TD 7

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TD n°7

Application d’enzymes de restriction Exercice n°1 :

Une même quantité d’ADN viral double brin linéaire est complètement digérée par différentes enzymes de restriction utilisées seules (digestion simple) ou conjointement (digestion double). Après séparation par électrophorèse en gel d’agarose, la taille des fragments générés est estimée (tableau).

Enzymes utilisées Taille des fragments (en kpb)

Bam HI 2 et 16

Hind III 6 et 12

Sa lI 2 et 16

Bam HI + Hind III 2, 6 et 10

Hind III + Sa lI 2, 4 et 12 a) Rôle du Bromure d’éthidium

b) Représenter les fragments engendrés par chacune des coupures ou des doubles coupures.

Exercice n°2

Soit un ADN bicaténaire, la séquence du monobrin est la suivante :

5’CAATTGAATTCATCG ……….T120_{AGTAGGCCGTACA………}

…T340_{GCGTGGAATTCGTA………}

A608_{TGTGAATTCTGA……….A}890_{ATTTCCCTACATGGGCT………}

….A1100_{CGGCTAGTAGCGCTG………..A}1200_{TGGGCCATCGC…………}

………….G1400_{CTGGGCTGGAATTCGGTCTA 3’}

On réalise une digestion enzymatique en utilisant deux enzymes de restriction Eco RI (GAATTC) et Hae III (GGCC)

1. On digère cet ADN avec l’enzyme Eco RI, quel est le nombre et la taille théorique et réelle de chaque fragment obtenu ?

2. On digère cet ADN avec l’enzyme Hae III, quel est le nombre et la taille de chaque fragment obtenu.

3. On réalise une double digestion en utilisant les deux enzymes, quel est le nombre et la taille de chaque fragment obtenu ?

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Corrigé type Exercice 1 :

1. Le bromure d’ethidium est agent mutagène qui s’intercale entre les bases d’ADN et qui sous excitation par UV émet une fluorescence orange qui permet la visualisation de l’ADN et l’ARN après Electrophorèse sur gel d’agarose.

2. Bam H1 2 16kb ………18kb………... Hind III …………..12kb……… …..6kb……. ………18kb……… Sa II ………16kb………...2kb.. ……….18kb……… Hind III BamH I ……6kb……….10kb………2kb. ………..18kb……… ……….16kb……….2kb.. …….6kb………12kb………… Sa II Hind III …2kb…4kb………12kb……… …….6kb………12kb………. …2kb……….16kb……… ……….18kb………...

Pour réaliser les cartes de double digestion, on compare toujours avec les cartes de simple digestion. Pour savoir quel sont les fragments recoupés et les quels ne sont pas recoupés pour faciliter la réalisation de la carte globale.

B+H : 2+6+10/ donc 6 est non recoupé H+Sa : 2+4+12/ donc 12 est non recoupé Exercice 2 :

Apres digestion par Eco RI, on obtient les 4 fragments suivants:

5’CAATTG AATTCATCG ……….T120_{AGTAGGCCGTACA………}

…T340_{GCGTGG AATTCGTA………A}608_TGTG

AATTCTGA………

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………..A1200_{TGGGCCATCGC……….G}1400_CTGGGCTGG

AATTCGGT CTA 3’

6 pb, 340 pb (346-6), 266 pb(612-346), 797 pb(1409-612) et 11 pb 6+340+266+797+11=1420 pb

Apres digestion par Hae III, on obtient les 3 fragments suivants:

5’CAATTGAATTCATCG ……….T120_{AGTAGG CCGTACA………}

…T340_{GCGTGGAATTCGTA………A}608_{TGTGAATTCTGA………}

…….A890_{ATTTCCCTACATGGGCT……….A}1100_{CGGCTAGTAGCGCTG…}

………..A1200_TGGG

CCATCGC……….G1400_{CTGGGCTGGAATTCGGT}

CTA 3’

126 pb, 1078 pb (1204-126), 342 pb (1420-1204) 126+1078+216=1420 pb

La double digestion, en utilisant les deux enzymes, donne les résultats suivants :

5’CAATTG AATTCATCG ……….T120_{AGTAGG CCGTACA………}

…T340_{GCGTGG AATTCGTA………A}608_TGTG

AATTCTGA………

…….A890_{ATTTCCCTACATGGGCT……….A}1100_{CGGCTAGTAGCGCTG…}

………..A1200_{TGGG CCATCGC……….G}1400_CTGGGCTGG

AATTCGGT CTA 3’

On obtient les fragments : 6 pb, 120 pb(126-6), 220 pb (346-126), 266 pb (612-346), 592 pb (1204-612), et 205 pb (1409-1204) et 11 pb

On confirme les résultats par l’addition des différents fragments obtenus : 6+120+220+266+592+205+11=1420 pb