogène (Taylor et Blakemore, 1971; Meyer et al., 1974a; Meyer et al., 1974b; Meyer et al., 1975; Kinyon et al., 1977), il semblait pertinent d'étudier le pouvoir hémolytique de

T. hyodysenteriae pour éventuellement en caractêriser le mode d'action et préciser son implication au niveau de la

pathogénicité associée

A

l~ dysenterie porcine.

Le cheminement logique dans l'~tude d'une tox1:ne

bac-.

têrienne peut être subdivisê en diff~rents aspects (Arbuthnott,

1978) :

• ' >

(1) la production in vitro de grandes quantités de toxine;

(2) la purification et la caractêrisation de ~ toxine;

(3) le développement d'un bioessai satisfaisant;

(4) l'élucidation du mode d'action au niveau 'physio-_j

1

logique, cellulaire et mol~culaire~

(5) l'évaluation du rôle de la toxine dans la pathogênie.

•

(33)

..- ,. i"""~'r·'t .. WIJ.."""",A"it,.;",:~rr~~~'~~ '~·:,~~>' ... j-:r""}.}\~",~t-t.f"~~.lJ'~~~""~~~~",.~~~~~"~'~~~!'il.,.~H~~~~'W/Jf'I~'!\II,,*~d'M#iW""""Q""''''Mi''''. ___ I>I_' L _ _ :"',

1 .

)

/

Dans ce travail, notre attention a surtout porté sur la production, la purification et la paractérisation de

l'activité hémolytique associée à T. hyodysenteriae,

éta-pes essentielles et préliminaires aux études concernant

5

le mode d'action êt l'implication possible de la toxine dans la pathogénie.

(34)

" 1

•

"

II. REVUE DE LITTERATURE

2.1 Les spirochètes

2.1.1 Position taxonomique

C'est )par leurs ~aractéris'tiques morphologiques que

les spirochètes forment un groupe bactérien bien distinct.

On les d~finit comme des bactéries élancées, flexibles et

pouvant avoir une forme hé1ico!da~e ou ondulée. Ce sont des

organismes unicellulaires dont la longeur se situe entre

5 et 55 ~m et dont le diamètre est compri~ entre 0.1 et

3 llm.

L'u1trastructure telle que révélée par la microscopie

électronique a pu mettre. en évidence que to~s les spirochètes

,.

ont en commun les catactérist~ques morphologiques suivantes:

la cellule expose au milieu·externe une membrane multicouches

I~

que l'on désigne membrane ou enveloppe externe, le peptido-glycan et la membrane cytoplasmique sont localisés sous

l'en-veloppe externe et sont ~ignés par le tenne général de cylindre

protoplasmique. C'est entre l'enveloppe externe et la couche'

de peptidoglycan que l'on retrouve l~ caractéristique unique

\

1

(35)

(

"

,

..

, '

7

des spirochètes: la localisation de leurs flagelles. Ces

flagelles sont des organes internes, situés entre le cylindre _,, . ,

, _,

protoplasmique et la membrane externe. Tous les spiroch~tes

sont pourvus d'au moins' un flagelle or~ginant en ~osition

,

.'

subterminale de chaque extrémité du cy+indre' protoplasmique

qui se rejoignent et s'entrecroisent

térie (exception faite des leptospires dont les flage~les

se rejoignent au centre mais ne s'entrecI:Oisent pas)

(Johnson, 1977).

, ,

"

, ,

Les spirochètes sont un groupe tr~s h~tér6g~ne au n~

veau de l' habitat, de la structure et de la phy~iologie. Les

.

spirochètes sont préserltement classifi~s dans ~n ordre,

" 'J

Spirochaetales -ne comprenant qu'une fam,i,lle, Spiro6haetaceae.

1 •

. ' • t •

Dans cette famille, on y regLüupe les cinq genr~s, suivants:

Spirochaeta, 'Trep:mema, <:ristis;eira, 'Bdrrelia et ,:~tospira. "

La définition des genrés fut effectuée sans appliquer les . mêmes caractèrés conune critère de différentiation car, la

JI

très grande diversité existant

aJ

niveau de la ,morphologie

,

" •

et de l'habitat était amplement suffisante pour éviter toute confusion. ( \

:'.

" ' " t • , 'f , ' \

(36)

f

,

" t î 1 { ! 1 _ f I&~."

(.

"

.

... ".~~~",

-

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!

1 '°0 8 ,

.

~ -'!l ;.

r

_\

...

2.1.1.1 Le genre SEirochaeta

-Le genre Spirochaeta est formé de bact€ries de Ipngeur

compr i se en tre ~ et 500 um par 0.2, à O. 75 PJll de .diam~tre; ce

sont' des bactéries anaérobies facul ta'tives que l'on peut

re-trouver à. l'etat nattlrel dans les eaux salées et douces

con-~ t " f7 , ..:

tenant du su/fulre d'

hydrog~ne'

(habituellement\, d..ans les €gouts b _

ou les eaux polluées).

2.1.1.2 Le genre c;ristispira

..

Les bacUiries formant le genre .Cg:stispira sont, de

longeur comprise e'ntre 30 et 150 llm.par O.~

à.3

lJ~,de

dia-,',

mË!tre. Elles ont de 3 il 10 circ:onvolut;ions comp1~tes. Dans

o

.

-,

.

, les sÎécimens vivants, des inclusioI)s ovoldes et des touffes

de flagelles peuve~t êtJ:"e observées par microséopie en

con- .-traste de phase. Ce s,ont des commensaux que l'on retrouve

, 1. ...

habituellement associés à des mollusques.

, 2. 1. 1. 3 Le genre Treponema

:~s

'memb\s du genre Treeonema ont des longeyu:s

1.

. , . > , ' "

comprises entr~ 5 et 15 llm et un diam~tre variant entre

0.09 il 0.5 pm. Ils sont d~pch.p;vus de catalase et d'oxidàse,

1

.

ana€robies, commensaux ou pq.rasites, certains JSont pathogènes.

\ il

(37)

(

---(

2.1.1.4 Le

genre~Orrelia

' - A l'int~r~eur du 'genre Borrelia nous retrouvons des

bactéries de longe urs comprises ent~ 3 et 15 ~m pour un

diamètre de 0.2 à 0.5 pm. Ce sant des bactéries anaérobies

et parasites. Il existe des espèces p~thogènes et le mode

de transmission s'opère généralement par des tiqqes et des

.,

poux.

2.1.1.5 Le genre Leptospira

Les bactéries du genre Leptospira sont de longeur

comprise entre 6 7t 20 ~m et ayant un diamètré d'environ

0.1 pm, ce sont des bactéries· spiralées ayant une .longeur

9

d'onde relativement courte par rapport aux autres spirochètes.

, I~s peuvent avoir des extrémités courbées ou en forme de

cro-cb§t. Ce sont les seuls spirochètes aérobies stricts. La classification des espèces est effectuée par sérotypie

•

seulement et, on retrouve certains sérotypes à l'état libre,

-d'autres paras~tes et certains sont pathogènes.

Les éléments de classification que~nous avons énumérés

proviennent du,IIBergey's Manual pf Determinative Bacteriology",

(38)

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(, , ' , , " '

..

, '

, Le genre Treponema c,omprend 13 espèces plus' ou moins

bien d,éfinies~ Parmi des. ,espèces T~ p'a'llid\,1In,

!.

,.pertenue,

1', , , ' ~ . . ,

-!.

carateum et

!.

paraluis~cuniculi sont 'pathogènes et

non cùltivables tandis que

!.

hyodyse~teriae est pathog~ne ,

et cultivàB1e. Les autres. espèces sont cultivable~ et

con-sidérées· parasites ou pathogène$ d'association, ce sont:

T. phagedenis, T. macrodentium,

T:

refringens,

!.

dent,icola,

T. orale, T. sC01iodontum, T. vincentii et T. innocens.

2.1.2.1 T. hyodysenteriae

6

2.1.2.1.1 Etioiogie de la dysenterie porcine

La dysenterie porcine a été décrite'pour la premi~re

fois dans -la littérature par ~hiting, Doyle et Spray en 1921.

o ,

Pendant près de 50 ans , les chercheurs ,furent da,ns

l'impos-sibilité d~identifier correctemènt l'agent étiologique

res-'ponsable de cett€ maladie. Puis, vers la fin de 1969

com-,...

, menca la publication d'une série de,'notès exprimant la

~

----

'

conviction des auteu~s au sujet de l'association probable

de spirochètes dan,s l ' étiologie ~e la dysenterie porcine

(Vall~j:o, 1~69.; Blakemore et ~aylor, :).970; Espinase et

1

.1

(39)

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Redon,

,

1970; Roberts et Sinunon, 197 0 . l 1 ~ ~" Taylor, 1970; Todd

11

et ~., 1'970). Da!ls certa~ns ,cas, ils furent il même de

culti-,

ver des spiroch~~es proyenant de mati~réS féca~es de porcs

, ,

mal(eS (Ta~lor, 1970;, Todd et

j

al., 1970) mais i l ' faJ,lut·

attendre la publication en 1971 par Taylor et A~exa:t:lder

d'un article" re"latant la ,r~production" des symptômes et des

lésions de la dysertterie"porcine chez les porcs par l ' ad-,

•

ministrat.ion per' os d: une cu1;ture pur~'

Cl·

un spirochète. Cette

,expérience fut reproduite maiptes fois chez des porcs normaux

• ,

.

et ,g'notobi<;>tes (Hatris, G10ck, Christen~en et., K~nyon, 1972;

, ,

Akkermans et Pomper, 1973; Brandenburg et ~. '1977;, Hamdy e1;:

__ . . . a

-Glenn, 1974;, Hughes' ~ al,., 1975). Les c(;:mnaissances'

progres-sant, il' apparu c1aiiement que même si la'

pré,senc~

d' 'àutres '

bac~éries était nécessaire pour permettrè a~ spiroch~tè d~

causer l rinfection, l~ seul micororganisme essentiel pour lq

,

transmission de la dysenterie porcine d'un porc il ,~' autre "

était le spiroch~te (H,arris, Glock, Christense~ et Kinyon,

1972; Branden~urg 'et al., 1977; Meyer et aL,. 1975)'.

Ce spiroch~te,fut nonuné Treponema hyodysenteriae

, \

(Harris, Glock, Christensen et Kin~on,

(40)

" _; ;' j ~ i ' f .~ , " , tl ~1I8<lJ!m',4i_ni&illJR!lt4 _.. H"*",,,l§! .1I1J1j!.il!'i.iiiV".:;a4H!~!

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(

s1

'traditionnellement on parlait de tr~pon~mes

non-pathogènes et cul~ivables et de tr~ponêmes patpogênes

et non,-cultivables, avec

!.'

hyodysenteriae, ce fut le

premièr exemple d'un tr~pon~me pathogêne que l'on pouvait

cultiver in vitro (Taylor et Alexander, 1971>". Parmi les

,',

caractéristiques culturales de ce ge~~e ana~robie, les plus

remarquables sont celles de former rarement des colonies

~ ia surface d'un milieu gélosé et de produire une

hémo-lyse clai~e de type bêta

Ca)

(Harris, Glock, Christensen

et Kinyon, 1972).

12

•

Il a été d~montré que l'on pouvait isoler des

±r~pon~-\

mes morphologiquèment similaires

èt

_, antigéniquement àpparentés

_.

,

à,!.',hyodysenteriae (Harris et Kinyon,' 1974; Hudson et-a1.,

1976; Rinyonet al. 1976). Ces tr~ponèmes .différaient de

!,.

'hyodysenteriae parce q~' ils n'étaient pas pathogènes

(Taylor et Alexander, 1971; Hudson et ~. 1976; Kinyon

~ 'a1. ,. 1977) et qu' ils ~taient', dotés d'une plus faible

.

'

activité hémoiytique sur gélose au sang (Taylor et Alexander,

1971). A présent, il est 'génér'alement reconnu qu' il exi~te

chez ces tréponèmes une corrélation directei _{entre le pouvoir}

• 1

entéropathogène et le type d'activi~é ~é~olytique produite'

sur une g~lose au sang (Rinyon et/.al., 1977; Kinyon et Harris,

1979).

(41)

.

1 ' 1 " ' ,?~~""'-_·f~~~~.~"~J/\ .. ~~:l_!t~""f1I~!f""'l""~~:~';$~~·~I\~'1~i'_"'~,.,t~.'.*~i'&k Lb AII'J~~t""'l;S;M't"JIl)""."'fII"' _ _ _ _ _ _ '.

c

.

(

13 ~

Les tr~ponèmes non-pathogènes peuvent se retrou~er

chez la grande majorité des'porcs (Hudson et al., 1976;

_-

_,

Kinyon ~ al., 1976~ Joens et al., 1979). Il a été proposé

que, ce tréponème non-pathogène sott appelé Trepon'ema i'nnocens

(Kinyon et Harris, 1979). La nomination du trépon~me

hémo-.'

lytique non-pathogène au rang d'espèce distincte est basée _,...

sur trois critères principaux: l'absence d'entéropathogéni-' cité (Taylor et Alexander, 1971; Kinyon et al., 1977;'

Kinyon et Har.ris', 1979); l'activité hémolytique plus faible sur gélose au sang (Taylor et Alexander, ,1971; Kinyon et al., 1977; Kinyon et Harris, 1979) et, le peu d'homologie de son

• _' t

acide désoxyribonucléique avec les autres trépon~mes (Miao

~ al., 1978; Kinyon et Jiarris" 1979).

f

1

,2~1.2.l.2 Epidémiologie de la dysenterie porcine

La qYsenterie.porcine affecte surtout les porcs

pesant entre 15 et 70 kg, quo~que l'on puisse rencontrer

.

la .maladie' chez des' porcs ~ l' allaitem~nt et les adultes

(Harris et Glock', 1981).

La malad,ie est transmise principalement lors, de l'in-gestion par des porcs sains, de matières fécales provenant de

1

(42)

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porcs malades ou de porcs sains porteurs de!. hyodysen~~riae

(Songer et Harris, 1978). La morbidit~ peut atteindre 90%

et-la mortalité 30% selon le succ~s du traitement. Dans 'un

troupeau non trait~, la mortafité peut atteindre 50%

(Harris etG10ck, 1981).

La persistance de T. hyodysenteriae dans les mati~r~s

fécales de porc diluées au dixi~me dans de l'eau a été

éva-luée à 61 jours si elles sont maintenues à' SoC et à 7 jours

~ 250C ,(Chia et Taylor, 1978). Dans l~ sol, le germe a pu

conserver sa viabilité pendant 18 jours à 4°C (Harris et ,

G10ck, 1981).

'"

Le porc n'est pas le 'seul hôte possible pour

T. hyody~enteriae. Glock, Kinyon et Harris (1978), ont

dé-montré qu,'après gavage,. on peut retrouver

!.

hyodysenteriae.

~ _______ 1'

-chez le chi~endant 13 jours et chez l'oiseau pendant

8 jours. Une mouche peut transporter le germe viable pendant

•

4 heures (Harris et G10ck, 1981). Chez les rongeurs, le rat

peut conserver le germe pendant 2 jours, tandis que la ~ouris

peut porter cette période à 100 jours (Harris et Glock, 1981) •

(43)

(

_"

",. 15

,\

2.1.2.1.3 Aspects de la pathogénie de la dysenterie porcine

Même s'il est communément accepté que la dyse~tèrie

. porcine résulte, de la p~t d~ la proli.~ération de

!.

hyodysenteriae dans ~ tractus intestinal de porcs

suscep-tibles, p'eu de données nous permettent une comprél1'ension

',[

du mé~anisme par lequel la maladie est induite.

Les transformations de l'ultrastructure intestinale 'pendant les premiêres manifestations de la dysenterie porcine

ont été caractérisée (Harris et Glock, 1981). Au début, on

observe l'apparition'd'une grande quantité de spirochêtes ~

la surface de la lumiêre intestinale du côlon et dans les cryptes. Par la suite, les cellules épithéliales adjacentes présentent des lésions incluant la destruction des microvilli,

le gonflement des mitochondries et du r~ticulum endoplasmique

. /

ai·nsi qu'une densité accrue de ces organelles. Au fur et ~

mesure que les dommages .prennent de l'importance, les cel-Iules épithéliales s.e rapetissent et deviennent sombres.

!.

hyodysenteriae' envahit les cellules épithéliales, les

.

"

cellules en gobelet et la lamina propria. Les tréponêmes

peuvent être observés en grans nombre (quelquefois en _,

g+appes) à l'intérieur de certaines cell,ules épithéliales',

suggérant ainsi qu'une multiplication intracellulaire

puisse s'effectuer (Taylor et Brakemore, 1971; Glock

(44)

m 1 III .D1SL Il ! ,

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tld] . 16 1 •

.

•

• .

"

une cong~stion de la muqueuse superfic~él1e,' la n~crose dèS

,

..

cei1ules épithélia1es'et,une forte sédrétion de mucine

prove-, . t I ' 1

nant de l'intérieur des cryptes.

1

, "

Li'étude pathophysiologique

rév~le

.. qUE7' ·la di,arrhée

ré-su~te de l'incapacité,des cellules épithéliales du côlon

d'effectuer'l~ transport actif des ions sodium et chlore de

la lumière intestinale vers le sang. On a aussi observé que, . quoique les niveaux d'AMPc et de GMPc soient normaux, leur réponse à un stimulus (théophylline) est fortement atténuée

(Argenzio 'et al., 1980).

Sachant que chez le porc 30 à 50% des sécrétions

endo-"

gènes' sont réab~orbées quotidiennement au niveau du côlon,

il semble très probable qu'une déficience au niveau des mé-canismes d'absorption est suffisante pour expliquer la

déshy-dratatio~ progressive et la mort associées'à la dysenterie

porcine (Argenzi? et a1.( 1980).

Trois mécanismes ont été proposés pour expliquer l'ini-tiaùion de cette colite: l'invasion des cellules épithéliales

par le spirochète, la production 'de ~ytotoxine par le

trépo-nème ou d'autres bactéries anaérobies associées, l'initiation de l'infiltration de la muqueuse par une toxine provenant du

tr~ponème ou d'une autre bactériè (Taylor et Blakemore, 1971;

,

.

/

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.

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.

' j. 1 9 ~'.J.~ ... "u

(45)

"

(

,

.

, '

" .

Gloék et Harris, 1972; Kent 'et Moon, 1973; Hughes et al.,

1975; Wilcock et 01an~er, 1979). Il n'y'~<cependant aucune

êvidence ferme support~nt l'un ou l'autre de ces mécanismes.

'"

L'hypothèse voulant que l'invasion des cellules

~pi-,

.

tpê~iales par le tréponème soit le mécanisme initi~teur de'

,

la dysenterie porcine est basé~ sur la d~monsttation de la

'.... ,

prêsence de spiroch~tes à l'intérie~ de cellules

épithé-~"'-! •

.

"

'~.

lia1es du côlon en dégénérescence (Taylor et Blakemore, 1971; Glock et Harris; 1972). Cependant on n'a pas encore démontré que l'invasion des cel141es:épithé1iales était un prérequis

à l'apparition des lésions (Gloak et al., 1974).

1

, •• • l i ·

L'hypothèse impliquant la production de cypotoxine par le tréponème ou d'autres bactéries anaérobies associées est basée sur l'apparition soudaine de nécrose coagulative de la muqueuse dans les zones où l'on retrouve une grande prolifération de spirochètes et, est aussi basée sur

l'inha-1

bilité de démontrer l'invasion de cellules saines par les

spirocpète~ ou d'au~res bactéries., On a suggéré que les

zones de n~crose sont restreintes à l' é~i théli~.~superficie1

..

parce que des variations du microenvironnement côlonique

pe~ettaient la présence de T. hyodysenteriae et de sa (ses)

toxine (s) à' de~t concentrations adéquates que dans les zones

J d

environnant l'êpithélium superficiel (Kent et Moon, 1973; Hughes et a1., 1975).

~

(46)

~~~".M"".~ ••• (._.~".4: ••• ! ••• a ... ,.S .... , ••••• s'.Jia.U.I . . . . I . . . . dt~2.; . . . . b.H1.I.L..4_ •• ta.IU.X~# •• jj~:I.L& . . 4.a.J . . . l.a.a.IINa . . $M[~$ ___ , ~, _______ • _ _ _ " __

•

18

.

Enfin, le dernier mécanisme voulant q~e l'initiation

de l'infiltration dans la muqueuse soit du.à une,tqxine

repo-.

se sur l'observation fréquente de caillots dan~ les vaissèaux

sanguins de la muqueuse du

c~lon

de

por~.atteints

dè

-dysenterie. porcine (Kent et Moon, 1973).

'-:;"

Sachant que T. hyodysenteriae produit un facteur hémolytique et que plusieurs auteurs ont établi une

corré-lation ~irecte eQtre la capacit~ hémolytique de

!.

hyodysenteriae

e~ son pouvoir entéropathogène (Taylor et B1akemore, 1971;

Meyer et al., 1974ai Meyer ~t al., 1974b; Meyer ~ al., 1975;

Kinyon et al., 1977), il nous apparai~sait pertinent de

.

procéder â l'étude et à la purification du pouvoir h~molyt'ique

de

!.

hyodysenteriae pour éventuellement en caractériser le

mode d'action' et préciser son impl~cation dans la pathogénicité

associée à' .la dysenteri,e porcine.

2.2 Les toxines bactériennes

'

-.

Les toxin~s bactériennes· sont des substances élaborées

,

.

par des bactéries en'ëroissance et sont susceptibles d'altérer ou de détruire les cellules normales humaines ou animales avec lesquelles elles viennent en contact. Cette définition re- . groupe une toule de molécules hétérogènes différant dans leurs

'\

localisâtions dans la ce~lule bactérienne, leur.f structures

chimiques, leurs propriétés physico-ch~miques et biologiques.

- !

1 - i