Modulation de la protéine de polarité épithéliale Yurt par
phosphorylation et oligomérisation
Thèse
Clémence Gamblin
Doctorat en biologie cellulaire et moléculaire
Philosophiæ doctor (Ph. D.)
Modulation de la protéine de polarité épithéliale Yurt par
phosphorylation et oligomérisation
Thèse
Clémence Gamblin
Sous la direction de :
Résumé
Les fonctions des cellules épithéliales reposent sur la distribution asymétrique de différents constituants cellulaires, organisation structurale nommée polarité épithéliale. Plus de 80% des cancers sont d’origine épithéliale, et l’altération de la polarité cellulaire contribue à la progression du cancer. L’élucidation des mécanismes moléculaires contrôlant la polarité épithéliale est donc primordiale. La protéine Yurt permet de maintenir l’intégrité de la membrane latérale et de limiter la croissance de la membrane apicale dans les épithéliums polarisés. Les orthologues humains de Yurt, EHM2 et EPB41L5, sont surexprimés dans des cellules cancéreuses hautement métastatiques et sont associés à un mauvais pronostic. EPB41L5 est aussi impliquée dans la transition épithélio-mésenchymateuse et dans la formation des métastases. Le développement d’inhibiteurs de EHM2 et EPB41L5 pourrait donc contrer la progression tumorale. L’objectif général de mon doctorat était de mieux comprendre les modes de régulation de ces protéines, ce qui est un préalable essentiel pour la mise en place de stratégies thérapeutiques dans le contexte du cancer.
Durant la polarisation des cellules épithéliales, Yurt est confinée à la membrane latérale et assure l’intégrité de ce domaine membranaire en réprimant la machinerie apicale. Aux stades tardifs de l’embryogenèse, le recrutement apical de Yurt permet de restreindre la taille de la membrane apicale. Néanmoins, les mécanismes moléculaires soutenant la dynamique spatiotemporelle de Yurt, et les mécanismes précis par lesquels Yurt inhibe la machinerie apicale étaient non définis.
Au cours de mon doctorat, nous avons montré que la kinase apicale aPKC phosphoryle Yurt pour empêcher sa localisation apicale prématurée. Une version non phosphorylable de Yurt démantèle le domaine apical, indiquant que l’exclusion apicale de Yurt dépendante de aPKC est cruciale pour la polarité épithéliale. En retour, Yurt antagonise les fonctions de aPKC pour prévenir l’apicalisation de la membrane plasmique. La capacité de Yurt à lier et restreindre les fonctions de aPKC est centrale pour son rôle dans la polarité épithéliale. En effet, déléter le site de liaison à aPKC neutralise l’activité de Yurt. Ainsi, Yurt et aPKC sont impliquées dans une relation antagoniste bidirectionnelle qui contribue à la ségrégation des domaines membranaires, ce qui soutient l’architecture fonctionnelle des tissus épithéliaux.
Ensuite, pour comprendre plus en profondeur comment est modulée l’activité de Yurt, nous avons investigué les propriétés biochimiques de Yurt et de ses orthologues. Ces protéines appartiennent à la famille des protéines à domaine « Four-point-one, Ezrin, Radixin, Moesin » (FERM). Elles possèdent également un domaine adjacent à FERM (FA pour « FERM-adjacent »), définissant un sous-groupe de la famille FERM. Certaines protéines de cette famille ont la capacité de former des homo-oligomères, ce qui module leurs fonctions. Nos résultats indiquent que Yurt et EPB41L5 sont également capables de s’homo-oligomériser. Nous avons démontré que l’unité FERM-FA définit une interface oligomérique. De plus, nous avons montré que la phénylalanine 281 (F281) et le tryptophane 283 (W283) sont particulièrement importants pour l’interaction homotypique de Yurt. En effet, la substitution de ces résidus en arginine (R) abolit l’interaction homotypique de Yurt in vitro. Nous avons alors généré une lignée de drosophile exprimant YurtF281R,W283R
à partir du locus endogène yurt grâce à la technique CRISPR/Cas9. Les embryons exprimant YurtF281R,W283R sont phénotypiquement similaires aux embryons complètement
dépourvus de Yurt, suggérant fortement que la multimérisation de Yurt est cruciale pour ses fonctions in vivo. Nous avons également démontré que la kinase aPKC déstabilise l’oligomère de Yurt conduisant à une répression de ses fonctions. Ceci révèle un mécanisme par lequel cette kinase supporte la formation du domaine apical.
En résumé, mes travaux de doctorat ont permis de décrypter le mécanisme d’exclusion apicale de Yurt par la kinase aPKC dans les cellules épithéliales immatures. Nous avons également mis en évidence une relation antagoniste bidirectionnelle entre Yurt et aPKC. Ceci contribue à maintenir la bonne ségrégation des domaines membranaires, et ainsi soutenir l’architecture fonctionnelle des tissus épithéliaux. De plus, nous avons démontré que l’oligomérisation de Yurt est cruciale pour ses fonctions in vivo. Cette propriété biochimique est conservée chez son orthologue humain EPB41L5. Ceci offre donc une opportunité unique dans la lutte contre le cancer. En effet, des composés interférant avec cette oligomérisation pourraient limiter l’activité de EPB41L5, et ainsi combattre la progression tumorale.
Abstract
The polarized architecture of epithelial cells along the apical-basal axis is crucial for epithelial tissue morphogenesis, physiology and homeostasis. Over 80% of cancers are of epithelial origin, and the alteration of cell polarity contributes to cancer progression. Elucidating the molecular mechanisms controlling epithelial polarity is therefore essential. The protein Yurt stabilizes the lateral membrane and limits apical membrane growth in polarized epithelia. The human Yurt orthologs EHM2 and EPB41L5 are overexpressed in many cancers. This correlates with poor outcome for patients. EPB41L5 also supports epithelial-mesenchymal transition and metastasis. Elaborating strategies limiting EHM2 and EPB41L5 activity is of special interest in oncology. The general objective of my PhD was to decipher the regulation of these proteins to pave the way for new therapeutic strategies for the treatment of cancer.
During organogenesis, Yurt is confined to the lateral membrane and supports the stability of this membrane domain by repressing the apical machinery. At later stages of embryogenesis, the apical recruitment of Yurt establishes a local negative regulatory feedback loop that restricts the size of the apical membrane. However, the molecular basis sustaining the spatiotemporal dynamics of Yurt, and the precise mechanisms by which Yurt inhibits apical promoting factors were undefined. During the first part of my Ph.D., we demonstrated that aPKC phosphorylates Yurt to prevent its premature apical localization. A non-phosphorylatable version of Yurt dominantly dismantles the apical domain, showing that its aPKC-mediated exclusion is crucial for epithelial cell polarity. In return, Yurt counteracts aPKC functions to prevent apicalization of the plasma membrane. The ability of Yurt to bind and restrain aPKC signaling is central for its role in polarity, as removal of the aPKC binding site neutralizes Yurt activity. Thus, Yurt and aPKC are involved in a reciprocal antagonistic regulatory loop that contributes to the segregation of discrete and mutually exclusive membrane domains, thereby sustaining the functional architecture of epithelial tissues. To further define how Yurt activity is modulated, we investigated the biochemical properties of Yurt and its orthologs. Yurt and EPB41L5 belong to the Four-point-one, Ezrin, Radixin, Moesin (FERM) domain protein family. These proteins also contain a FERM-adjacent (FA) domain which defines a subfamily of FERM proteins. Some proteins of this superfamily have
the ability to multimerize. Our results indicate that both Yurt and EPB41L5 oligomerize. Our data also establish that the FERM-FA unit forms an oligomeric interface, and that multimerization of Yurt is crucial for its function in epithelial cell polarity regulation. Finally, we demonstrated that aPKC destabilizes the Yurt oligomer to repress its functions, thereby revealing a mechanism through which this kinase supports apical domain formation. In summary, my Ph.D. work has deciphered the mechanism sustaining the apical exclusion of Yurt by aPKC in immature epithelial cells. We have also demonstrated a reciprocal antagonistic regulatory loop between Yurt and aPKC. This contributes to maintaining the proper segregation of membrane domains, and thus supporting the functional architecture of epithelial tissues. In addition, we have demonstrated that Yurt oligomerization is crucial for its in vivo functions. This biochemical property is conserved in its human ortholog EPB41L5. This offers a unique opportunity in the fight against cancer. Indeed, compounds interfering with this oligomerization could limit the activity of EPB41L5, and thus counteract tumor progression.
Table des matières
Résumé... iii
Abstract ... v
Table des matières... vii
Liste des figures ... xi
Liste des tableaux ... xiii
Liste des abréviations ... xiv
Dédicaces ... xvi
Remerciements ... xvii
Avant-propos ... xx
Chapitre 1 : Introduction ... 1
1.1. Les tissus épithéliaux ... 1
1.1.1. L’organisation des épithéliums ... 1
1.1.2. Les caractéristiques des épithéliums ... 2
1.1.3. La polarité épithéliale et la progression tumorale ... 5
1.2. Drosophila melanogaster : le modèle le plus fructueux pour étudier la polarité épithéliale ... 6
1.2.1. Le cycle de vie et l’embryogenèse de la drosophile ... 7
1.2.1.1. Le cycle de vie ... 7
1.2.1.2. Le développement embryonnaire ... 7
1.2.2. Drosophila melanogaster : un outil génétique puissant ... 11
1.2.2.1. Le système UAS-GAL4 ... 12
1.2.2.2. Le système CRISPR-Cas9 : la technique « scarless » ... 13
1.2.2.3. La contribution maternelle dans l’embryon de drosophile ... 15
1.3. Les jonctions cellulaires ... 18
1.3.1.1. Les jonctions occlusives : la barrière transépithéliale ... 18
1.3.1.2. La zonula adherens ... 21
1.4. Les principaux composants de la polarité épithéliale ... 22
1.4.1. Le complexe Crb ... 24
1.4.1.1. Rôles du complexe Crb/CRB3 dans la polarité épithéliale et au niveau des jonctions cellulaires... 24
1.4.1.2. Rôle de Crb/CRB3 dans l’organisation du cytosquelette d’actine et dans la morphogenèse des tissus ... 26
1.4.1.3. Rôle de CRB3 dans la répression de la progression tumorale ... 27
1.4.2. Le complexe Baz/aPKC/Par-6 ... 28
1.4.2.2. La protéine aPKC ... 30
1.4.2.3. La protéine Par-6 ... 34
1.4.3. Les principales protéines du domaine basolatéral ... 35
1.4.3.1. Le module Lgl/Scrib/Dlg ... 35
1.4.3.2. La kinase Par-1 et les protéines 14-3-3 ... 36
1.4.4. La protéine Yrt ... 38
1.4.4.1. La structure de Yrt et de ses orthologues ... 38
1.4.4.2. Implication de Yrt et de ses orthologues dans le développement embryonnaire ... 40
1.4.4.3. Implication de Yrt dans la polarité épithéliale ... 41
1.4.4.4. Implication de Yrt et de ses orthologues au niveau des jonctions cellulaires ... 45
1.4.4.5. Implication de Yrt et de ses orthologues dans la morphologie cellulaire ... 47
1.4.4.6. Implication de Yrt et de ses orthologues dans l’EMT et la progression tumorale ... 48
1.5. Mise en contexte et objectifs ... 51
1.5.1. Caractériser le mécanisme moléculaire contrôlant l’exclusion apicale de Yrt durant les étapes précoces de l’embryogenèse ... 51
1.5.2. Étudier les propriétés biochimiques de Yrt et de ses orthologues ... 52
Chapitre 2 : A bidirectional antagonism between aPKC and Yurt regulates epithelial cell polarity ... 54
2.1. Avant-propos ... 55
2.2. Résumé ... 56
2.3. Abstract ... 57
2.4. Introduction ... 58
2.5. Results and discussion ... 59
2.5.1. The FA domain of Yrt directly binds to aPKC. ... 59
2.5.2. aPKC phosphorylates several residues in the FA domain of Yrt. ... 59
2.5.3. aPKC preserves apical membrane integrity through phosphorylation-dependent exclusion of Yrt. ... 60
2.5.4. Yrt controls apical-basal polarity by limiting aPKC functions. ... 62
2.6. Figures ... 64
2.7. Supplemental figures ... 71
2.8. Materials and methods ... 74
2.8.1. Molecular biology, DNA cloning, and generation of transgenic lines ... 74
2.8.2. Drosophila genetics ... 74
2.8.3. Immunofluorescence ... 75
2.8.5. Purification of GST fusion proteins ... 75
2.8.6. Western blotting ... 76
2.8.7. Immunoprecipitation ... 76
2.8.8. GST pull down ... 77
2.8.9. Kinase assay ... 77
2.8.10. Sample preparation and mass spectrometry analysis ... 78
2.8.11. Determination of hatching percentages... 78
2.8.12. Image acquisition and processing ... 79
2.8.13. Sequence alignment ... 79
2.9. Acknowledgements ... 79
2.10. References ... 80
Chapitre 3 : Oligomerization of the FERM-FA protein Yurt controls epithelial cell polarity... 82
3.1. Avant propos ... 83
3.2. Résumé ... 84
3.3. Abstract ... 85
3.4. Introduction ... 86
3.5. Results and Discussion ... 87
3.5.1. Yrt and its mammalian ortholog EPB41L5 oligomerize ... 87
3.5.2. The FERM and FA domains form an oligomeric interface ... 87
3.5.3. Oligomerization of Yrt is essential for its function in epithelial cell polarity ... 88
3.5.4. aPKC dismantles the Yrt oligomer ... 90
3.6. Figures ... 92
3.7. Supplemental figure ... 97
3.8. Materials and Methods ... 98
3.8.1. Molecular biology ... 98
3.8.2. Transgenic fly lines ... 98
3.8.3. CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis ... 98
3.8.4. Drosophila genetics ... 99
3.8.5. Cell culture and transfection ... 100
3.8.6. Immunofluorescence microscopy ... 100
3.8.7. Proximity ligation assay (PLA) ... 101
3.8.8. Immunoprecipitation ... 101
3.8.9. Protein purification ... 102
3.8.10. GST pull down ... 102
3.8.11. Western blotting ... 103
3.8.13. Sequence alignment ... 103 3.8.14. Cuticle preparation... 104 3.8.15. Statistical analysis ... 104 3.9. Acknowledgements ... 104 3.10. Author contributions ... 104 3.11. References ... 105
Chapitre 4 : Discussion et perspectives ... 109
4.1. Un antagonisme bidirectionnel entre aPKC et Yrt régule la polarité épithéliale ... 109
4.1.1. La phosphorylation de Yrt par la kinase aPKC est cruciale pour la polarité épithéliale ... 110
4.1.1.1. La phosphorylation de Yrt par aPKC permet l’exclusion de Yrt du domaine apical durant les phases précoces de l’embryogenèse ... 110
4.1.1.2. aPKC antagonise les fonctions de Yrt pour préserver l’intégrité du domaine apical et l’organisation du tissu épithélial ... 114
4.1.1.3. La phosphorylation de Yrt par aPKC déstabilise son association membranaire ... 115
4.1.2. La protéine Yrt contrôle la polarité épithéliale en limitant les fonctions de la kinase aPKC ... 118
4.2. Modulation de la polarité épithéliale par l’oligomérisation de la protéine Yrt ... 120
4.2.1. L’oligomérisation de Yrt est essentielle pour ses fonctions dans le développement embryonnaire et dans la polarité épithéliale ... 120
4.2.2. L’oligomérisation de Yrt n’est pas nécessaire pour sa localisation membranaire ... 122
4.3.3. Implication de l’oligomérisation de Yrt sur ses autres fonctions ... 123
4.3.3.1. Devenir de la forme monomérique de Yrt ... 123
4.3.3.2. Implication de l’oligomérisation de EPB41L5 et EHM2 dans la formation des jonctions cellulaires, dans la constriction apicale et dans la progression tumorale ... 124
4.3.4. La kinase aPKC démantèle l’oligomère de Yrt ... 125
4.3.4.1. Comment aPKC peut démanteler l’oligomère de Yrt afin d’inactiver ses fonctions ?... 126
4.3.4.2. Implication d’autres kinases dans le démantèlement de l’oligomère de Yrt ... 129
4.3.4.3. Mécanisme général de régulation des substrats de la kinase aPKC .. 130
Chapitre 5 : Conclusion ... 131
Bibliographie ... 134
Liste des figures
Chapitre 1 :Figure 1.1 Les différents types d’épithéliums.
Figure 1.2 Les principales caractéristiques des épithéliums. Figure 1.3 La plasticité de la morphologie cellulaire.
Figure 1.4 La plasticité des propriétés épithéliales. Figure 1.5 Le cycle de vie de la drosophile.
Figure 1.6 L’embryogenèse de la drosophile. Figure 1.7 L’ectoderme embryonnaire ventral.
Figure 1.8 Portrait de l’épiderme à la fin de l’embryogenèse. Figure 1.9 Le système UAS-GAL4.
Figure 1.10 Le système CRISPR-Cas9 : la technique « scarless ».
Figure 1.11 Élimination de la contribution maternelle à l’aide de la mutation ovoD et du système Flp/FRT.
Figure 1.12 L’ultrastructure et la barrière paracellulaire des JSep. Figure 1.13 Les jonctions serrées chez les vertébrés.
Figure 1.14 Le complexe cadhérine/caténine de la ZA ancré au réseau d’actomyosine. Figure 1.15 Les principaux acteurs de la polarité épithéliale chez la drosophile.
Figure 1.16 La structure de la protéine Crb.
Figure 1.17 La protéine Crb est un déterminant apical. Figure 1.18 Le complexe aPKC/Baz Par-6.
Figure 1.19 La kinase aPKC est un déterminant apical.
Figure 1.20 Mécanisme moléculaire de l’exclusion de Baz du domaine apical. Figure 1.21 Mécanismes moléculaires de la phosphorylation de Baz par Par-1. Figure 1.22 La protéine Yrt appartient à la famille FERM-FA.
Figure 1.23 Protéines à domaine FERM et modes de régulation. Figure 1.24 La mutation yrt conduit à une létalité embryonnaire.
Figure 1.25 Dynamique spatiotemporelle de Yrt durant l’embryogenèse de drosophile. Figure 1.26 Localisation de la protéine Crb dans les embryons yrt M/Z.
Figure 1.27 Dynamique spatiotemporelle de Yrt et relation avec Crb. Figure 1.28 La dualité de fonctions de Yrt dans la polarité épithéliale. Figure 1.29 Implication de EHM2 dans la constriction apicale.
Figure 1.30 Mécanisme moléculaire contrôlant l’exclusion apicale de Yrt et hypothèse du chapitre 2.
Figure 1.31 Oligomérisation des protéines à domaine FERM et hypothèse du chapitre 3.
Chapitre 2 :
Figure 2.1 Yrt directly binds to aPKC via its FA domain. Figure 2.2 Yrt is a substrate of aPKC.
Figure 2.3 aPKC-dependent phosphorylation of Yrt is crucial for epithelial cell polarity. Figure 2.4 Yrt limits aPKC-dependent apicalization of epithelial cells.
Figure 2.S1 Identification of aPKC phosphorylation sites in Yrt by mass spectrometry. Figure 2.S2 The FA domain of Yrt contains most aPKC phosphorylation sites.
Figure 2.S3 aPKC limits the impact of Yrt overexpression.
Chapitre 3 :
Figure 3.1 Yrt and EPB41L5 oligomerize.
Figure 3.2 The oligomerization of Yrt requires the FERM and FA domains. Figure 3.3 The oligomerization of Yrt is essential for epithelial cell polarity. Figure 3.4 The Yrt mutant proteins unable to oligomerize are inactive.
Figure 3.5 The Yrt oligomer is destabilized by aPKC-dependent phosphorylation. Figure 3.S1 Oligomerization is not required for the localisation of Yrt to the membrane
Chapitre 4 :
Figure 4.1 Les motifs BH prédits de Yrt.
Figure 4.2 Relation antagoniste bidirectionnelle entre Yrt et aPKC. Figure 4.3 Yrt contient un motif consensus de aPKC.
Figure 4.4 L’oligomère de Yrt est démantelé par la kinase aPKC.
Figure 4.5 Modèle hypothétique du changement de conformation de Yrt.
Chapitre 5 :
Liste des tableaux
Chapitre 1 :
Tableau 1.1 : Les JSep chez D. melanogaster.
Tableau 1.2 : La surexpression de EPB41L5 et EHM2 dans des cellules cancéreuses.
Chapitre 4 :
Tableau 4.1 : Association des protéines FERM à la membrane plasmique. Tableau 4.2 : Interactions intramoléculaires engageant le domaine FERM.
Liste des abréviations
A Alanine
aPKC Protéine kinase atypique
Arm Armadillo
ATP Adenosine-5’-triphosphate
Baz Bazooka
BH Motif basique et hydrophobe BioID Biotinylation de proximité
BRET Bioluminescence par transfert d’énergie par résonance CAC Ceinture d’actomyosine circonférentielle
Cas9 CRISPR associated protein 9
Cat Caténine
Cdc42 Cell division cycle protein 42 Cora Coracle
CR3 Région conservée 3 de Baz/PAR-3
Crb Crumbs
CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
Cy3 Cyanine 3
D Aspartate
da Daughterless
DE-Cad E-Cadhérine (D. melanogaster) Dlg Discs large 1
DMoe Moesin (D. melanogaster)
DN Dominant négative
DNA Desoxyribonucleic acid DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EMT Transition épithélio-mésenchymateuse EPB41L5 Erythrocyte Protein Band 4.1-like 5 ERM EZRIN RADIXIN MOESIN
Ey Eyeless
F Phénylalanine
FA Adjacent à FERM
FAK Focal adhesion kinase FBM FERM binding motif
FERM Four-point-one (4.1), Ezrin, Radixin, Moesin FL Full-length (Pleine longueur)
Flp Flippase
FRT Flippase Recognition Target GFP Green fluorescence protein GST Glutathione S-transferase
H Histidine
HEK293T Human embryonic kidney cells 293T
HEPES acide 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonique HRP Horseradish peroxidase
Hs Heat shock
IgG Immunoglobuline G
JAM Junctional adhesion molecules JSep Jonctions septées
Lgl Lethal (2) giant larvae M/Z Maternel/Zygotique
MDCK Madin-Darby Canine Kidney cells
MOE MOESIN
Moe Mosaic eyes (poisson zèbre)
MOPS 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid
MS Mass Spectrometry
MYO-II MYOSIN-II
NGT Normal Goat Serum-Triton X-100 NMuMG Normal murine mammary gland cells
Nrg Neuroglian
Nrx-IV Neurexin-IV
Pak1 p-21 activated kinase
PALS1 Protein associated with Lin-7 1 Par-1 Partitioning-defective 1
Par-3 Partitioning-defective 3 Par-6 Partitioning defective 6
Patj Pals1-associated tight junction PBM PDZ binding motif
PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase chain reaction
PDZ Postsynaptic density-95/Discs large/zona occludens-1 Pfu Pyrococcus furiosus polymerase
PH Plekstrin homology
PIP2 Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate PLA Proximity ligation assay
PP1 Phosphatase 1 PP2A Phosphatase 2A PPase Phosphatase R Arginine S Sérine Scrib Scribbled
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
Sdt Stardust
St Stage
STE Sodium Chloride-Tris-EDTA
T Thréonine
UAS Upstream activating sequence
VR Variable Region
W Tryptophane
WT Wild type
YMO1 Yrt/Mosaic eyes-like 1
Yrt Yurt
Z Zygotique
ZA zonula adherens ZO zonula occludens
Dédicaces
À toutes les personnes qui m’ont soutenue dans cette aventure et qui m’ont permis de croire en moi.
Remerciements
Je tiens tout d’abord à remercier vivement mon directeur de recherche, le Dr Patrick Laprise. Merci Patrick de m’avoir accueillie dans ton laboratoire, et de m’avoir soutenue pendant toutes ces années de doctorat. J’ai été honorée que tu m’ais confiée deux excellents projets basés sur des hypothèses solides. De plus, tu as su m’encadrer tout en me laissant la juste dose d’autonomie pour un excellent apprentissage. Tu as toujours trouvé les mots justes pour m’encourager et me redonner confiance. Tu as été à l’écoute de mes suggestions, tout en sachant parfaitement redéfinir les priorités de mes projets. Je te remercie de la confiance que tu me témoignes au sein de ton laboratoire et je suis sincèrement ravie de notre travail en collaboration.
Je tiens ensuite à remercier la Dre Nathalie Rivard, la Dre Josée Lavoie et le Dr Darren Richard pour avoir accepté d’évaluer ma thèse. Je remercie également mes anciens superviseurs, la Dre Nathalie Marissal-Arvy, la Dre Marie-Laure Parmentier, la Dre Florence Maschat et le Dr Christian Bechemin, avec qui j’ai eu la chance d’effectuer mes premières expériences en laboratoire de recherche. Ils ont eu un grand impact dans mes études et sur ma passion pour le monde de la recherche.
Je remercie très sincèrement toutes les personnes qui ont collaboré sur mes projets de doctorat. Je tiens tout d’abord à remercier le Dr Nicolas Bisson pour m’avoir introduite au monde de la spectrométrie de masse et d’avoir apporté des données très profitables à l’avancement de mon doctorat. Merci François pour ton accueil et ton aide dans le laboratoire, ainsi que pour ton apprentissage des belles expressions québécoises. J’ai été ravie de collaborer avec toi. Un grand merci à Émilie Hardy pour m’avoir parfaitement accueillie et formée dans le laboratoire. Je te remercie pour ton énergie contagieuse et pour tes « lâche pas la patate ». Merci Frédérique « la stagiaire » pour ton implication et ta rigueur dans ton travail, ainsi que ton aide précieuse. Merci Kévin J. pour ta collaboration qui a permis de finaliser le projet sur l’oligomérisation, ainsi que pour tes grands débats pour toujours avoir le dernier mot! Merci Alexandra pour ton aide et ta rigueur au sein du laboratoire, ainsi que tous les conseils que tu m’as apportée. Je tiens également à remercier le Dr Jean-Yves Masson, ainsi que Yan et Laurent, qui m’ont été d’une grande aide pour mes expériences de biochimie.
J’aimerais également remercier tous les autres membres du laboratoire passés et présents sans qui la vie au laboratoire n’aurait pas été si animée. Merci Cornélia pour nos discussions et nos délires dans la pièce à mouches, ainsi que pour ta belle énergie, ton imagination pour les surnoms, tes chorégraphies et pour « au bal masqué »! Merci à Myriam pour tes jeux de mots qui m’ont valu de nombreux fous rires! Merci à Justine pour tes couleurs, ta joie de vivre et ton soutien! Je remercie également Élise H., Lucie, Élise L., Kévin S. et Hélori pour tous les bons moments passés dans le laboratoire. Je tiens aussi à remercier les membres des autres équipes du centre de recherche qui m’ont aidée par leurs conseils et leur bonne humeur, et en particulier Herman, Giti, Mike, Carl, Anne R., et Pauline. Enfin, je remercie les filles du 3ème, incluant Alexandra R., pour avoir égayé tant de pauses du midi et de 5à7!
Je remercie très chaleureusement tous mes amis qui m’ont énormément soutenue durant toutes ces années. Vous m’avez offert de très beaux moments, et également permis de tenir le cap dans les moments plus difficiles. Je n’aurai jamais réussi sans vous. Je tiens tout d’abord à te remercier Seb, tu m’as toujours soutenue et su me recentrer sur l’essentiel. Tu m’as supportée pendant nos vacances, et lors de nos petits déjeuners hedbomadaires où ma bonne humeur n’est pas toujours au rendez-vous! Merci d’être mon ami! Je remercie très chaleureusement Claire! Merci pour ta grande disponibilité, ton écoute et ton soutien autant sur le plan professionnel que personnel! Un immense merci à Fanny, tu es toujours disponible et tu trouves toujours les mots pour me redonner du baume au cœur! Merci pour ton enthousiasme, et pour tous les excellents moments que tu organises et que tu immortalises à la perfection avec tes selfies! Continue et « Go Go Go ma GymMate »! Je te remercie énormément Kévin P. pour ton soutien, ainsi que pour ton immense patience et ta tolérance face à mon mauvais caractère, ma susceptibilité et mes moments de panique. Je te suis extrêmement reconnaissante Rémi pour m’avoir soutenue et permis d’évoluer tout le long de ces années de doctorat, et pour continuer à me « secouer les puces » même à distance. Je remercie également tous mes autres amis de Québec, et en particulier Manon, Céline, Jean-Pascal, Guillaume, Jessica, Carole, Alice, Jean-Clément et Pauline.
Je remercie énormément mes amies d’enfance, Ophélie et Laetitia! Merci les filles pour toutes ces belles années d’amitié et pour être venues me voir. Merci Ophélie, ainsi que tes enfants, Tom et Lily, pour votre soutien, vos messages et vos photos qui m’apportent toujours du baume au cœur! Je tiens à remercier très chaleureusement Bérangère, ma cop’s! Merci pour ton soutien, ta présence et ton accueil à Québec. C’est grâce à toi que j’ai
eu le courage de me lancer dans cette aventure! Avec ton fils Elliott, vous me permettez de m’évader de mon quotidien! Vous êtes ma famille de cœur au Québec!
Je tiens finalement à remercier de tout mon cœur ma famille qui m’a laissée partir de l’autre côté de l’Atlantique. Je te remercie énormément ma petite sœur Élise! Tu es toujours disponible et d’un excellent soutien! Tu sais parfaitement me redonner confiance. Un immense merci de m’avoir fait l’honneur de devenir tata de mon petit Antoine qui est une vraie source de bonheur avec son rire et ses mimiques! Je te remercie ma grande sœur Eva pour tes nombreuses visites et tout ton soutien. Je te remercie Maman de t’être familiarisée avec skype pour qu’on puisse discuter comme si on était dans la même pièce. Et enfin, j’ai une pensée particulière pour mon Papa qui m’a toujours encouragée pour partir à l’étranger et donner le meilleur de moi-même. Je vous aime fort!
Avant-propos
Les travaux présentés dans cette thèse sont le résultat de 7 ans d’études sous la supervision du Dr Patrick Laprise. J’ai ainsi pu participer à la réalisation de deux manuscrits en tant que première auteure.
Mon premier projet, qui fait l’objet du chapitre 2, décrypte le mécanisme d’exclusion apicale de Yurt par la kinase aPKC et révèle une relation antagoniste bidirectionnelle entre Yurt et aPKC, ce qui est crucial pour la polarité épithéliale. Ce projet a donné lieu à un article publié dans « The Journal of Cell Biology » intitulé « A bidirectional antagonism between aPKC and Yurt regulates epithelial cell polarity » (Gamblin, C.L., Hardy, E., Chartier, F., Bisson, N. et Laprise, P. 2014).
Mon second projet, présenté dans le chapitre 3, démontre que l’oligomérisation de Yurt est cruciale pour ses fonctions dans la polarité épithéliale in vivo. De plus, nous révélons que la kinase aPKC déstabilise la multimérisation de Yurt pour réprimer les fonctions de Yurt. Ce projet est accepté dans « The Journal of Cell Biology » avec pour titre « Oligomerization of the FERM-FA protein Yurt controls epithelial cell polarity » (Gamblin, C.L., Parent-Prévost, F., Jacquet. K., Bielher, C., Jetté, A. et Laprise, P. 2018).
L’ensemble de ces travaux n’aurait pas pu être réalisé sans l’aide et la collaboration de tous les co-auteurs cités ci-dessus.
Chapitre 1 : Introduction
1.1. Les tissus épithéliaux
1.1.1.
L’organisation des épithéliums
La majorité des organes sont constitués de tissus épithéliaux permettant de délimiter des compartiments, qui sont physiologiquement et morphologiquement distincts, afin d’assurer la bonne fonction des organes. Ainsi, maintenir l’homéostasie de ces tissus épithéliaux est crucial pour la viabilité de l’organisme. Il existe plusieurs types de tissus épithéliaux composés de cellules de morphologie squameuse, cubique ou cylindrique. Les épithéliums simples sont composés d’une seule couche de cellules, alors que les épithéliums stratifiés sont composés de plusieurs couches de cellules (Figure 1.1). Ces tissus reposent sur une lame basale en contact avec le tissu conjonctif sous-jacent. Les épithéliums forment une barrière à perméabilité sélective, dont les principales fonctions sont la protection, l’absorption et la sécrétion (Rodriguez-Boulan et Macara, 2014).
Figure 1.1 : Les différents types d’épithéliums. Les tissus épithéliaux sont non vascularisés et
sont séparés du tissu conjonctif par une lame basale. Il existe différents types d’épithéliums variant selon la fonction du tissu. Ils sont constitués d’une ou de plusieurs couches de cellules aux formes diverses. Par exemple, l’épithélium intestinal est constitué d’un tissu simple cylindrique. L’épiderme, qui forme la couche superficille de la peau, est constitué d’un tissu épithélial stratifié squameux (adapté de Thibedeau et Patton, 2006).
1.1.2. Les caractéristiques des épithéliums
Les jonctions adhérentes (JA), incluant la zonula adherens (ZA), permettent une bonne cohésion des cellules entre elles. Les JA permettent également l’adhésion à la lame basale. La perméabilité sélective des tissus épithéliaux est assurée par les jonctions occlusives, appelées jonctions septées (JSep) chez les invertébrés et jonctions serrées chez les vertébrés. Celles-ci empêchent la diffusion passive protégeant ainsi le tissu sous-jacent. Ceci forme une barrière transépithéliale délimitant deux compartiments. Les cellules constituant les tissus épithéliaux contrôlent également le passage unidirectionnel de molécules entre deux compartiments comme l’absorption de nutriments ou la sécrétion vectorisée. Ceci permet de réguler la composition des compartiments et la bonne fonction des organes. La morphologie et les rôles physiologiques des tissus épithéliaux reposent sur la ségrégation de la cellule en plusieurs domaines bien distincts. Le domaine apical fait face à la lumière de l’organe ou au milieu extérieur. Le domaine latéral est en contact avec les cellules adjacentes, et le domaine basal est en contact avec le milieu interne. Le domaine apical est séparé du domaine latéral par la ZA. Cette organisation structurale est nommée polarité épithéliale. La composition biochimique asymétrique de ces membranes est entre autres générée et maintenue par la machinerie de trafic polarisé (Figure 1.2; Rodriguez-Boulan et Macara, 2014).
Figure 1.2 : Les principales caractéristiques des épithéliums. A) Schéma d’une monocouche de
cellules épithéliales reposant sur une lame basale. Ceci forme une barrière épithéliale sélective permettant de protéger le tissu sous-jacent contre le stress du milieu extérieur, tels que les pathogènes. Ces cellules permettent également de contrôler le transport vectorisé. La ZA délimite la frontière entre le domaine apical et le domaine latéral. Le domaine apical comprend la zone marginale juste au-dessus de la ZA, et la surface apicale libre faisant face à l’extérieur. B) Présentation des principales caractéristiques des épithéliums.
La polarisation des cellules épithéliales est cruciale à la morphogenèse des tissus épithéliaux, à la formation des organes et donc au développement de l’embryon. Pour cela, les cellules épithéliales présentent une plasticité très dynamique au niveau de la morphologie cellulaire et des propriétés épithéliales, afin de sculpter les tissus nécessaires au développement. La morphologie cellulaire varie en fonction du stade développemental, du type et de la fonction du tissu. Le ratio de tailles respectives des domaines membranaires
est crucial pour le maintien d’une morphologie cellulaire adéquate (Figure 1.3). Ce ratio dépend de la constriction apicale et de l’élongation latérale des cellules. La constriction apicale est principalement contrôlée par une ceinture d’actomyosine circonférentielle polarisée et localisée à la portion apicale des cellules (Lecuit et Lenne, 2007). Par exemple, l’invagination du mésoderme durant la gastrulation nécessite la constriction apicale (Dawes-Hoang, 2005). La constriction apicale est souvent accompagnée de l’élongation latérale durant la morphogenèse conduisant à la morphologie « bottle-like » favorisant l’invagination (Shook et Keller, 2003). Ce changement dans la forme cellulaire est intrinsèquement lié à l’organisation spécifique du cytosquelette d’actine.
Figure 1.3 : La plasticité de la morphologie cellulaire. A) Schéma de la constriction apicale. B)
Schéma de l’élongation du domaine latéral. C) Schéma du phénotype « bottle-like ».
La perte des caractéristiques épithéliales, nommée transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), ou la (ré)acquisition de caractéristiques épithéliales, appelée transition mésenchymo-épithéliale (MET), sont deux processus physiologiques fondamentaux très dynamiques (Figure 1.4). L’équilibre entre l’EMT et la MET doit donc être très finement régulé durant l’embryogenèse et le remodelage des tissus adultes comme la réparation des blessures. De plus, la dérégulation de cet équilibre peut conduire à des pathologies telles que le cancer (Nieto et al., 2016).
Figure 1.4 : La plasticité des propriétés épithéliales. L’acquisition ou la perte des propriétés
épithéliales varient selon le contexte biologique physiologique ou pathologique.
1.1.3. La polarité épithéliale et la progression tumorale
Plus de 80% des tumeurs sont des carcinomes d’origine épithéliale (Coradini et al., 2011). La caractéristique de la majorité des carcinomes est la perte de la morphologie épithéliale et l’acquisition de propriétés mésenchymales. De plus, la perte de l’architecture polarisée corrèle avec la malignité des tumeurs, et la perturbation de l’adhésion cellule-cellule peut promouvoir le développement de cancers (Coradini et al., 2011; Rejon et al., 2016). De multiples études montrent que l’expression ou la localisation des composants clés de la polarité épithéliale peuvent être dérégulées dans de nombreux types de cancers (Coradini et al., 2011; Ellenbroek et al., 2012; Lin et al., 2015). La perte de ces protéines peut également conduire à la formation de tumeurs spontanées et à la croissance néoplasique de cellules épithéliales prostatique chez la souris (Zhan et al., 2008; Pearson et al., 2011).
En résumé,
L’architecture polarisée des cellules épithéliales est conservée au cours de l’évolution. Ceci témoigne de son caractère indispensable à la physiologie des organismes multicellulaires. Ainsi, étudier la polarité épithéliale présente un intérêt fondamental afin de comprendre les
mécanismes régissant l’intégrité des tissus épithéliaux. De plus, la dérégulation de cette polarité épithéliale corrèle avec la progression tumorale. Acquérir ces connaissances est donc un prérequis indispensable pour fournir des pistes prometteuses pouvant être exploitées à des fins thérapeutiques, pronostic ou diagnostiques dans la lutte contre le cancer.
1.2. Drosophila melanogaster : le modèle le plus fructueux pour
étudier la polarité épithéliale
Un très grand nombre de processus développementaux sont conservés de la mouche à fruit Drosophila melanogaster à l’humain, malgré une évolution très divergente. Environ 75% des gènes impliqués dans des maladies humaines présentent un orthologue chez la drosophile (Fortini et al., 2000; Bulgakova et Knust 2009; Pandey et Nichols 2011). De ce fait, la drosophile contribue grandement à l’étude des processus biologiques fondamentaux communs avec l’humain, comme l’étude de la polarité épithéliale.
La mise en place et la maintenance de la polarité épithéliale nécessitent des processus très complexes tels que i) des signaux cellulaires venant du micro-environnement, ii) des interactions protéine-protéine très dynamiques et iii) des modulations spatio-temporelles des protéines dépendantes du stade développemental et du tissu. Étant donné que ces processus dépendent du contexte biologique, les modèles in vitro ne sont pas représentatifs. À l’inverse, les modèles in vivo intègrent les processus biologiques complexes, et permettent l’étude de ces mécanismes impliqués processus non seulement à un niveau cellulaire, mais aussi au niveau de l’intégrité et de la morphologie tissulaire. Les modèles in vivo permettent également d’évaluer l’importance des mécanismes étudiés sur le développement et la viabilité de l’organisme. Ainsi, l’utilisation de la drosophile comme modèle in vivo est un choix très pertinent pour l’étude de la polarité cellulaire.
De nombreux tissus épithéliaux simples sont utilisés pour étudier la polarité cellulaire comme l’ectoderme embryonnaire ventral, les disques imaginaux larvaires (précurseurs de structures adultes composés de feuillets de cellules épithéliales) et l’épithélium folliculaire ovarien.
1.2.1.
Le cycle de vie et l’embryogenèse de la drosophile
1.2.1.1. Le cycle de vie
Le cycle de vie d’une drosophile est de seulement 10 à 12 jours à 25°C. Il comprend le stade embryonnaire (environ 24h), le stade larvaire (4 à 5 jours), le stade de pupe (4 à 5 jours) et le stade adulte (Figure 1.5). L’obtention très rapide d’une nouvelle descendance est un atout majeur pour son utilisation en recherche.
Figure 1.5 : Le cycle de vie de la drosophile. L’embryogenèse démarre après la fertilisation de
l’œuf et compte 17 stades jusqu’à l’éclosion en larve. Ensuite, la larve évolue à travers 3 stades. Après le troisième stade larvaire, la cuticule se durcit formant ainsi la pupe lors de la nymphose. Après 5 jours de métamorphose, la mouche adulte émerge. Images tirées de Torres et al., 2011.Le développement embryonnaire
L’embryogenèse de la drosophile est un bon modèle pour l’établissement de la polarité épithéliale. L’embryogenèse se déroule en 5 grands événements développementaux répartis sur 17 stades embryonnaires : les divisions syncytiales, la cellularisation, la gastrulation, l’organogenèse et la différenciation terminale (Figure 1.6A).
Le développement embryonnaire débute par 13 divisions nucléaires successives. À la fin de ces divisions, les noyaux se répartissent en monocouche le long de la membrane de l’œuf, formant ainsi le blastoderme syncytial. Durant la cellularisation, de nouvelles membranes se forment afin d’individualiser les noyaux du blastoderme syncytial et ainsi générer le premier épithélium. L’embryon est alors appelé blastoderme épithélial (Figure 1.6B). La gastrulation est à l’origine de la formation de 3 feuillets embryonnaires : l’endoderme, le mésoderme et l’ectoderme. Ensuite, l’organogenèse nécessite d’importants mouvements morphogénétiques impliquant la bande germinale constituée d’une couche de mésoderme interne et d’une couche d’ectoderme externe. Cette bande suit un mouvement d’élongation puis de rétractation laissant un espace du côté dorsal recouvert par un épithélium extra-embryonnaire nommé l’amniosérose. L’ectoderme latéral migre le long de l’axe dorso-ventral vers la ligne médiane dorsale afin de recouvrir l’amniosérose et effectuer la fermeture dorsale. L’involution de la tête a lieu en parallèle où les structures antérieures s’internalisent. Enfin, les tissus et les organes deviennent matures durant la différenciation terminale.
Figure 1.6 : L’embryogenèse de la drosophile. A) Les principales étapes de l’embryogenèse de
drosophile. La polarité épithéliale se met en place durant la cellularisation où se forme le premier épithélium embryonnaire. Une fois la cellularisation complétée, la ZA est générée pour assurer la cohésion des cellules (Tepass et Hartenstein 1994). Aux stades tardifs du développement, les JSep se positionnent juste en dessous des ZA afin de former une barrière contrôlant la diffusion transépithéliale (Tepass et Hartenstein 1994). Image adaptée de Hales et al., 2015. B) Formation du blastoderme épithélial durant la cellularisation. Schéma de l’invagination des membranes et mise en place des jonctions adhérentes (JA). Image adaptée de Tepass, 2012.
La couche externe de l’embryon est constituée d’une monocouche de cellules épithéliales ectodermales. L’ectoderme embryonnaire ventral est un très bon modèle in vivo pour étudier la mise en place et la maintenance de la polarité épithéliale (Figure1.7).
Figure 1.7 : L’ectoderme embryonnaire ventral. A) Immunofluorescence d’un embryon au stade
14 orienté selon les axes antéro-postérieur et dorso-ventral. En rouge est marqué un déterminant de la polarité épithéliale, la protéine Yurt. Échelle 100m. B) Immunofluorescence d’une portion de l’ectoderme ventral d’un embryon au stade 14. Afin que le domaine apical soit au dessus de la ZA, l’embryon est orienté avec la face ventrale vers le haut. La protéine Yurt marquée en rouge se localise à la fois à la zone marginale du domaine apical et au domaine basolatéral à ce stade embryonnaire. La protéine Armadillo marquée en vert est une composante de la ZA. Échelle 10m (adapté de Laprise et al., 2006).
À la fin de l’embryogenèse, les cellules de l’épiderme sécrètent la cuticule via leur domaine apical. Elle contient de la chitine formant une couche protectrice pour l’embryon et la larve. Les embryons mutants pour des protéines de la polarité épithéliale présentent des défauts caractéristiques de la morphologie de la cuticule (Figure 1.8). C’est d’ailleurs lors de criblages pour identifier des mutations affectant la morphologie de la cuticule que de nombreux gènes codant des déterminants de la polarité épithéliale ont été identifiés. Par exemple, Jürgens et collaborateurs, en 1984, ont ainsi identifié et nommé de nombreux gènes codant des protéines cruciales pour la polarité épithéliale (Jürgens et al., 1984).
Figure 1.8 : Portrait de l’épiderme à la fin de l’embryogenèse. A) La sécrétion de la cuticule est
schématisée par les flèches bleues et la cuticule est représentée en gris. A’) Photo de la cuticule d’un embryon sauvage obtenu après la digestion des tissus mous. Ceci permet de visualiser l’intégrité de l’épiderme ainsi que le crochet buccal et les ceintures de denticules. B) La perte de l’identité apicale conduit à la formation de kystes de cellules où le domaine apical atrophié se retrouve au centre. Ceci conduit à la formation de grains de cuticule. B’) Photo de la cuticule d’un embryon présentant une perte de l’identité apicale (mutant crb11a22). Seuls restent les grains de cuticule comme
pointé par la flèche rouge. C) À l’inverse, l’accroissement excessif du domaine apical conduit à des kystes inversés avec le domaine apical élargi, donnant lieu à des circonvolutions de cuticule. C’)
Photo de la cuticule d’un embryon présentant des circonvolutions de cuticule comme pointé par la flèche verte (mutant lgl4 M/Z). Échelle 10m.
1.2.2. Drosophila melanogaster : un outil génétique puissant
En plus d’être un modèle in vivo adéquat pour l’étude de la polarité épithéliale et du développement embryonnaire, la drosophile est un outil génétique puissant. La drosophile ne possède que 4 chromosomes et ne présente pas de de recombinaison méiotique chez le mâle. Étant donné que c’est un modèle très utilisé, de nombreuses lignées de drosophiles mutantes et transgéniques sont mises à disposition via les banques telles que « Bloomington Drosophila Stock Center », « Drosophila Genomics and Genetic Resources », et « Vienna Drosophila Resource Center ». De plus, de nombreux outils ont déjà été mis au point (St Johnston, 2002) et de nouvelles techniques sont sans cesse en évolution et adaptées à la drosophile, comme par exemple l’optimisation de la technique CRISPR/Cas9 (Gratz et al., 2016; Ewen-Campen et al., 2017). Ainsi, la drosophile est un des modèles in vivo les plus malléables pour modifier l’expression des gènes, ce qui facilite grandement les études utilisant la drosophile (Rubin et Lewis, 2000).
1.2.2.1. Le système UAS-GAL4
Le système UAS/GAL4 permet l’expression inductible de protéines de manière tissu-spécifique. La protéine GAL4 est un activateur transcriptionnel de levure permettant d’activer l’expression d’un transgène en se liant à une séquence activatrice présente en amont du transgène, nommée UAS pour « Upstream Activating Sequence ». Il existe de nombreuses lignées exprimant GAL4 sous le contrôle d’un promoteur ubiquitaire ou tissu-spécifique, permettant ainsi de contrôler la localisation de l’expression du transgène (Brand et Perrimon 1993).
Le gène d’intérêt est cloné et inséré dans le plasmide pUASTattB contenant i) la séquence UAS, ii) un site attB permettant l’intégration du transgène à un locus précis dans le génome de la mouche grâce un site attP et à l’intégrase ФC31 (Figure 1.9A ; Venken et Bellen, 2007; Fish et al., 2007), et iii) un gène de sélection permettant de sélectionner les mouches ayant intégré le transgène (Venken et Bellen, 2005). Ce plasmide est injecté dans des embryons contenant un site attP au locus voulu afin de générer des lignées transgéniques n’exprimant pas le transgène en absence de GAL4. Ces mouches transgéniques sont ensuite croisées avec une lignée GAL4 afin que la descendance exprime le transgène dans le tissu souhaité (Figure 1.9B).
Figure 1.9 : Le système UAS-GAL4. A) Schéma du plasmide pUASTattB et de son intégration dans
le génome de drosophile grâce à l’intégrase ФC31. Le gène white (w) confère la couleur rouge aux mouches sauvages. Ici, il est utilisé comme un marqueur de sélection dominant. Le plasmide contenant w est injecté dans des mouches w- présentant des yeux blancs. Ainsi, L’intégration du
Le plasmide pUASTattB peut également être co-transfecté avec un plasmide exprimant GAL4 sous le contrôle du promoteur de l’actine (pAct5C-GAL4) dans des cellules de drosophiles en culture (cellules S2). Ainsi, avec le même plasmide, des études préliminaires (en parallèle à la création de lignées de drosophiles) peuvent être réalisées sur des cellules en culture. Ceci apporte des informations prédictives et complémentaires aux données obtenues avec les lignées transgéniques générées comme, par exemple, tester la stabilité ou la localisation de la protéine induite ou étudier des interactions protéine-protéine.
1.2.2.2. Le système CRISPR-Cas9 : la technique « scarless »
Le système « Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats » (CRISPR) « CRISPR associated protein 9 » (Cas9) permet de cibler spécifiquement une région de l’ADN génomique et d’induire des modifications précises telles que l’ajout d’une étiquette, ou des mutations ponctuelles sur le locus voulu. Ceci nécessite i) un ARN guide qui va cibler la région à modifier, ii) l’endonucléase Cas9 interagissant avec l’ARN guide et ainsi créer une cassure double brin à un site spécifique, et iii) un ADN donneur possédant la modification voulue afin de remplacer par recombinaison homologue la région ciblée. Chez la drosophile, de nombreux outils ont été mis en place afin de rendre ce système plus efficace. Il existe plusieurs lignées de drosophiles transgéniques disponibles exprimant la Cas9 et pouvant être suivie par un marqueur phénotypique (Ren et al., 2013). L’ARN guide et l’ADN donneur sont directement injectés dans un embryon exprimant cette Cas9, et par croisement génétique la Cas9 peut être éliminée en sélectionnant les drosophiles ne présentant pas le marqueur associé.
La technique « scarless » a été mise en place afin de faciliter le criblage des drosophiles ayant intégrées l’ADN donneur contenant la modification (Gratz 2016). En plus de la modification souhaitée, l’ADN donneur contient une cassette DsRed. Elle est constituée du gène codant la protéine fluorescente DsRed sous le contrôle d’un promoteur spécifique à l’œil permettant ainsi d’identifier les mouches ayant intégré l’ADN donneur. Cette cassette possède à chaque extrémité des sites reconnus par la transposase « piggyBac » (PBac) permettant l’excision de la cassette (Thibault et al., 2004). Elle est insérée dans l’intron adjacent au niveau d’un site TTAA déjà présent dans l’intron. Une fois les mouches positives sélectionnées, elles sont croisées avec une lignée exprimant la transposase PBac
permettant l’excision de la cassette sans modifier la séquence génomique, d’où le nom « scarless ». La transposase est ensuite éliminée par croisement (Figure 1.10).
Figure 1.10 : Le système CRISPR-Cas9 : la technique « scarless ». Schéma des principales
étapes conduisant à l’obtention d’une lignée de drosophiles contenant une ou plusieurs mutations précises induites par la technique CRISPR-Cas9. La recombinaison homologue permet d’inclure les mutations désirées et la cassette DsRed. Les mouches n’ayant pas intégrées la cassette DsRed peuvent toutefois présenter des modifications imprécises sur le gène ciblé suite à une réparation non fidèle de la cassure double brin (non représenté sur le schéma). Images de drosophiles tirées de
www.indiana.edu.
Les avantages de cette technique sont multiples : i) criblage rapide basé sur un phénotype observable macroscopiquement évitant ainsi le criblage de la mutation par génotypage, ii) élimination de la cassette DsRed sans laisser de trace, iii) éliminer la Cas9 et la transposase grâce à des croisements génétiques, et iv) génération d’une lignée stable hétérozygote (très avantageux dans le cas où la mutation est létale homozygote, comme c’est souvent le cas avec les gènes impliqués dans la polarité épithéliale).
1.2.2.3. La contribution maternelle dans l’embryon de drosophile
La mise en place de la transcription zygotique coïncide avec la formation du blastoderme cellulaire (Wieschaus et Sweeton, 1988). Ainsi, les étapes précoces du développement de l’embryon dépendent principalement des protéines et ARN messagers déposés dans l’œuf par la femelle lors de l’ovogenèse. Ces ARN messagers et protéines constituent la contribution maternelle. Étant donné la forte implication de la polarité épithéliale dans le développement embryonnaire, de très nombreux gènes codant des protéines de polarité présentent une contribution maternelle importante. Dans un embryon mutant zygotique (Z), cette contribution maternelle peut être suffisante pour compenser une absence de produit zygotique. Ceci peut ainsi masquer des phénotypes de polarité épithéliale et donc limiter l’étude de la fonction des gènes.
Des outils ont alors été générés afin d’éliminer cette contribution maternelle pour pouvoir étudier les phénotypes des embryons totalement dépourvus de la protéine d’intérêt, nommés mutants maternels/zygotiques (M/Z). Cette méthode est basée sur la mutation ovoD, dont une seule copie est suffisante pour provoquer un arrêt précoce de l’ovogenèse chez les femelles. Le but est de créer des clones de cellules germinales homozygotes mutantes pour le gène d’intérêt à l’aide de la Flippase (Flp) et de sites « Flippase Recognition Target » (FRT; Figure 1.11). La femelle exprime la Flp sous le contrôle d’un promoteur inductible par choc thermique (hs pour « heat shock »). Cette enzyme est induite au moment de la génération des cellules germinales durant les stades larvaires, et permet la recombinaison des sites FRT. Le gène d’intérêt muté et la mutation ovoD doivent être sur le même bras de chromosome que le site de recombinaison FRT. Les seules cellules germinales pouvant poursuivre l’ovogenèse sont celles ayant perdu la mutation ovoD et qui sont donc homozygotes mutantes pour le gène d’intérêt. Ainsi, les seuls œufs pondus sont complètement dépourvus de la contribution maternelle de la protéine d’intérêt (Chou et Perrimon 1996).
Aussi, moduler la quantité relative des protéines est un atout crucial pour étudier les interactions génétiques. Grâce à la contribution maternelle, les embryons mutants Z pour des gènes de la polarité épithéliale ne présentent pas toujours de phénotypes de polarité épithéliale, contrairement aux mutants M/Z. L’absence de phénotype de polarité dans les mutants Z offre donc un génotype sensibilisé pour l’étude d’interactions génétiques. Par
exemple, en combinant plusieurs mutations Z, des phénotypes de polarité peuvent être dévoilés et tendre vers un phénotype M/Z mettant ainsi en évidence des interactions génétiques.
En résumé,
Il est pertinent d’utiliser Drosophila melanogaster pour décrypter les mécanismes orchestrant la polarité épithéliale (Müller, 2000). Ce modèle in vivo permet i) d’intégrer la complexité de régulation de la polarité épithéliale, dont les dynamiques spatiotemporelles des protéines, ii) d’étudier le développement et la viabilité embryonnaire, ainsi que iii) l’intégrité des tissus épithéliaux. De plus, son cycle de vie très rapide, le faible coût de maintenance, ainsi que de nombreux outils génétiques mis en place en font un outil puissant et très malléable contribuant à l’avancement de la recherche fondamentale.
Figure 1.11 : Élimination de la contribution maternelle à l’aide de la mutation ovoD et du
système Flp/FRT. A) Un croisement est effectué entre des femelles hétérozygotes pour la mutation
d’intêret m et des mâles possédant la mutation ovoD et la hsFlp. B) Ensuite, la descendance est
soumise à des chocs thermiques durant la génération des cellules germinales (stade larvaire). Ceci permet des recombinaisons mitotiques entre les sites FRT notamment dans les cellules germinales. Des clones homozygotes mutants m ou ovoD sont ainsi générés. Seules les cellules germinales m/m
peuvent poursuivre l’ovogenèse donnant ainsi des œufs dépourvus de la contribution maternelle pour le gène d’intérêt. C) Ces femelles sont ensuite croisées avec des mâles hétérozygotes pour m et possédant un transgène GFP. Ainsi, 50% des œufs issus de ce croisement sont mutants M/Z pour le gène d’intérêt, et 50% sont hétérozygotes m/GFP. Ces embryons hétérozygotes peuvent être éliminés par un tri contre la GFP. Schéma inspiré de St Johnston 2002. Image de drosophile tirée de
1.3. Les jonctions cellulaires
Les jonctions cellulaires sont divisées en deux grands groupes fonctionnels : les jonctions occlusives et les jonctions adhérentes. Les forces d’adhésion assurent l’intégrité du tissu épithélial en prévenant la dissociation des cellules entre elles ou avec la lame basale. Les changements dynamiques dans les adhésions cellulaires sont indispensables pour les mouvements cellulaires lors du développement, le renouvellement des tissus et la réparation des blessures (Harris et Tepass, 2010).
1.3.1.1. Les jonctions occlusives : la barrière transépithéliale
La principale fonction du tissu épithélial est de protéger les tissus sous-jacents en créant une barrière sélective. Cette fonction est assurée par les jonctions occlusives qui forment des contacts intercellulaires circonférentiels entre les cellules épithéliales. La composition protéique, la position et l’ultrastructure de ces jonctions sont différentes entre les invertébrés et les vertébrés mais sont équivalentes au niveau fonctionnel.
Les JSep sont retrouvées chez D. melanogaster et sont positionnées au domaine latéral en dessous des ZA. Elles sont composées de protéines transmembranaires et de protéines d’échafaudage cytoplasmiques (Tableau 1.1).
Tableau 1.1 : Les JSep chez D. melanogaster. Exemples de protéines impliquées dans la formation
et/ou dans la fonction de barrière paracellulaire des JSep (d’après Izumi et Furuse, 2014).
La perte de l’expression de ces protéines peut conduire à des défauts de formation des JSep et à des défauts d’étanchéité de la barrière paracellulaire (Izumi et Furuse, 2014). L’ultrastructure des JSep est observable par microscopie électronique (Figure 1.12A). Plusieurs études ont ainsi mis en évidence l’implication de nombreuses protéines dans la formation des JSep, telle que la protéine Coracle (Cora). En effet, la formation des JSep est perdue dans des embryons mutants cora (Figure 1.12B; Genova et Fehon, 2003). La fonction de barrière paracellulaire des JSep peut être étudiée par un essai de diffusion de colorant dans la trachée de l’embryon. Le colorant « Texas Red » conjugué au dextran est injecté dans un embryon au stade tardif. Lorsque la barrière paracellulaire de la trachée est fonctionnelle, il n’y a pas de pénétration de ce colorant (Figure 1.12C). En revanche, si cette barrière est défectueuse, le colorant pénètre dans la trachée comme c’est le cas dans les embryons mutants nervana2 (nrv2), gène codant la sous-unité de Na+,K+-ATPase (Figure
Figure 1.12 : L’ultrastructure et la barrière paracellulaire des JSep. A et B) L’ultrastructure des
JSep de l’épiderme des embryons au stade 17 est observée par microscopie électronique. La pointe de flèche indique la ZA, et les JSep sont réparties entre les 2 flèches. Dans un embryon sauvage (A), les JSep sont alignées de façon régulière entre la membrane plasmique des deux cellules adjacentes, comme observé dans l’encadré. En revanche, dans un embryon mutant cora (D), les JSep sont absentes (adapté de Genova et Fehon 2003). C et D) L’étanchéité des JSep des trachées est observée grâce au colorant « Texas Red » conjugué au dextran injecté dans des embryons au stade 17. Une absence de pénétration de ce colorant est observée dans les trachées des embryons sauvages (C). En revanche, le colorant pénètre dans la trachée des embryons nrv2 (D) (adapté de Laprise et al., 2009).
Chez les vertébrés, les jonctions serrées sont localisées juste au-dessus de la ZA au niveau de la zone marginale du domaine apical (Figure 1.13A; Tsukita et al., 2001). Ces jonctions créent une barrière transépithéliale grâce à une série de points de fusion appelés « kissing points » permettant d’oblitérer l’espace extracellulaire (Tsukita et al., 2001). Elles contrôlent également la diffusion sélective de molécules et d’ions (Tsukita et al., 2001). Elles sont composées de protéines transmembranaires telles que les claudines, les « Junctional adhesion molecules » (JAM), et l’Occludine. Ces protéines interagissent en trans via leur domaine extracellulaire pour sceller l’espace intercellulaire (Van Itallie et Anderson, 2013). Elles s’associent également avec les protéines cytoplasmiques zonula occludens (ZO; Shin et Margolis, 2006). Ces ZO participent à la formation des jonctions serrées (Umeda et al., 2004). Elles interagissent également avec l’actine, permettant ainsi de relier les jonctions serrées au cytosquelette (Figure 1.13B; Fanning et al., 1998; Shin et Margolis, 2006).
Figure 1.13 : Les jonctions serrées chez les vertébrés. A) Microscopie électronique des
complexes jonctionnels de cellules épithéliales intestinales de souris. Échelle 200 nm (Image adaptée de Tsukita et al., 2001). B) Schéma des principaux composants des jonctions serrées (d’après Mateo
et al., 2015).
1.3.1.2. La zonula adherens
La ZA est une jonction adhérente qui sépare le domaine apical du domaine latéral. Le complexe cadhérines-caténines est l’unité fonctionnelle centrale de la ZA (Figue 1.14; Harris, 2012). Les cadhérines sont une famille de protéines transmembranaires comprenant la DE-Cadherin (DE-Cad) chez D. melanogaster et E-CAD chez les mammifères. E-CAD s’oligomérise en cis pour la stabilité de la ZA (Harrison et al., 2011). DE-Cad/E-CAD s’oligomérisent également en trans via le domaine extracellulaire, de façon dépendante du calcium, pour permettre l’adhésion entre deux cellules (Brüser et Bogdan, 2017). DE-Cad et E-CAD lient respectivement la caténine Armadillo (Arm) de drosophile ou l’orthologue mammifère -CATENIN (-CAT; Harris, 2012). Arm/-CAT lient également -Catenin/-CATENIN (-Cat/-CAT) qui est associée au réseau d’actomyosine (Harris, 2012). Ainsi, le complexe cadhérines-caténines est ancré à un réseau de filaments d’actomyosine, ce qui génère une ceinture d’actomyosine circonférentielle. De ce fait, la ZA relie indirectement le cytosquelette des cellules adjacentes, favorisant ainsi une forte cohésion du tissu épithélial (Figure 1.14; Bertocchi et al., 2017).
Figure 1.14 : Le complexe cadhérine/caténine de la ZA ancré au réseau d’actomyosine.
DE-Cad/E-CAD s’oligomérisent en trans et en cis pour l’adhésion cellule-cellule et pour la stabilité de la ZA respectivement. Les caténines Arm/-CAT, -CAT et p120, lient de façon directe ou indirecte le réseau d’actomyosine. Ceci permet donc d’ancrer ce complexe jonctionnel à la ceinture d’actomyosine circonférentielle.
L’équilibre entre la stabilité et la plasticité des cadhérines est fondamental pour le remodelage tissulaire durant la morphogenèse et l’homéostasie du tissu épithélial. Les cadhérines sont donc sujettes à une dynamique constante entre i) leur endocytose pour les enlever de la membrane plasmique, et ii) leur recyclage à la membrane plasmique (Brüser et Bogdan 2017). La p120 favorise la stabilité de E-CAD en inhibant l’endocytose de cette dernière (Davis et al., 2003; Brüser et Bogdan 2017).
1.4. Les principaux composants de la polarité épithéliale
La mise en place et la maintenance de la polarité épithéliale nécessite l’action concertée de nombreuses protéines organisées en différents modules associés à des domaines membranaires distincts (Tepass, 2012). Le modèle in vivo D. melanogaster a grandement contribué à l’avancement des connaissances des mécanismes impliqués dans la polarité épithéliale. Les principales protéines de de la polarité épithéliale présentées par la suite sont
