Rôle de la poly (ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1)dans la réparation de l'ADN par excision de nucléotides

ROBU MIHAELA

ROLE DE LA POLY(ADP-RIBOSE) POLYMERASE-1

(PARP-1) DANS LA RÉPARATION DE L'ADN PAR

EXCISION DE NUCLEOTIDES

Mémoire présenté

à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval

dans le cadre du programme de maîtrise en biologie cellulaire et moléculaire pour l'obtention du grade de Maître es Science (MSc)

BIOLOGIE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE FACULTÉ DE MÉDECINE

UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC

Résumé

Les dommages directs induits à l'ADN par les radiations ultraviolettes (UV) sont éliminés grâce à la réparation par excision de nucleotides (NER). La poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) est une enzyme impliquée dans différentes voies de réparation de l'ADN. Notre laboratoire a montré que la PARP-1 était activée par les dommages directs dus aux UV et que son absence retarde significativement la réparation de ces dommages dans un gène rapporteur viral. Le but de ce projet était de déterminer si la PARP-1 affectait le NER de l'ADN génomique des cellules eucaryotes. Nous avons observé un délai dans la réparation des dommages directs à l'ADN causés par les UV dans les cellules eucaryotes n'exprimant pas la PARP-1. De plus, la PARP-1 immunoprécipite in vivo avec des protéines impliquées dans la phase de reconnaissance de ces dommages. Nos résultats montrent donc que la PARP-1 joue aussi un rôle dans le NER.

Remerciements

À mon directeur de recherche, Girish Shah, pour ses conseils judicieux sur la science et sur la vie et pour sa disponibilité. La porte de votre bureau a toujours été ouverte et nos discussions m'ont aidé pour trouver une solution lorsque je ne le croyais plus possible. Vous m'avez donné la possibilité de progresser, vous m'avez permis de développer mon esprit critique, et surtout vous m'avez donné l'autonomie quant à la planification et l'exécution de mes expériences.

À Rashmi, sans laquelle mon mémoire n'aurait pas vu si rapidement la lumière au bout de tunnel. Ton expertise, ta patience et ton organisation sont pour moi des compétences à atteindre.

À Alicia, ma professeur de langue française; pour le temps passé à corriger mes textes, inclusivement cette thèse. Merci, pour nos discussions sur la science, pour les leçons de français et.. .de vie. Je suis une meilleure personne grâce à toi.

À Véronique, toujours là pour m'aider avec mes expériences;

À Febitha, grâce à toi, j'ai eu l'occasion de pratiquer mon anglais, aussi pauvre qu'il soit.

À Medini, mon premier professeur; toi, tu m'as donné le meilleur conseil-que la base de toute grande expérience était la lecture;

À mon époux, Cristian. Tu as raison, il faut posséder des compétences de conducteur auto pour achever une thèse de maîtrise, surtout quand on travaille avec des cellules synchronisées.

Et à mon fils Stephan, qui dormait dans la voiture à 9 h du soir en revenant du travail de maman.

Table des matières

Résumé ii Remerciements iii

Table des matières v Liste de tableaux xi Liste de figures xii

Chapitre 1 1 Introduction 1

1.1 Les radiations ultraviolettes 1 1.2 Dommages à l'ADN induits par les UV 3

1.2.1 Les dommages directs de l'ADN 4 1.2.2 Les dommages indirects à l'ADN 7 1.3 Réponses cellulaires aux dommages à l'ADN causés par les UV 9

1.3.1 Arrêt du cycle cellulaire 10 1.3.2 La réparation de l'ADN 11

1.3.2.1 Réparation par excision de nucleotides 12 1.3.2.2 La réparation par excision de bases 23

1.3.3 La mort cellulaire 26 1.3.4 La mutagenèse 29 1.4 La poly(ADP-ribosyl)ation 31

1.4.1 Le poly(ADP-ribose) 31 1.4.1.2 L'anabolisme 32 1.4.1.3 Les protéines acceptrices des pADPr 33

1.4.1.4 Le catabolisme 34 1.4.2 La poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) 35

1.4.2.1 Le domaine de liaison à l'ADN (DBD) 36 1.4.2.2 Le domaine d'auto-modification 37

1.4.2.3 Le domaine catalytique 38 1.5 La grande famille des poly(ADP-ribose) polymerases 38

1.6 Les fonctions de la PARP-1 etdespADPr 41 1.6.1 Dans la signalisation des dommages à l'ADN 41

1.6.2 Dans la réparation de l'ADN 42 1.6.2.1 PARP-1 dans le remodelage de la chromatine 43

1.6.2.4 PARP-1 dans le NER 48

Chapitre II 50 Le contexte et les objectifs de la recherche 50

Chapitre III 52 Matériel et méthodes 52

3.1 Les cellules 52 3.2 Synchronisation cellulaire 53

3.3 Irradiation aux UVC 53 3.4 Détection de la cinétique de réparation des T-T par cytometric en flux 53

3.5 Détection de la cinétique de réparation des T-T par immunofluorescence 54

3.6 Immunobuvardage (Western blots) 55 3.7 Extraction de la chromatine soluble/insoluble 56

3.8 Co- Immunoprecipitation (Co-IP) 57

Chapitre IV 59 Résultats 59 4.1 La depletion de la PARP-1 diminue la cinétique de réparation des T-T dans les

fibroblastes humains irradiés aux UVC 59 4.1.1 Retardement de la cinétique de réparation des T-T déterminée par FACS dans les

fibroblastes humains synchronisés en Gl/S avec la L-mimosine 59 4.1.2 Retardement de la cinétique de réparation des T-T déterminée par

immunofluorescence, dans les fibroblastes humains synchronisés en Gl/S avec la

L-mimosine 62 4.1.3 Retardement de la cinétique de réparation des T-T déterminée par FACS dans les

fibroblastes humains synchronisés en Gl/S par le blocage thymidine-sans sérum 64 4.2 La depletion de la PARP-1 affecte le niveau de protéines impliquées dans la réparation

par excision de nucleotides 66 4.3 PARP-1 interagit physiquement avec la XPA et la XPC après irradiation aux UVC 68

Chapitre V 73 Discussion 73 5.1 Effet de la PARP-1 sur la cinétique de réparation de CPD de type T-T 74

5.2 Effet de la PARP-1 sur le recrutement des protéines XPA et XPC 76

Chapitre VI 82 Conclusions et perspectives 82

Liste d'abréviations

*02 - l'oxygène singulet 3-AB - 3-amino benzamide

5'dRP - 5' désoxyribose-5 phosphate

6-4PP - photoproduits pyrimidine (6-4) pyrimidone 8- oxoG - 8-oxo-7,8-dihydroguanine

ADN - acide désoxyribonucléique Alcl - amplified in liver cancer 1 AP - apurinique/apirimidinique

APLF - aprataxin and PNKP like factor ARH3 - ADP-ribosylhydrolase

ARN - acide ribonucléique

ARN PolIIo - elongating RNA polymerase II complex ARNi - l'interférence à l'ARN

ATM - ataxia telangiectasia mutated

ATR - ataxia telangiectasia and Rad3 related ATRIP - ATR interacting protein

BER - réparation par excision de bases B-NHEJ- back-up NHEJ

BRCT - breast cancer susceptibility protein, BRCA-1, C-terminal CBS - carcinomes baso-cellulaires

C-C - cytosine-cytosine

CDK - cyclines-dépendantes kinases

CHIP - immunoprecipitation de la chromatine Chkl/2 - checkpoint kinases

Co-IP - co-immunoprécipitation CPD - dimères de type cyclobutane

C-T - cytosine-thymidine

DAPI - 4',6-diamidino-2-phenylindole

DAR - réparation associée aux domaines transcriptionnels DDB2 - DNA damage-binding protein 2

DNA-PK - DNA-dependent protein kinase D-NHEJ - NHEJ dépendante de DNA-PK DSB - cassures double brin

DSBR - réparation de cassures double brin

ERCC1 - excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 1

ERK - extra-cellular signal regulated kinase FACS - cytometric

FADD - Fas-associated via death domain protein Fas - TNF receptor superfamily, member 6 FasL - Fas ligand

FEN1 - flap endonuclease-1 fl, fil et fill - doigts de zinc FITC - fluorescein isothiocyanate GGR - réparation globale de génome H - histones

h - heures

HAT - histone acetyltransferase

HCR - réactivation dans les cellules hôtes HMG - high mobility group

HR - homologous recombination J/m - joule par mètre carré JNK - c-Jun N-terminal kinase

Ku70 - ATP-dependent DNA helicase II 70 kDa subunit MAPK - mitogen-activated protein kinases

MDM2 - mouse double minute 2 protein

NAD+ - nicotinamide adenine dinucleotide, forme oxydée

NAM - nicotinamide

NER - réparation par excision de nucleotides NF-tcB - nuclear factor kappa B

NHEJ - non-homologous end-joining pADPr - polymères d'ADP-ribose

PARG - poly(ADP-ribose) glycohydrolase PARP - poly(ADP-ribose) polymerase PCNA - proliferating cell nuclear antigen PIP - PCNA interacting protein

PI - iodure de propidium pol P - ADN polymerase P RFC - replication factor C

ROS - espèces réactives de l'oxygène RPA - replication protein A

RT-PCR - real-time polymerase chain reaction SEM - erreur standard à la moyenne

SSBR - réparation de cassure simple brin SWI/SNF - SWI/SNF protein

TCR - réparation couplée à la transcription TFIIH - transcription factor IIH

TFIIS - RNA polymerase II elongation factor TLS - translesion synthesis

TNF-R1 - tumor necrosis factor receptor 1 TNFa - tumor necrosis factor

TRAIL 1/ 2 - TNF-related apoptosis inducing ligand 1/2 T-T - thymidine-thymidine

TTD - Trichothiodystrophie UV - radiations ultraviolettes

XRCC1 - X-ray repair cross complementing protein 1 y-H2AX - histone H2AX phosphorylée sur la serine 139

Liste des tableaux

Chapitre I

Liste des figures

Chapitre I

Figure 1. Le spectre solaire

Figure 2. Dommages à l'ADN induits par les UV

Figure 3. Formation des principaux dommages directs de l'ADN par les UV Figure 4. Les réponses cellulaires aux UV

Figure 5. Le mécanisme du NER Figure 6. Le mécanisme du TCR Figure 7. Le mécanisme du BER

Figure 8. Le métabolisme du poly(ADP- ribose) Figure 9. La structure de la PARP-1

Figure 10. La superfamille des poly(ADP-ribose) polymerases

Figure 11. Le réseau qui lie la relaxation de la chromatine à l'efficacité de la réparation

Chapitre IV

Figure 12. Effet de la depletion de la PARP-1 sur la cinétique de réparation des T-T dans les fibroblastes humains synchronisés avec la mimosine

Figure 13. Effet de la depletion de la PARP-1 sur la réparation de T-T in vivo analysé par immunofluorescence

Figure 14. Effet de la depletion de la PARP-1 sur la cinétique de réparation des T-T dans les fibroblastes humains synchronisés par le blocage thymidine-sans sérum Figure 15. L'absence de la PARP-1 affecte le niveau protéique de la XPA et les modifications de la XPC

Figure 16. Immunoprecipitation de la PARP-1 avec la XPA dans les fibroblastes humains après l'irradiation aux UVC

Figure 17. Immunoprecipitation de la Flag-PARP avec les XPA et XPC dans les fibroblastes humains après l'irradiation aux UVC

Chapitre V

Figure 18. Un modèle pour le mécanisme de recrutement de XPC et XPA par la PARP-1 dans le NER

Chapitre I

Introduction

L'ADN est la molécule responsable de la maintenance et la transmission de l'information génétique, d'où l'importance de la protéger contre des dommages. Les agents qui peuvent induire des dommages à l'ADN et leurs effets sont le sujet de nombreuses recherches depuis des décennies. Historiquement, étant donné leur importance évolutive et environnementale, les radiations ultraviolettes (UV) sont les agents les plus étudiés [1] et peuvent être considérées comme le carcinogène physique le plus important et ubiquitaire. Ainsi, plus de la moitié des cancers de la peau d'origine kératinocytaire, les carcinomes baso-et spino-cellulaires (CBC, CSC), se développent dans les zones corporelles photo-exposées baso-et portent des mutations caractéristiques des rayons UV (les transitions C vers T et les mutations en tandem CC vers TT) dans le gène suppresseur de tumeur p53. Les CBC et les CSC occupent le premier rang (environ 30%) de toutes les tumeurs humaines et leur incidence augmente d'au moins 10% chaque année [2]. L'étude des mécanismes moléculaires assurant la protection de l'ADN est donc essentielle pour améliorer la prévention et le traitement des cancers cutanés photo-induits.

1.1 Les radiations ultraviolettes

Le spectre solaire est composé de radiations électromagnétiques divisées selon la longueur d'onde dans trois catégories : ultraviolettes (45%), visibles (5%) et infrarouges (50%). Les radiations UV ont une longueur d'onde située entre 100 et 400 nm (figure 1).

Content in sunlight 5%

<— H-

50 % * « 45% Ultraviolet light Visible Light Infrared Light UVC UVB UVA

Visible Light

Infrared Light

H"! 294) 320 400 780 _(nm)

Figure 1. Le spectre solaire. Tiré de Svobodova et al., 2006 [3]

Les radiations UV sont de trois catégories : les UVA (315-400 nm), les UVB (280-315 nm) et les UVC (100-280 nm). La couche d'ozone absorbe les radiations qui ont moins de 310 nm, donc tous les UVC et la majeure partie des UVB (95%).

Les UVA représentent plus de 95 % des radiations UV qui touchent la terre. Ces radiations à longueur d'onde longue pénètrent profondément dans la peau et se rendent jusqu'au niveau du derme. Les photons UVA sont moins énergétiques, mais leur intensité est

bien plus grande que celle du rayonnement UVB. Elles ne sont pas directement absorbées par l'ADN, mais elles peuvent néanmoins exciter des chromophores endogènes ou exogènes capables ensuite de générer des espèces réactives de l'oxygène (ROS) et de modifier la structure chimique de l'ADN [3].

Les UVB sont plus énergétiques et sont presque en totalité absorbée par l'épiderme; seulement 10 à 20% arrivent au niveau basai. Elles peuvent être directement absorbées par l'ADN des cellules et y induire des réactions de dégradation impliquant les bases pyrimidiques, thymine et cytosine. C'est d'ailleurs la raison pour laquelle la majeure partie du pouvoir cancérigène de la lumière solaire leur est attribuée [4-5].

Les UVC sont les plus énergétiques, mais les moins pénétrantes des rayons UV. Elles sont très mutagènes et toxiques et peuvent induire des dommages à l'ADN et aux protéines seulement après une courte exposition. Heureusement, elles sont absorbées en totalité dans l'atmosphère par la couche d'ozone [3].

1.2 Dommages à l'ADN induits par les UV

Quand les UV frappent la peau, une partie de leur énergie est dissipée, mais une autre partie est absorbée par les chromophores. Ce sont des molécules capables d'absorber l'énergie lumineuse par la transition de leurs électrons du niveau de base au niveau d'excitation. Les principaux chromophores pour les UV sont l'ADN et ceux qui génèrent les espèces réactives de l'oxygène [6]. Les photons peuvent induire deux types de dommages : directs entre des pyrimidines adjacentes et ainsi former les dimères de type cyclobutane (CPD) et les photoproduits pyrimidine (6-4) pyrimidone (6-4 PP), et indirects via des espèces oxydatives pouvant entraîner la formation de bases oxydées ou des cassures simple brin de l'ADN (figure 2) [1,7].

250 Chromophores DNA damage Reaction type Wavelength (nm) 300 350 -H- 400 ssDNA breaks, DNA-protein crosslinks Pyrimidine dimers 6-4 photoproducts Direcl Mixed Indirect 450

Figure 2. Dommages à l'ADN induits par les UV. Modifié de Rass et Reichrath, 2008 [4]

1.2.1 Les dommages directs de l'ADN

En général, le type de dommage dépend de la longueur d'onde de la radiation. À cause de la structure en hétérocycles aromatiques de ses bases, l'ADN peut absorber des radiations avec une longueur d'onde comprise entre 200 et 290 nm très efficacement, ce qui fait qu'il est le principal chromophore des UVC et d'une partie des UVB [6, 8]. Le rayonnement UV lointain (UVC et UVB) conduit à l'excitation des bases thymine et cytosine et forme plusieurs types de photoproduits : les dimères de type cyclobutane (CPD) et les photoproduits pyrimidine (6-4) pyrimidone (6-4 PP).

Les CPD représentent la majorité des dommages directs causés par les UVC et UVB. Ils sont formés par la saturation de double lien entre les carbones C4 et C5 des pyrimidines adjacentes (T-T, C-C ou C-T) pour former une structure en anneau de cyclobutane (figure 3). Le deuxième type de dommage direct, les 6-4 PP sont souvent des T-C, C-C et rarement des T-T et sont formés par le transfert de double lien entre les carbones 5 et 6 de la pyrimidine en 5' au carbone de la position 4 de la pyrimidine en 3'. Le résultat est un intermédiaire instable qui est réarrangé spontanément dans un 6-4 PP. L'exposition des 6-4 PP - qui présentent un maximum d'absorption dans les UVB - aux UVB ou UVA, peut entraîner un changement de leur conformation pour former des isomères de Dewar [1,9].

Les CPD et les 6-4 PP représentent respectivement 70% et 20% des dommages directs induits par les UV [10]. Les CPD forment un angle de 7 à 9° par rapport à la conformation B de l'ADN [11] et sont considérés comme les dommages créés par les UVB causant la majorité des mutations, puisqu'ils sont produits en plus grande quantité que les 6-4 PP [10] et que leur réparation est beaucoup plus lente [12]. Les 6-4 PP sont des dommages hautement mutagènes, créant des distorsions de 44° par rapport à la conformation B de l'ADN [11] et ils sont réparés plus rapidement que les CPD. Les CPD et les 6-4 PP sont considérés comme des dommages encombrants de l'ADN («bulky adducts») et sont réparés par le système de réparation par excision des nucleotides (NER). D'autres types de dommages à l'ADN ont été décrits, comme les doublets purine-purine et purine-pyrimidine, mais leur rôle dans la cancérogenèse est inconnu [13].

pt. N ^

Sugar H J " H CH,

Phosphate Adjacent thymines

Sugar N yZ = 0

y

/=<

H CH» Cyclobutane pyrimidine dimer

-s£>

' " ^ , - f c . H CH,

Dewar valence isomer

Figure 3. Formation des principaux dommages directs de l'ADN par les UV. Tiré de Batista et al., 2009 [1]

• 7 9 A

On peut avoir un dommage à chaque 10 bases par J/m pour les UVB et un par 10 bases par J/m pour les UVC. A dose d'UVB égale, huit CPD (ciblant surtout les séquences TT) sont formés pour un 6-4 PP (ciblant les séquences CC) [14]. Il est rapporté dans la littérature, que l'exposition de cellules aux UVA induit la formation de dimères de type cyclobutane contenant deux thymines, mais très peu de ceux contenant une cytosine [13]. La formation des CPD induite par les UVA n'est pas due à une absorption des photons par l'ADN, mais plutôt à un processus de photosensibilisation par transfert d'énergie triplet [15]

et elle est moins efficace que dans le cas des UVB, par un facteur de 104-105 [13]. De plus,

les CPD induits par les UVA sont plus persistants que ceux produits par les UVB [15-16]. Enfin, il n'a pas été détecté de (6-4) PP, ni d'isomère de valence Dewar, dans les cellules irradiées aux UVA [17].

1.2.2 Les dommages indirects à l'ADN

Les UVB et les UVA, en plus d'être directement absorbés par l'ADN, peuvent exciter d'autres chromophores (mélanine, protéines qui contiennent des groupements porphyrine, hème ou flavine) et les convertir dans des molécules instables, très énergétiques, capables de transférer leur énergie aux autres molécules adjacentes (lipides, protéines ou acides nucléiques) et/ou aux molécules d'oxygène. Celles-ci génèrent des espèces réactives de l'oxygène (ROS), principalement le peroxyde d'hydrogène et le superoxyde. La peau contient des mécanismes de défense contre les ROS constitués d'enzymes (catalase, glutathion) et d'antioxydants naturels (acide ascorbique, a-tocophérol) [6]. Après l'irradiation aux UV, les ROS sont produits dans une si grande quantité qu'ils induisent le déséquilibre prooxydant/antioxydant défini comme stress oxydatif.

Le dommage à l'ADN est produit via deux réactions d'oxydation, type I et type II [18]. Le type I est basé sur le transfert des électrons des chromophores directement à l'ADN avec la formation des bases oxydées. Le type II consiste dans le transfert des électrons à l'oxygène singulet ('02), qui va endommager l'ADN. Il a été ainsi montré dans des cellules humaines que les lésions majoritaires étaient des purines oxydées, en particulier la 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG). Les dommages aux pyrimidines et les cassures de chaînes sont générés en plus faible quantité. Ces derniers résultats suggèrent que des radicaux hydroxyles sont produits, mais que l'espèce oxydante majoritaire est l'oxygène singulet. Il faut également ajouter que les effets délétères des UV peuvent être augmentés par des agents exogènes (e.g. des antibiotiques de la famille des fluoroquinolones) [19].

En plus de l'ADN nucléaire, l'ADN mitochondrial peut être endommagé par les ROS. Le processus de réparation dans les mitochondries est moins efficace, menant à l'accumulation rapide des mutations et empêchant la phosphorylation oxydative [3].

Les ROS induisent aussi des dommages aux protéines cellulaires, aux lipides et aux saccharides. Ils peuvent endommager la membrane interne mitochondriale ce qui résulte dans la perte de potentiel de membrane, la libération de cytochrome c et le déclenchement de la voie intrinsèque de l'apoptose [1]. Les dommages photooxydatifs à l'ADN sont réparés par le système de réparation par excision de bases (BER).

En conclusion, dépendamment de la structure chimique des chromophores et de la longueur d'onde de la radiation, les UV peuvent causer différents types de dommages : les UVC, UVB et les UVA causent des dommages directs à l'ADN et les UVB et les UVA induisent aussi des dommages indirects. Dans les deux cas, ces dommages sont létaux, mutagènes ou carcinogéniques et déclenchent des réponses cellulaires.

1.3 Réponses cellulaires aux dommages à l'ADN causés par les UV

Lorsqu'une cellule est exposée à un stress génotoxique, son cycle de division est temporairement arrêté pour permettre la réparation de l'ADN et éviter ainsi l'apparition de mutations dans les générations suivantes de cellules. La prolifération cellulaire reprend ensuite. Si la fréquence des dommages est trop élevée ou la réparation inefficace, les cellules enclenchent un processus de mort cellulaire programmée, l'apoptose (figure 4). Au niveau de la peau, ces réponses cellulaires sont accompagnées de modifications dans la matrice extracellulaire, initiation de l'inflammation et augmentation de la pigmentation.

UV irradiation

Death receptor clustering Fas; TNF-R

Des ces réponses cellulaires, les sections suivantes traitent plus en detail la réparation de l'ADN par excision de nucleotides, car elle fait l'object principal de mon mémoire.

1.3.1 Arrêt du cycle cellulaire

Les dommages à l'ADN, directs et indirects, induits par les UV, déclenchent plusieurs cascades de signalisation. D'abord, le dommage est reconnu, suivi par l'induction rapide de l'arrêt du cycle cellulaire (figure 4). Les CPD et les 6-4 PP distordent la double hélice d'ADN d'un angle de 7 à 9° et 44° respectivement. La courbure de l'ADN constitue le signal d'alarme pour les protéines senseur Rad9, Radl et Husl (complexe 9-1-1). Une fois le dommage reconnu, la kinase ATR sera recrutée aux brins simples par son partenaire ATRIP et va phosphoryler plusieurs protéines de point de contrôle Gl/S, incluant les kinases Chkl et Chk2. Chkl est une enzyme active constitutivement et sa phosphorylation par l'ATR [21] ne régule pas son activité, mais plutôt sa localisation subcellulaire. Dans les cellules non-endommagées, une grande quantité de Chkl est associée à la chromatine ; après l'induction du dommage Chkl est dissocié et transféré vers les centrosomes avec la formation et l'activation du complexe cycline Bl/Cdkl [22-23]. Une des protéines cibles de Chkl est la phosphatase Cdc25A. La phosphorylation par Chkl mène à son ubiquitinylation et sa dégradation, supprimant l'activation de Cdkl et Cdk2 ce qui bloque l'initiation de la replication via le Cdc45. Le Cdc45 est responsable du recrutement de la polymerase alpha dans le complexe de pré-réplication [23-24].

En réponse aux UV, les mêmes kinases peuvent phosphoryler la p53 inhibant son interaction avec MDM2 et permettant ainsi l'accumulation de p53 dans le noyau. Dépendamment du niveau de dommages à l'ADN et de l'endroit où elle est phosphorylée, p53 peut induire un arrêt du cycle cellulaire par la transactivation de différents gènes, dont p21, GADD45, 14-3-3Ô. La p21 induit un arrêt dans la phase Gl du cycle cellulaire via sa fonction d'inhibiteur des cyclines-dépendantes kinases (CDK) [23] et par son interaction directe avec PCNA. L'interaction de p21 avec PCNA réprime sa fonction réplicative sans

affecter sa fonction dans la réparation de l'ADN endommagé [25]. La transition G2/M est empêchée par l'induction de GADD45 et du complexe 14-3-35. Le complexe 14-3-3Ô régule le point de contrôle G2/M par la liaison et la séquestration de la phosphatase Cdc25 dans le cytoplasme; cela empêche l'activation du complexe cycline B/Cdc2. GADD45 lie Cdc2 et dissocie le complexe cycline B/Cdc2 [26]. La cycline D est aussi régulée négativement, ce qui augmente l'interaction de p21 avec la complexe cycline E/Cdk2 et prolonge l'arrêt du cycle cellulaire [8].

À part l'activation des voies impliquées dans la réponse aux dommages à l'ADN, les UV provoquent d'autres réponses cellulaires qui impliquent l'association et l'internalisation de plusieurs facteurs de croissance et cytokines menant à l'activation de cascades de signalisation, dont les kinases MAP, JNK et p38. L'induction des kinases MAP dépend de la dose, du temps d'exposition et de la longueur d'onde des UV et régule la croissance cellulaire, la survie, le remodelage de la chromatine et l'apoptose. p38 active le point de contrôle G2/M par la phosphorylation de Cdc25B [26-27] ce qui résulte dans une liaison prolongée entre le 14-3-3 et les Cdc25 dans le cytoplasme. Les Cdc25B sont impliquées dans l'entrée en mitose par l'activation du complexe cycline B/Cdc2.

1.3.2 La réparation de l'ADN

L'ADN cellulaire est exposé de façon continue aux dommages induits par les produits de métabolisme endogène et par les sources environnementales. Ces dommages peuvent avoir des effets mutagéniques et cytotoxiques avec des conséquences pour l'intégrité du génome et le bon fonctionnement de la cellule. Ce n'est donc pas surprenant que plusieurs types de voies de réparation aient évolué dans tous les organismes pour assurer la protection maximale contre les dommages à l'ADN : la réparation par excision de nucleotides (NER), la réparation par excision de bases (BER) et la réparation de cassures double brin (DSB) [28]. Les dommages directs et indirects induits par les UV sont éliminés majoritairement par deux

1.3.2.1 Réparation par excision de nucleotides

Le NER est la voie de réparation la plus versatile et flexible, parce qu'au lieu d'avoir des enzymes spécifiques pour chaque type de lésion comme le BER, elle sent la présence des dommages via la distorsion qu'ils causent à l'ADN. L'importance du NER est attestée par l'existence de maladies humaines graves, dont le prototype est la Xeroderma pigmentosum (XP), une maladie rare, à transmission autosomique et récessive. Tous les patients atteints de XP présentent une forte sensibilité aux UV, accompagnée dès le plus jeune âge de nombreuses lésions cancéreuses (CBC et CSC). Chez certains patients, ces manifestations cutanées s'associent à des anomalies du développement et neurologiques de sévérité variable. Deux autres maladies associées à une NER défectueuse sont le Syndrome de Cockayne (CS) et la Trichothiodystrophie (TTD). La caractéristique commune de ces trois maladies est la photosensibilité (tableau 1) [29].

L'étude de complémentation avec des cellules provenant des patients atteints de XP, CS et TTD a fortement contribué à la dissection des différentes étapes du NER et à l'identification des gènes qui codent pour les protéines impliqués dans le NER. Ces protéines ont été nommées d'après leur groupe de complémentation ; il a été identifié sept groupes de complémentation XP (XP-A à XP-G) et deux pour le CS (CS-A et CS-B) [30]. Le TTD est dû à des mutations dans plusieurs gènes impliqués dans NER.

Le NER reconnaît et répare une très grande variété de lésions, incluant celles induites par les UV (les CPD et 6-4PP), par le tabac (les «adducts» de benzopyrene) et par les produits chimiques carcinogènes comme la cisplatine (les liaisons intra- et inter-brins). Le NER peut aussi reconnaître et réparer quelques dommages oxydatifs qui pose des problèmes au BER, comme les cyclopurines et malondialdehydes [31-32].

Tableau 1. Les caractéristiques cliniques et cellulaires des syndromes associés au NER. Tiré de Cleaver et al, 2009 [29]

Characteristic Xeroderma pigmentosum Trichothiodystrophy Cockayne syndrome

Genes XPA-V and XPV XPB, XPD, TTDNl and TTDA CSA, CSB, XPD and XPG

Clinical features

Cutaneous photosensitivity ++ -or + +

Pigmentation disturbances + _-

-Corneal abnormalities ++ _-

-Oral abnormalities + _-

-Actinic keratoses + _-

-Skin cancer (basal, squamous

and melanoma) ++ -

-Neurological degeneration -or + _- ++

Slow growth rate -or + ++ ++

Impaired sexual development -or + -or + +

Sensorineural deafness -or + -or + ++

Mental retardation -or + ++ ++

Ichthyosis - -or +

-Brittle (sulphur-deficient) hair _- ++

-Peculiar faciès - + +

Retinopathy _- - ++

Dental caries - + ++

Lifespan Reduced 6 yrs (median) 12.25 yrs(mean)

Cellular features

Hypermutability ++ To be determined To be determined

Global genome repair ++ -or +

-Transcription-coupled repair ++ -or + ++

L'ordre séquentiel dans lequel les différentes protéines du NER interviennent à partir de l'étape de reconnaissance a fait l'objet de nombreux travaux. En particulier, l'identité des protéines responsables de la reconnaissance des différentes lésions dans l'ADN était le sujet de débats, parfois lié aux conditions expérimentales. L'utilisation de la technique d'irradiation locale, qui permet d'endommager une portion spécifique du noyau en utilisant un filtre de polycarbonate contenant des pores de 3-8 um, a confirmé que le NER suppose l'assemblage séquentiel et coordonné de protéines seulement au site des dommages [30, 33]. Le schéma classique de NER est constitué de l'enchaînement des étapes suivantes (figure 5):

a) La reconnaissance de la distorsion de l'ADN. Le NER est divisée en deux sous-voies dépendamment de la localisation du dommage : la réparation couplée à la transcription (TCR) est sélective pour les dommages localisés sur le brin transcrit des gènes transcriptionnellement actifs et la réparation globale de génome (GGR) qui agit dans le reste du génome. Récemment, on parle aussi de la réparation associée aux domaines transcriptionnels (DAR) qui est sélective pour les dommages localisés sur le brin non-transcrit des gènes transcriptionnellement actifs [32, 34] et pour les lignées cellulaires qui ont une forte réduction de la voie GGR. En fonction du type de lésion dans l'ADN, les protéines intervenant dans cette étape peuvent être soit XPC, soit XPE (figure 5a).

b) Le recrutement des facteurs du NER dans le complexe ouvert. Les helicases XPB et XPD contenues dans le TFIIH déroulent la double hélice d'ADN en présence d'ATP pour former une «bulle». L'identité de la lésion est ensuite vérifiée par XPA et le complexe est stabilisé (figure 5b).

c) L'incision, puis l'élimination d'un oligonucleotide simple brin de 27 à 34 bases par l'intervention de deux endonucleases simple brin, XPF - ERCC1 en 5' de la lésion, puis XPG en 3' (figure 5c).

d) La synthèse du nouveau brin. La replication fidèle de l'ADN simple brin par les ADN polymerases e et ô comble la brèche de façon stable et l'ADN néo-synthétisé est lié par l'ADN ligase.

Exogenous damage (eg. UV)

Endogenous damage (e.g. ROS)

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Exogenous antioxidants Endogenous antioxidants

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b.

Transcription-coupled repair

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TF1IH-mi

ERCCl

1.3.2.1.1 La reconnaissance du dommage

Il y a deux préalables pour l'activation du NER : une distorsion de la double hélice d'ADN et une modification chimique de l'ADN. Le type de lésion dans l'ADN, CPD ou 6-4PP, semble jouer un rôle primordial dans le recrutement des protéines de reconnaissance et le début du GGR. Le rôle des protéines XPA, RPA, XPC et DDB2 dans la reconnaissance du dommage a été plus particulièrement étudié. On a longtemps pensé que XPA, une protéine à doigts de zinc présentant une forte affinité pour les lésions à l'ADN, pouvait être «la» protéine de reconnaissance. Des modèles in vitro et in vivo, en utilisant la technique d'irradiation locale, ont démontré que XPC est la première protéine recrutée au niveau des sites d'irradiation, y compris en l'absence de XPA (dans des cellules du groupe de complémentation XP-A). En miroir, XPA ne se concentre pas au niveau des sites d'irradiation en l'absence de XPC (dans des cellules du groupe de complémentation XP-C), indiquant le caractère primordial et obligatoire de la protéine XPC pour la formation du complexe d'incision [33].

La protéine XPC se retrouve dans un complexe hétérotrimérique constitué des protéines XPC, HR23B et centrine 2 [30, 32, 35-36]. HR23B forme un complexe avec XPC [37] et la stabilise en empêchant sa dégradation protéosomale [38]. De plus, son orthologue Rad3 contient des domaines «ubiquitin-like» qui sont requis pour le NER suggérant un rôle dans l'ubiquitinylation de XPC [32, 39]. La centrine 2 n'est pas nécessaire pour le NER (les expériences de réparation in vitro fonctionnent sans elle), in vivo elle stabilise le complexe et améliore le NER [30]. XPC a une activité de liaison de l'ADN et manifeste une préférence pour les jonctions simple brin-double brin [40]. Donc, la distorsion de l'ADN associée avec un déroulement local sont des facteurs essentiels pour la liaison forte de la protéine XPC à l'ADN. Des données récentes [41] ont démontré que la présence du dommage n'est pas nécessaire pour cette liaison; XPC reconnaît et interagit avec des bases non appariées situées sur le brin non endommagé. Cette spécificité faible de la XPC explique pourquoi : 1) pour éviter la vérification excessive de l'ADN, le niveau nucléaire de la protéine est contrôlé par un transport continu

noyau-cytoplasme [42] et 2) l'efficacité du GGR dépend du type de dommage (CPD versus 6-4 PP) [43].

Un problème avec la détection de dommages via la distorsion de la double hélice est que les UV n'induisent pas le même degré de distorsion. Les 6-4PP causent une distorsion de 44° par rapport à la conformation B de l'ADN et représentent un bon substrat pour le NER, ce qui n'est pas le cas pour les CPD qui forment un angle de seulement 7 à 9° par rapport à la conformation B de l'ADN. Les expériences in vitro ont montré une faible affinité de la protéine XPC pour les CPD (de type T-T), expliquant ainsi l'intervention du complexe protéique UV-DDB.

En effet, DDB2 stimule in vivo la réparation des lésions CPD (T-T), à l'origine de moins de distorsions que les 6-4PP [44]. Le complexe UV-DDB pourrait aider à la reconnaissance par la XPC des lésions qui donnent peu de distorsions, probablement en amplifiant localement l'altération de la structure de l'ADN, via l'ubiquitinylation des histones H2A, H3 et H4. [32, 45-46]. XPC serait la protéine de reconnaissance, agissant seule et en premier pour les 6-4PP, et de concert avec le complexe XPE pour les CPD [47]. L'affinité de XPC pour les CPD augmente dans les cellules surexprimant le XPE, suggérant que le recrutement de XPC est fait par XPE [48].Cette affirmation est aussi soutenue par l'observation que la transfection du gène XPE dans les cellules humaines mutées pour la p53 et qui ont un niveau de base de XPE très faible, augmente le GGR de CPD [30, 49]. Récemment, il a été montré que le complexe XPE (DDB1/DDB2) s'associait in vivo avec cullin 4A, Rocl et le signalosome COP9 connues comme ayant une activité ubiquitine-ligase [50]. Ce complexe est activé par les UV et poly-ubiquitinyle XPC et DDB2. L'ubiquitinylation de la DDB2 mène à sa dégradation, seulement quelques heures après l'irradiation aux UV [51]. La poly-ubiquitinylation de la XPC ne cause pas sa dégradation, mais augmente l'affinité pour l'ADN [52]. Ce mécanisme permet probablement de faire l'échange entre un complexe fort ADN-DDB2 avec un complexe de faible affinité ADN-XPC [32, 53].

Les XPC et DDB2 sont dispensables pour la sous-voie du NER appelée TCR, une voie qui agit seulement dans le brin transcrit de gènes transcrits de façon active (figure 6). Découverte il y a 25 ans [54], elle reste mal connue au niveau moléculaire. On considère que sa signature est la réparation rapide de dommages capables de bloquer de façon efficace la ARN PolIIo («elongating RNA polymerase II complex») [55]. Deux autres protéines sont nécessaires pour la reconnaissance du dommage, CSA et CSB, car les patients qui possèdent des mutations pour ces deux protéines ne sont pas capables de TCR. CSA fait partie du complexe E3-ubiquitine ligase avec DDB1, cullin4A, ROCl/Rbxl et le signalosome COP9 (CSN). En réponse aux UV, le CSN s'associe avec CSA et inactive son activité ubiquitine-ligase, ce qui suggère que CSA est impliquée dans le TCR sous sa forme inactive [31, 50]. Des travaux récents ont montré que le complexe CSA est responsable de l'ubiquitinylation et la dégradation de la CSB après l'irradiation aux UV, ce qui établirait un lien fonctionnel entre CSA et CSB [56]. CSB fait partie de la famille des facteurs de remodelage de la chromatine SWI/SNF. Ajoutée à l'ARN PolIIo bloquée au niveau des CPD, elle stimule l'élongation en ajoutant un nucleotide au nouveau transcrit, mais elle ne peut pas sauter le dommage [55, 57].

Jusqu'à présent, le mécanisme par lequel la machinerie de TCR à accès au dommage reste non résolu. On ne sait pas encore si la polymerase est ubiquitylée et dégradée, transloquée du site du dommage sans dissociation du brin ou bloquée au site du dommage pendant que la réparation a lieu [31]. Trois réponses sont possibles [58], obtenues soit en reconstituant le TCR in vitro [59-60], soit en analysant les complexes in vivo [61]. Les études récentes suggèrent que le complexe TCR est formé sans qu'il y ait déplacement de l'ARN PolIIo. Pour ce faire, des modifications conformationnelles de l'ARN PolIIo sont nécessaires pour permettre l'accès des facteurs de réparation au dommage, et ces modifications demandent la présence de CSB dans les expériences in vivo. Le recul de l'ARN PolIIo peut être un mécanisme qui permet la réparation et/ou la transcription. Le facteur de transcription TFHS qui a un rôle dans le TCR [62] stimule l'activité de clivage de l'ARN PolIIo en permettant le repositionnement de l'ARNm dans son centre actif et donc le redémarrage de l'élongation. De plus, le complexe ARN PolIIo-CSB recrute in vivo des facteurs de remodelage de la

chromatine tel que le HMGN1 et p300, confirmant que l'ouverture de la chromatine est nécessaire pour un TCR efficace [55].

TFIIS-dependem Lesion bypass backup (trantcnptonnal mutagenesis)

NJ|-n»Upol»o

\ y RNA poi II ubquitnabon ard degradatior mRNA DNA leson CSB attraction or interaction stabilization CSB-dependent remodeiirg of the DNA/RNA pol Ho interface

CSB-dependent meson and repair

À

TFIll+ATPase-dependent i of the RNA pol Mo

' . CSB-dependent reirtrtiabon of the transenoton i? i »

1.3.2.1.2 Le recrutement des facteurs du NER dans le complexe ouvert

Même si XPC est capable de sentir la distorsion de la double hélice d'ADN, il faut confirmer qu'il s'agit bien d'un vrai dommage pour que le NER ait lieu. Pour ce faire, la XPC polyubiquitinylée modification qui augmente son affinité pour l'ADN endommagé [52] -recrute le TFIIH qui va vérifier le brin endommagé via l'hélicase XPD dans la direction 5'-3' [41]. Suite à la reconnaissance du dommage par le GGR, il y a le recrutement des autres facteurs impliqués dans la réparation : RPA, XPA et XPG.

Le TFIIH est un complexe de dix sous-unités et fonctionne dans le NER et dans l'initiation de la transcription. Il est recruté tout de suite après XPC, probablement par interaction protéine-protéine [63-64]. Deux de ces sous-unités, XPB et XPD sont des hélicases avec des polarités opposées : XPB ouvre l'ADN dans la direction 3'-5' et XPD dans la direction 5'-3' [65]. La liaison avec l'ADN fait une ouverture de 10 nucleotides en amont du dommage, ce qui suggère qu'une seule de ces deux hélicases est liée, probablement XPB et probablement sur le brin non-endommagé [41, 66]. L'activité ATP-ase de la XPB est régulée par l'unité p52 du TFIIH et par XPC [63] et elle est nécessaire pour le recrutement du TFIIH au site du dommage [64]. Contrairement à la XPB, l'activité helicase de la XPD est nécessaire pour l'ouverture de la «bulle» au niveau du dommage. Récemment, Sugasawa et al. [41] ont proposé un modèle dans lequel XPD, comme son orthologue bactérienne UvrB, agit comme détecteur du dommage. Dans ce modèle, XPC reconnaît et lie des bases non-appariées situés sur le brin non-endommagé, ce qui permet le recrutement du TFIIH et la translocation de la XPD en direction 5'-3'. Le blocage de XPD permet l'ouverture complète de la «bulle» et le recrutement d'autres facteurs. L'activité helicase de la XPD est régulée positivement par XPA.

XPA est une protéine à doigt de zinc qui a beaucoup d'affinité pour l'ADN endommagé [67]. À cause de cette propriété, on a longtemps pensé que c'était elle qui

reconnaissait le dommage en premier. Maintenant, on sait qu'elle est recrutée après TFIIH [41] via son import nucléaire par l'ATR [68]. XPA forme un homodimère en solution et le dimère forme un hétérodimère avec RPA [69]. Le rôle exact de XPA dans le NER n'est pas connu, mais sa présence est absolument nécessaire. Un rôle possible serait l'identification du brin qui porte la lésion via la stimulation de la dissociation de XPD du complexe TFIIH (une fois libérée du complexe, XPD peut scanner le brin d'ADN); un autre serait l'assemblage et la stabilisation du complexe NER au site de liaison [41]. RPA est un complexe de trois sous-unités (RPA70, 32 et 14) nécessaire pour l'ouverture complète de la «bulle» autour du dommage et la protection du brin non-endommagé [30].

La protéine XPG, membre de la famille des Flap-endonucléases, a une préférence pour les jonctions simple brin-double brin [70]. Elle est nécessaire pour l'étape d'incision et pour la formation du complexe ouvert [71]. À cause du fait que XPG stabilise le TFIIH (son absence mène à la dissociation de la XPD du complexe) [72], on pense qu'elle pourrait être recrutée dans un complexe pré-assemblé avec le TFIIH [43]. Des modèles d'assemblage séquentiel ont aussi été proposés in vitro [73] et in vivo [33].

Pour le TCR, la présence de l'ARN PolIIo bloquée au niveau du dommage est le signal pour le recrutement séquentiel de TFIIH, XPG, RPA et XPA. Dans le modèle in vitro de Laine et Egly (2006) [59], le TFIIH est responsable du relargage dépendant de l'ATP de l'ARN PolIIo pour permettre le recrutement des autres facteurs de réparation. In vivo [61], il n'a pas été déterminé si la polymerase est encore sur le brin endommagé à la fin de la réparation ; il est possible qu'elle soit ubiquitinylée et dégradée comme suggèrent les expériences faites chez les levures [74].

1.3.2.1.3 La double incision de ('oligonucleotide endommagé par les endonucleases

Après l'assemblage du complexe de pré-incision et l'ouverture complète de l'ADN, deux cassures simples brin sont induites au brin endommagé par le complexe ERCC1 -XPF et la XPG, avec le relargage de 1'oligonucleotide endommagé. Le recrutement des deux endonucleases n'a pas lieu simultanément; XPG est recrutée dans le complexe de pré-incision par le TFIIH et elle nécessite XPA et RPA pour son activité nuclease. Le ERCC 1-XPF est le dernier facteur recruté dans le complexe via l'interaction de l'ERCCl avec XPA [75]. Même si les deux endonucleases ont la même spécificité et coupent l'ADN à la jonction double brin-simple brin, elles sont de polarités différentes : ERCC1-XPF coupe l'ADN en 5', incision qui précède celle en 3' faite par XPG [43, 73, 76]. Récemment, Staresincic et al (2009) [76] ont proposé pour l'étape d'incision un modèle de type «cut-patch-cut-patch»: l'incision en 5' faite par XPF dépend seulement de la présence de XPG et elle est nécessaire et suffisante pour l'initiation de la synthèse du nouveau brin; l'incision en 3' par la XPG réclame la présence et l'activité catalytique de XPF et elle est nécessaire pour la suite de la synthèse du nouveau brin.

Pour la formation du complexe d'incision, XPC est dégradée par un mécanisme indépendant de l'ubiquitinylation et cette dégradation est nécessaire pour le recrutement de XPG [77]. Les TFIIH et XPA sont probablement libérés après l'incision étant donné que XPB est nécessaire pour la coupe en 5' [73] et XPA stimule l'activité des deux endonucleases [78].

1.3.2.1.4 La synthèse du nouveau brin

La coupe en 5' par l'ERCCl-XPF génère un groupement 3'OH libre qui joue le rôle d'amorce pour les polymerases. La XPG est probablement responsable du recrutement de PCNA via son «PIP box» [73, 79] et le RPA du RFC [73]. Ces recrutements nécessitent la présence de la XPF active. Le positionnement du complexe PCNA-RFC en 5' libère la XPF, attire les polymerases ô/e qui commencent la synthèse du nouveau brin. Après avoir synthétisé la moitié du brin, les polymerases s'arrêtent et ceci est probablement le signal qui déclenche l'activation de XPG, la coupe en 3' et l'achèvement de la synthèse du nouveau brin [76]. La dernière étape du NER commence avec le départ de RFC et des polymerases ô/e et le recrutement de FEN1 et ADN ligase. PCNA reste attachée à la chromatine et va faire le passage entre la synthèse et la ligation du nouveau fragment [73]. Récemment, il a été démontré que la ligation est réalisée par la ligase III/XRCC1 ; la ligase I jouerait seulement un rôle dans les cellules en prolifération [80].

1.3.2.2 La réparation par excision de bases

Cette voie est responsable de la réparation des dommages oxydés induits par les ROS générées par les UVB et UVA, mais aussi de la réparation des bases alkylées ou désaminées. Il existe deux sous-voies du BER : la sous-voie «short patch» menant à l'excision d'un seul nucleotide, et la sous-voie «long-patch» menant à l'excision de 2 à 15 nucleotides. Le schéma classique du BER est constitué de l'enchaînement des étapes suivantes (figure 7) [28]:

a) La reconnaissance du dommage, l'enlèvement de la base endommagée et l'incision du brin d'ADN ;

c) La ligation

La première étape du BER est la reconnaissance de la base endommagée par les glycosylases d'ADN. Jusqu'à présent, onze glycosylases ont été identifiées et caractérisées chez les mammifères [81]. Il y a deux types de glycosylases d'ADN : les glycosylases de type I clivent la liaison N-glycosidique avec le relargage de la base endommagée et la création d'un site apurinique/apirimidinique (site AP) et les glycosylases de type II qui ont une activité d'AP-lyase ; elles vont cliver l'ADN en 3' du site abasique créant une cassure simple brin [28]. Pour les glycosylases de type I, l'incision du brin d'ADN est faite par une AP endonuclease en 5' du site abasique, avec la création de 5' désoxyribose-5 phosphate (5 MRP) et de 3'OH. L'insertion du premier nucleotide est faite par la polymerase p. Elle ne dépend pas de la structure du site AP. La polymerase P a deux activités : l'activité de polymerase qu'elle utilise pour insérer le premier nucleotide et l'activité 5'-désoxyribose-phosphatase qu'elle utilise pour cliver le 5' phosphate par P-élimination [82] permettant la ligation par la ligase III [83]. Cette voie du BER « short patch » est la voie préférée des cellules de mammifères [28].

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Les sites AP oxydés ou réduits sont résistants à la P-élimination; la polymerase P se dissocie et la réparation est faite par les polymerases ô/e, PCNA, FEN1 et ligase I. Pour la sous-voie «long patch», PCNA recrute et stimule l'activité polymerase de pol ô. La polymerase ô va synthétiser un brin plus long que 10 nucleotides, qui déplacera le brin contenant la base endommagée, terminé avec le 5'-dRP et réfractaire à la ligation. Le problème est résolu par le recrutement de FEN1 qui éliminera le «flap» généré par pol ô. La ligase I va finir la réparation [81]. D'autres protéines peuvent compenser la perte des protéines mentionnées ci-dessus et pour cela, le BER est une voie redondante [84].

1.3.3 La mort cellulaire

Les dommages à l'ADN, qui ne sont par réparés et qui persistent dans le génome, activent une des voies majeures de la mort cellulaire : l'apoptose. Les dommages à l'ADN et les ROS peuvent activer la voie apoptotique intrinsèque mitochondriale, alors que l'action des rayons UVB sur les récepteurs cellulaires ou sur l'expression de leurs ligands peut activer la voie extrinsèque de l'apoptose (figure 4) [1, 85].

Dans les dernières années, il a été montré que si les dommages à l'ADN sont réparés dans un délai de huit heures après l'irradiation aux UV dans les cellules HeLa [86] et XP [87], l'induction de l'apoptose est évitée. Donc, au niveau nucléaire, le premier signal pour l'apoptose est constitué des photoproduits (CPD et 6-4PP) non-réparés. La contribution de chaque type de dommage à l'apoptose est encore controversée; plusieurs groupes ont montré que ce sont les CPD dans les cellules capables de NER (car les 6-4PP sont réparés très rapidement) et les 6-4PP dans les cellules déficientes dans le NER [88].

Il y a plusieurs hypothèses sur les mécanismes qui déclenchent l'apoptose :

a) L'efficacité à reconnaître le dommage. Les cellules déficientes en NER (XP et CS) sont très sensibles aux UV [89], mais pas les XP-E.

b) Le blocage de la transcription. Le blocage de l'ARN PolIIo au niveau du dommage et la réduction subséquente de la transcription ont été montré comme étant des signaux pro-apoptotiques. Les cellules déficientes en TCR, comme les cellules CS, meurent par apoptose après irradiation avec des doses plus faibles d'UVC que les cellules déficientes en GGR comme les XP [90]. De plus, l'élimination des dommages par la photoréparation et le recommencement de la transcription préviennent l'apoptose dans les cellules CHO [91].

c) Le blocage de la replication. L'inhibition de la replication par l'aphidicoline prévient l'apoptose car elle réduit le nombre de cassures double brin formées en phase S du cycle cellulaire après le bris de la fourche de replication [92].

Les dommages à l'ADN induits par les UV activent les ATM/ATR. L'ATR est recruté par son partenaire ATRIP sur les brins simples formés soit après le bris de la fourche de replication, soit comme intermédiaires de la réparation des CPD et 6-4PP par le NER. Une des cibles de l'ATR/ATM, après le dommage à l'ADN par les UV, est la p53 [1]. La p53 peut induire l'apoptose par la transactivation des protéines pro-apoptotiques telles que Bax ou Noxa et par l'inhibition des protéines anti-apoptotiques telles que Bcl-2 [23]. La translocation de ces protéines pro-apoptotiques vers la mitochondrie entraîne une perte de potentiel de la membrane mitochondriale, possiblement en y créant des pores.

Les ROS créés par les UVB et UVA peuvent également affecter l'intégrité de la membrane mitochondriale soit de façon directe, par la peroxydation de lipides, soit de façon indirecte par l'activation de p38 et JNK1 [6]. La perte de potentiel de la membrane mitochondriale entraîne la diffusion de plusieurs facteurs pro-apoptotiques de la mitochondrie vers le cytoplasme, tels que le cytochrome c. Dans le cytoplasme, il s'associe avec la caspase 9 et Apaf-1 et catalyse la formation d'un complexe appelé apoptosome. La formation de l'apoptosome provoque une cascade d'activation des caspases. Les caspases favorisent l'apoptose en clivant différents substrats cellulaires pour les activer ou les inactiver [85].

Au niveau de la membrane cellulaire, les UV sont capables d'activer des récepteurs de la mort cellulaire, tels que TNF-R1 («tumor necrosis factor receptor 1»), Fas et TRAIL 1 et 2 («TNF-related apoptosis inducing ligand»). En liant leurs ligand, ces récepteurs se trimérisent et activent leur domaines de la mort cellulaire. Le recrutement de FADD sur ces domaines, active la caspase 8/FLICE par trans-clivage. La caspase 8 peut induire l'apoptose soit par clivage et activation de la caspase 3 menant à la mort cellulaire par la voie extrinsèque [1], soit par clivage de la protéine pro-apoptotique Bid, permettant sa translocation à la mitochondrie et la diffusion de facteurs pro-apoptotiques dans le cytoplasme [85].

De plus, les UVB sont capables d'induire la trimérisation directe des Fas et des TNF-Rl en absence de leurs ligands (FasL et TNFa) [6]. Ce type d'activation n'est pas relevant in vivo, car des souris déficientes dans le ligand FasL ont un niveau très bas d'apoptose après exposition à une dose chronique d'UV [93].

Dans le cytoplasme, les UV activent la voie de signalisation MAPK (« mitogen-activated protein kinases ») qui est constituée de trois sous-familles : les ERK (« extra-cellular signal regulated kinase »), les JNK (« c-Jun N-terminal kinase ») et les kinases p-38. L'inhibition pharmacologique des JNK et/ou des p38 résulte dans l'atténuation de l'apoptose des cellules irradiées aux UV [94-95]. Les JNK activés phosphorylent les protéines pro-apoptotiques Bax/Bak [96] et libèrent le cytochrome c de la mitochondrie [97]. De plus, les souris « knockout » pour c-JUN sont résistantes à la mort cellulaire induite par les UV [1, 98]. L'activation par les UV de p38 est nécessaire pour l'activation et la translocation de Bax du cytoplasme dans la mitochondrie suivie par libération du cytochrome c [99]. Mais, il y a aussi des évidences quant au rôle protecteur de p38. Il a été montré que p38 protège contre l'apoptose induite par les UV par l'inhibition de l'expression de Fas et NF-KB [26, 100].

1.3.4 La mutagenèse

Le rôle des radiations ultraviolettes dans le développement des cancers de la peau a été établi dans la dernière décade du 19eme siècle par Unna et Dubreuilh, et leur potentiel

carcinogène a été par la suite prouvé dans des modèles animaux [4]. Le développement des cancers de la peau se fait selon un gradient de latitude terrestre et leur prévalence est très élevée chez les patients atteints de Xeroderma pigmentosum, qui sont déficients pour le NER. À part pour les patients atteints de XP, les photoproduits (CPD et 6-4PP) sont réparés efficacement sans erreur. Mais, lorsque la capacité de réparation de la cellule est dépassée, par exemple par exposition répétitive aux UV, les lésions peuvent devenir, dans les deuxièmes tours de divisions, des mutations. En général, les polymerases réplicatives ont une très grande fidélité et donc, elles s'arrêtent au niveau des dommages. Pour que la replication ait lieu et pour éviter que l'apoptose ne se déclenche, les cellules possèdent des mécanismes qui leur permettent de tolérer temporairement les dommages. Un de ces mécanismes est la synthèse translésionnelle (TLS) qui utilise des polymerases spécialisées capables d'incorporer des nucleotides opposés à l'ADN endommagé [101].

Les polymerases TLS n'ont pas d'activité de «proof-reading» et peuvent incorporer un nucleotide incorrect à chaque 10 000 bases, donc elles ont une activité mutagénique, activité qui diffère entre elles et dépend du type de dommage. Par exemple, la polymerase r\ peut passer très efficacement les T-T en incorporant deux adenines sur l'autre brin [101]. Son activité est contrôlée par les interactions protéine-protéine : l'interaction avec PCNA mono-ubiquitinylée permet l'échange avec les polymerases réplicatives, empêche le bris de la fourche de replication [102-103] et est inhibée par p21 [25]. L'interaction avec le Radl8 permet son recrutement aux sites de dommages [104]. Des données récentes ont montré que le TLS peut avoir lieu en dehors de la phase S [105] et que la pol q a un rôle à jouer [106].

l'exposition au soleil [109] et elles comptent pour 65% des mutations induites par les UVA et 85% de celles induites par les UVB [109]. Quand ces types de mutations affectent les gènes qui codent pour des protéines impliquées dans le cycle cellulaire ou dans la réparation, elles peuvent induire le cancer de la peau. Par exemple, p53 mutée est trouvée dans 90% des CSC et 56% des CBC, lui suggérant un rôle dans la prévention contre le cancer de la peau [4]. Dans le cas des patients XP-C, les mutations dans la p53 sont associées à une diminution de l'apoptose et une augmentation de la prolifération des kératinocytes, ce qui a été relié à un risque accru pour développer un cancer de la peau [110]. Les dommages oxydés sont responsables pour 8% des mutations; dans le cas des UVA les bases endommagées par les ROS peuvent aussi conduire aux mutations.

La protection contre le cancer de la peau tient au bon fonctionnement de la réparation de l'ADN et spécialement par le NER et aussi à l'exécution du programme de mort cellulaire par apoptose. Toute réponse cellulaire qui aide soit à la réparation efficace de l'ADN et/ou à l'élimination des cellules endommagées peut jouer un rôle important dans la prévention du cancer de la peau. La poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1), décrite dans la section suivante, représente un candidat idéal pour faciliter plusieurs de ces réponses. Elle est activée rapidement en réponse aux dommages à l'ADN, ce qui induit son auto-modification, ainsi que la poly(ADP-ribosyl)ation d'autres protéines impliquées dans les réponses cellulaires aux dommages à l'ADN (réparation, remodelage de la chromatine et mort cellulaire). Dans ce contexte, le rôle de la PARP-1 dans le NER et l'identification de ces partenaires feront l'objet principal de ce mémoire.

1.4 La poly(ADP-ribosyl)ation

Il y plusieurs types de modifications post-traductionnelles essentielles pour les processus cellulaires, telles que la phosphorylation, l'acétylation, la méthylation et l'ubiquitinylation. Un autre exemple de modification post-traductionnelles de protéines est la poly(ADP-ribosyl)ation, où des polymères d'ADP-ribose (pADPr), formés à partir du donneur NAD+ ,sont attachés via une liaison ester à un acide glutamique ou (moins connu) à

un acide aspartique ou lysine appartenant à la protéine cible [111]. Le NAD+joue un rôle

important dans le métabolisme énergétique via les processus d'oxydoréduction conduisant à la génération de l'ATP et dans la signalisation, via les réactions de transfert d'ADP-ribose (pour revue, voir Hassa et al. [112]). On retrouve quatre types de réactions de transfert d'ADP-ribose: la mono(ADP-ribosyl)ation et la formation de O-acétyle-ADP-ribose chez toutes les classes d'organismes, l'ADP-ribose cyclisation chez les eucaryotes uni- et pluri-cellulaires sauf les bactéries et les archaea et la poly(ADP-ribosyl)ation chez les eucaryotes supérieurs [112].

1.4.1 Le poly(ADP-ribose)

La présence de poly(ADP-ribose) (pADPr) a été suggérée pour la première fois en 1963 par Chambon et al. [113], qui ont rapporté que l'addition de NAD+ stimule

l'incorporation de l'ATP marqué radioactif aux polymères liés aux protéines. L'enzyme responsable de la synthèse de pADPr a été nommé poly(ADP-ribose) polymerase (PARP). La structure des pADPr a été résolue par trois laboratoires de façon indépendante [112].

Les poly(ADP-ribose) sont des homopolymères formés de monomères d'ADP-ribose associés par des liaisons glycosidiques ribose-ribose l'-2'. Les chaînes de pADPr peuvent atteindre 200 à 400 unités in vitro et in vivo, avec des branchements de façon irrégulière tous

certains en ont une secondaire hélicoïdale qui rappelle la structure de l'ADN et de l'ARN d'où le nom de troisième type d'acide nucléique [115]. Contrairement aux acides nucléiques qui sont abondants dans les cellules, le niveau constitutif de pADPr est très faible, mais il peut augmenter de 10 à 500 fois en réponse aux dommages à l'ADN [116].

1.4.1.2 L'anabolisme

La poly(ADP-ribosyl)ation est une réaction séquentielle qui peut se diviser en quatre étapes importantes [112]. La première étape est le clivage de la forme oxydée de NAD, NAD+, en nicotinamide (Nam), ADP-ribose et proton par l'activité des nombreuses NAD+

glycohydrolases, dont PARP. L'énergie libérée par l'hydrolyse du lien Nam-ADPr est utilisée par la PARP pour initier la réaction de poly(ADP-ribosyl)ation, qui consiste dans le transfert d'une unité d'ADPr sur les protéines acceptrices. Le site d'ancrage du premier monomère d'ADPr sur la protéine est généralement un résidu glutamate, mais peut parfois être un résidu aspartate ou lysine. Par la suite, il y a elongation de la chaîne de pADPr par addition de résidus d'ADPr reliés par les liaisons O-glycosidiques. La dernière étape est le branchement, qui suppose l'attachement des résidus d'ADPr à l'extérieur de la portion linéaire du polymère [112,117].

NAD* Nam Ade I I Rib Rb-OH I I P - P Poly(ADP-ribos«) Nam + H* _Ade I

•Rfe Rib4Rb Rib4Rib Rib-L-Rib Rib—Rib Rib-OH

(wtâ ÇRH£

Figure 8. Le métabolisme du poly(ADP-ribose). Tiré de Hakmé et al., 2008 [121]

1.4.1.3 Les protéines acceptrices des pADPr

Il a été démontré in vitro et in vivo qu'il y avait plus de 200 protéines cibles de la poly(ADP-ribosyl)ation, pour la plupart des protéines nucléaires. Il est cependant très important de se rappeler que la cible principale de la poly(ADP-ribosyl)ation est la PARP elle-même. Parmi les autres accepteurs de poly(ADP-ribose), on trouve des protéines impliquées dans des fonctions cellulaires aussi diverses que le cycle cellulaire (p53, PCNA, p21, CHFR), la réparation de l'ADN endommagé (les ADN polymerases a et p, CSB, XPA, DNA ligase, XRCC1, Ku70, APLF) et la modulation de la structure de la chromatine (les histones et les topoisomérases I et II) [118-119].

Jusqu'à présent, il a été identifié les résidus glutamate ou aspartate comme les accepteurs spécifiques de pADPr seulement pour les histones HI, H2B et la ribonucléase

ont été montrés comme étant des accepteurs de pADPr in vivo [119, 121]. Les polymères sont liés sur les protéines acceptrices de façon non-covalente (sur les histones, la p53, la p21, la XRCC1) ou de façon covalente (sur les PARP-1 et -2, les histones, les HMG). Cette différence de liaison peut leur conférer des fonctions différentes comme, par exemple, le recrutement de protéines vers le site où les pADPr sont produits dans un cas et la modification de l'activité de la protéine dans l'autre cas par l'addition d'unités d'ADPr chargées négativement. La dégradation des pADPr pourrait redonner aux protéines leur conformation native. Aussi, les différences dans la longueur et les branchements des pADPr peuvent constituer un autre niveau de modulation des activités enzymatiques de la protéine acceptrice [122].

1.4.1.4 Le catabolisme

Dans leur grande majorité, les polymères formés lors du dommage à l'ADN sont rapidement dégradés : 85% ont une demi-vie de 40 secondes, et les 15% restants, de 6 minutes [114]. Il est possible que la dégradation des pADPr ait commencé immédiatement après le début de la synthèse suggérant que les enzymes impliquées dans son métabolisme sont régulées de façon très serrée.

Jusqu'à présent, deux types d'activité enzymatique sont responsables de la dégradation des polymères d'ADP ribose libres ou liés des protéines acceptrices. L'activité enzymatique majeure est la ribose) glycohydrolyse catalysée par la poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG) et plus récemment par ARH3 [123].

L'hydrolyse des pADPr est faite principalement par PARG, une enzyme avec activité exo-et endo-glycosidase, en clivant les liens ribose-ribose entre les unités d'ADPr [124]. Les polymères courts et branchés sont dégradés plus lentement que les polymères longs et linéaires [125]. Chez les mammifères, un seul gène code pour plusieurs isoformes de PARG : PARG-110/111 est la forme nucléaire de faible abondance, et les PARG-102, PARG-99

(caractérisées chez l'homme) et PARG 59/60 (caractérisée chez la souris) sont les trois isoformes cytoplasmiques très abondantes. Les PARG 102 et 99 diffèrent de PARG 110/111 par l'absence de l'exon 1 (PARG 102) et les exons 1+2 (PARG 99) [126]. Plusieurs études ont démontré que les isoformes cytoplasmiques sont responsables de l'activité de la PARG dans les cellules en présence ou en absence de stress génotoxique, ce qui est surprenant étant donné que la PARP-1 est une protéine nucléaire. Une étude récente a montré qu'en réponse aux dommages à l'ADN, PARG 102 était transloquée dans le noyau et la forme PARG-110 dans le cytoplasme [127]. L'absence de PARG cause la mortalité chez l'embryon murin (E 3.5) probablement dû à l'accumulation de pADPr, car les cellules isolées de la souris PARG'" poussent en culture en présence d'un inhibiteur de la PARP [111, 128]. Donc, in vivo, le métabolisme de pADPr est important pour la maintenance de la physiologie normale de la cellule.

La dégradation du dernier résidu d'ADPr sur la protéine cible est effectuée par la protéine 1'(ADP-ribosyl) lyase, une enzyme spécifique au mono(ADP-ribose) [129].

1.4.2 La poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1)

La PARP-1 est le fondateur et le plus important membre de la famille des poly(ADP-ribose) polymerases. Comme mentionné ci-dessus, PARP-1 catalyse la polymérisation des unités d'ADPr sur les protéines cibles, résultant en polymères linéaires et/ou branchés. Cette activité enzymatique a été identifiée de la plante aux mammifères, mais elle est absente chez les levures [130]. L'activité basale de la PARP-1 est très faible, mais elle augmente en présence de différents types d'activateurs, tels que l'ADN endommagé, les nucléosomes, des structures secondaires non endommagées d'ADN et les protéines qui le lient [116].

le fragment N-terminal de 46 kDa contient le domaine de liaison à l'ADN-DBD («DNA binding domain»), le fragment central de 22 kDa contient le domaine d'auto-modification et le fragment C-terminal de 54 kDa contient le site catalytique (figure 9).

Auto-DNA Binding modification

Domain Domain i 1 i 1 Zn Finger» NLSZBD3 BRCT

Ï

r i r

Catalytic Domain i i NAD* Binding PARP Signature 1014 as (-116 kDa)

Figure 9. La structure de la PARP-1. Tiré de Kraus, 2008 [134]

1.4.2.1 Le domaine de liaison à l'ADN (DBD)

Le DBD contient trois doigts de zinc appelés fl, fil et fill ; leur interaction avec l'ADN est dépendante du zinc [135-136]. À l'opposé des autres protéines possédant des doigts de zinc, l'interaction de la PARP-1 avec l'ADN n'est pas dépendante d'une séquence spécifique de nucleotides, mais plutôt de la présence d'interruptions dans le brin d'ADN ; fl est essentiel pour la reconnaissance de cassures double brin alors que le fil reconnaît plus spécifiquement les cassures simples brin. Contrairement aux deux autres doigts de zinc, le troisième n'est pas essentiel pour la liaison à l'ADN; il est impliqué dans les interactions protéine-protéine et aussi dans la stimulation de l'activité de la PARP-1 suite à la liaison à l'ADN [136]. En plus de leur affinité pour l'ADN, les doigts de zinc de PARP-1 lui permettent d'interagir avec d'autres protéines dont les histones, l'ADN polymerase a et le XRCC1 [137-138].

Par la suite, il a été montré que la partie N-terminale de la PARP-1 liait les cassures simple-brin et interagissait avec un tour et demi d'ADN protégeant sept nucleotides de part et

d'autre de la cassure. Cette observation [139] et les expériences cinétiques in vitro [140] suggèrent que PARP-1 lie l'ADN comme dimère. En plus de reconnaître les cassures d'ADN, le DBD possède une affinité pour les motifs hélice-tour-hélice de l'ADN, tels que l'ADN surenroulé, l'ADN courbé, l'ADN cruciforme [141] ainsi que les CPD [142], et il est nécessaire pour la liaison de nucléosomes lors de la compaction de la chromatine [143]. Le DBD possède également une séquence de localisation nucléaire bipartite, dont chacun des deux motifs riches en résidus basiques est nécessaire pour la translocation de la PARP-1 vers le noyau [144].

1.4.2.2 Le domaine d'auto-modification

Le domaine d'auto-modification de la PARP-1 contient une séquence de quinze résidus glutamate, montrés comme étant les sites accepteurs de pADPr [145-146]. Plus tard, treize autres sites accepteurs de pADPr ont été identifiés dans les trois domaines fonctionnels de la PARP-1 en utilisant soit des concentrations très élevées de NAD+ [147], soit le mutant

E988Q [120]. L'auto-modification de la PARP-1 a comme résultat son détachement de l'ADN, probablement par répulsion électrostatique, ce qui engendre l'inactivation de l'enzyme.

Le domaine d'auto-modification possède également un motif BRCT («breast cancer susceptibility protein, BRCA-1, C-terminal»), qui module l'interaction de la PARP-1 avec ses partenaires. Le BRCT est une séquence d'acides aminés retrouvés dans plusieurs protéines impliquées dans les réponses à l'ADN endommagé, dans la réparation de l'ADN et dans les voies du cycle cellulaire e.g XRCC1, l'ADN polymerase p, l'ADN ligase III [112]. PARP-1 possède aussi un motif «leucine zipper» qui pourrait aussi être impliqué dans les interactions protéine-protéine.