Étude par traçage neuronal unitaire de la voie
corticosubthalamique hyperdirecte chez le singe
Mémoire
Dymka Coudé
Maîtrise en neurobiologie - avec mémoire
Maître ès sciences (M. Sc.)
Étude par traçage neuronal unitaire de la voie
corticosubthalamique hyperdirecte chez le singe
Mémoire
Dymka Coudé
Sous la direction de :
Résumé
Ce mémoire traite de l’organisation anatomique et fonctionnelle de la voie corticosubthalamique chez le singe macaque. Cette projection neuronale, aussi connue sous le nom de voie hyperdirecte, a été étudiée grâce à une méthode de marquage neuronal unitaire. L’injection d’un traceur antérograde, la biotine dextran amine, dans la couche V du cortex moteur primaire de quatre singes cynomolgus (Macaca fascicularis) par microiontophorèse nous a permis de tracer en détails l’arborisation axonale de 28 axones corticofuges composants la voie hyperdirecte. Les principaux résultats de cette étude montrent que la projection corticosubthalamique est essentiellement ipsilatérale et que la population de neurones à l’origine de cette projection est indépendante de celle composant la voie corticostriée. Après avoir quitté le cortex, les axones de fort calibre (jusqu’à 3.7 µm de diamètre) de la voie hyperdirecte voyagent le long de la capsule interne jusqu’au tronc cérébral. À la hauteur du noyau subthalamique, ces axones émettent des collatérales de plus petit diamètre qui innervent non seulement le noyau subthalamique, mais également la zona incerta, le noyau rouge, les noyaux pontiques supérieurs et le noyau réticulaire du thalamus. Dans le noyau subthalamique, les fines collatérales de la voie hyperdirecte s’arborisent profusément au sein du territoire sensorimoteur. Les résultats obtenus dans le cadre de la présente étude par marquage neuronal unitaire révèlent, pour la toute première fois chez le singe, que la voie « hyperdirecte » est majoritairement « indirecte » puisque celle-ci provient essentiellement de collatérales d’axones principaux qui innervent les étages inférieurs du tronc cérébral. En outre, cette projection ne semble pas exclusive au noyau subthalamique puisque les axones qui la composent ciblent plusieurs autres régions motrices cérébrales.
Abstract
This thesis deals with the anatomical and functional organization of the corticosubthalamic pathway in macaque monkey. This neuronal projection, which is also known as the hyperdirect pathway, was investigated with the help of a single-cell labeling method. An anterograde tracer, biotin dextran amine, was microiontophoretically delivered in layer V of the primary motor cortex in four cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis), allowing us to trace in detail the axonal arborization of 28 corticofugal axons forming the hyperdirect pathway. The main results of this study indicate that the corticosubthalamic pathway is essentially ipsilateral and that the population of neurons at the origin of this projection is distinct from those giving rise to the corticostriatal projection. After leaving the cortex, the large caliber axons (up to 3.7 μm in diameter) that form the hyperdirect pathway travel along the internal capsule, heading toward the brainstem. At the subthalamic nucleus level, these axons emit some small-diameter collaterals that innervate the zona incerta, the red nucleus, the superior pontine nuclei, the thalamic reticular nucleus, and the subthalamic nucleus. In the latter structure, thin collaterals of the corticosubthalamic projection arborize principally within its sensorimotor territory. The results of the present single-axons tracing study reveal, for the very first time in primates, that the so called “hyperdirect” pathway is largely “indirect” since it is mainly composed of collaterals of main axons that travel downward to the brainstem. Moreover, this projection does not seem exclusive to the subthalamic nucleus since it targets several other cerebral motor nuclei.
Table des matières
RÉSUMÉ ... III ABSTRACT ... IV TABLE DES MATIERES ... V LISTE DES FIGURES ... VIII LISTE DES TABLEAUX ... IX LISTE DES ABRÉVIATIONS ... X DEDICACE ET EPIGRAPHE ... XII REMERCIEMENTS ... XIII AVANT-PROPOS ... XV
1. INTRODUCTION GÉNÉRALE ... 1
1.1LES GANGLIONS DE LA BASE : STRUCTURES ET FONCTIONS ... 1
1.1.1 Vue d'ensemble ... 1
1.1.2 Le noyau subthalamique ... 2
Morphologie, neurochimie et propriétés électriques des neurones du noyau subthalamique ... 2
Les projections afférentes au noyau subthalamique ... 3
Les projections efférentes du noyau subthalamique ... 5
1.2LE MODÈLE CLASSIQUE ANATOMO-FONCTIONNEL DES GANGLIONS DE LA BASE ... 6
1.2.1 La voie directe et indirecte ... 6
1.2.2 La voie hyperdirecte ... 9
Le noyau subthalamique comme seconde porte d'entrée des ganglions de la base ... 9
Le noyau subthalamique en conditions pathologiques ... 10
L'implication du noyau subthalamique dans la maladie de Parkinson ... 10
Une cible de choix pour la stimulation cérébrale profonde ... 11
1.3OBJECTIFS DU PROJET ... 13
1.3.1 État de la question et objectifs poursuivis ... 13
1.3.2 La technique utilisée ... 15
1.3.3 Présentation du mémoire ... 18
2. ARTICLE ... 20
SINGLE-AXON TRACING OF THE CORTICOSUBTHALAMIC HYPERDIRECT PATHWAY IN PRIMATES ... 20
ABSTRACT ... 21
INTRODUCTION ... 22
MATERIALSANDMETHODS ... 23
Injection procedures... 23
Tracer visualization and cytochrome oxidase staining ... 24
Material analysis and neuronal reconstructions ... 25
Preparation of samples for electron microscopy ... 26
RESULTS ... 27
General labeling features ... 27
Initial axonal trajectory ... 28
Subthalamic nucleus ... 29
Zona incerta ... 30
Red nucleus... 31
Reticular thalamic nucleus and superior pontine nucleus ... 32
Ultrastructural features of VGluT1+ axon varicosities in the primate subthalamic nucleus... 33
DISCUSSION ... 34
M1 axons arborize exclusively in the sensorimotor territory of the primate STN ... 34
The hyperdirect pathway in primates is mainly ipsilateral ... 36
The hyperdirect pathway in primates is not solely devoted to the STN ... 36
The corticosubthalamic and corticostriatal projections are two distinct entities in primates ... 37
The hyperdirect pathway in primates modulates STN neurons through presynaptic and postsynaptic contacts ... 38
Functional implications for Parkinson's disease and deep brain stimulation ... 39
FIGURE 1 ... 41 FIGURE 2 ... 42 FIGURE 3 ... 43 FIGURE 4 ... 44 FIGURE 5 ... 45 FIGURE 6 ... 46 TABLEAU 1 ... 47 TABLEAU 2 ... 48 3. CONCLUSION GÉNÉRALE ... 49 BIBLIOGRAPHIE ... 52
Liste des figures
Figure 1 Photomicrographies d’un site d’injection dans le M1 et de neurones isolés,
accompagnées d’une reconstruction tridimensionnelle d’un neurone de la couche V du M1. L’activité électrophysiologique caractéristique des neurones qui composent la couche V du M1 est également représentée. (p. 41)
Figure 2 Reconstruction tridimensionnelle de l’arborisation axonale de deux types de
neurones différents. Le premier innerve le STN et le tronc cérébral alors que le deuxième projette au tronc cérébral, à la ZI et au STN. La photomicrographie montre des varicosités corticales fréquemment observées au STN. (p. 42)
Figure 3 Reconstruction tridimensionnelle de l’arborisation axonale de deux types de
neurones différents. Le premier innerve le STN, les étages inférieurs du tronc cérébral, la ZI et continue probablement vers le RN. Le deuxième ne projette qu’au STN et à la ZI. La photomicrographie montre des varicosités corticales fréquemment observées dans la ZI. (p. 43)
Figure 4 Reconstruction tridimensionnelle de l’arborisation axonale de deux types de
neurones différents. Le premier innerve le STN, la ZI, le RN, le rt et les étages inférieurs du tronc cérébral. Le deuxième projette aux étages inférieurs du tronc cérébral, à la ZI, au RN et au STN. La photomicrographie montre le type d’embranchement fréquemment observé d’un axone principal qui envoie une collatérale au niveau de la pointe dorsolatérale du STN. (p. 44)
Figure 5 Reconstruction tridimensionnelle de l’arborisation axonale de deux types de
neurones différents. Le premier innerve le STN, la ZI, le RN, le rt et les étages inférieurs du tronc cérébral alors que le deuxième innerve la ZI, le STN et un noyau pontique supérieur. De plus, ce dernier projette aux étages inférieurs du tronc cérébral en passant par la SNr. La première photomicrographie montre une innervation corticale périsomatique fréquemment observées au RN. La deuxième photomicrographie montre des varicosités corticales fréquemment observées au STN. (p. 45)
Figure 6 Caractéristiques ultrastructurelles des varicosités axonales VGluT1-positives observées dans le territoire sensorimoteur du STN d’un singe macaque. (p. 46)
Liste des tableaux
Tableau 1 Types neuronaux composant le M1 chez le macaque ainsi que l’importance relative de leurs projections axonales. (p. 47)
Tableau 2 Caractéristiques morphologiques des varicosités axonales VGluT1 provenant d’axones corticales retrouvées au sein du territoire sensorimoteur du STN du singe macaque. (p. 48)
Liste des abréviations
ABC Complexe avidine-biotine
AS Aire associative
av Varicosité axonale
BDA Biotine dextran amine
bs Tronc cérébral
Cd Noyau caudé
d Dendrite
DAB Diaminobenzidine
DBS Stimulation cérébrale profonde
DRN Noyau dorsal du raphé
GABA gamma-Aminobutyric acid
GB Ganglions de la base
Glu Glutamate
GP Globus pallidus
GPe Segment externe du globus pallidus (pallidum externe)
GPi Segment interne du globus pallidus (pallidum interne)
H1 Champ de Forel H1 (thalamic fasciculus)
H2 Champ de Forel H2 (lenticular fasciculus)
ic Capsule interne
LI Aire limbique
M1 Cortex moteur primaire
MP Maladie de Parkinson
PB Tampon phosphate
PBS Tampon phosphate salin
PFA Paraformaldehyde
PPN Noyau pédonculopontin
Put Putamen
RN Noyau rouge
SM Aire sensorimotrice
SN Substance noire (substantia nigra)
SNc Substance noire pars compacta (Substantia nigra pars compacta)
SNr Substance noire pars reticulata (Substantia nigra pars reticulata)
SPN Noyau pontin supérieur
STN Noyau subthalamique
Th Thalamus
VGluT1 Transporteur vésiculaire du glutamate 1 VGluT2 Transporteur vésiculaire du glutamate 2
Dédicace et épigraphe
À l’absurdité de l’existence
Remerciements
Je tiens à remercier en premier lieu ma conjointe, Annie Faucher, pour m’avoir soutenu tout au long du cheminement de ma Maîtrise. Malgré les moments de bonheur et de tristesse qui ont façonné cette épopée, tu as toujours été présente pour moi. Merci pour ton existence dans ma vie, ton soutien, ta compréhension et ton amour. Sans toi, le parcours aurait sans doute été bien différent.
Je voudrais aussi profiter de ces quelques lignes pour remercier mes amies et amis. Grâce à vous, ces 2 dernières années dans la ville de Québec ont été rempli de folie et de souvenirs marquants que je ne suis pas près d’oublier.
Merci à mes parents, qui, malgré une incompréhension complète et totale de ce que j’ai pu faire durant les 2 dernières années, m’ont toujours appuyé sans jamais remettre mes choix en question. J’apprécie énormément votre amour et votre support ainsi que votre présence dans ma vie.
Ensuite, je tiens à remercier toutes les magnifiques personnes que j’ai eu la chance de côtoyer quotidiennement au centre de recherche tout au long de ma Maîtrise. Que ce soient les anciens étudiants, les nouveaux arrivés, le personnel de soutien ou les chercheurs, vos encouragements et votre guidance durant ces 2 années m’ont été d’une aide incroyable. Et que dire de nos conversations dépourvus de sens, absurdes, loufoques ou simplement trop profondes par moments. Sans vous, les journées moroses et les moments creux m’auraient sans doute volé une partie de ma santé mentale. Je tiens à remercier particulièrement Dave Gagnon et Marie-Josée Wallman pour avoir fait de moi un apprenti Jedi dans un monde où tout est toujours à apprendre.
Finalement, merci à mon superviseur, Martin Parent, de m’avoir accueilli dans ton laboratoire et de m’avoir poussé afin d’obtenir mes bourses de formation à la Maîtrise. Merci pour ta patience et tes judicieux conseils qui m’ont permis d’élever mes capacités de raisonnement
et d’écriture en Science. Je tiens aussi à remercier le Dr André Parent pour les conversations sur l’histoire des neurosciences qui ont approfondi mes connaissances dans le domaine. Votre rôle de mentor lors de la réception des cerveaux humains était d’ailleurs très apprécié.
Avant-propos
L’article inséré dans ce mémoire est sous sa forme finale ; il a été revu et corrigé par le Dr Martin Parent. De plus, celui-ci est accepté et publié, depuis août 2018, dans la revue Brain Structure and Function. Mon rôle dans la préparation de cet article a été substantiel, ce qui fait de moi le premier auteur. J’ai été celui qui a effectué les manipulations techniques, l’analyse du matériel, la rédaction de l’article et la création des illustrations. Bien entendu, il m’est indispensable de remercier mon directeur de recherche pour sa contribution à la correction de l’article. Sans lui, l’article ne serait pas ce qu’il est aujourd’hui. Je tiens également à remercier Dr André Parent, coauteur, pour les corrections et suggestions qu’il a su apporter à la version finale de l’article.
1. Introduction générale
1.1 Les ganglions de la base : structures et fonctions
1.1.1 Vue d'ensemble
Les noyaux gris centraux, mieux connus sous le nom de ganglions de la base (GB), constituent un ensemble de structures sous-corticales indispensables au comportement psychomoteur. À ce jour, chez le primate, les ganglions de la base sont considérés comme étant constitués (1) du striatum, qui comprend le putamen, le noyau caudé et le noyau accumbens, (2) du globus pallidus divisé en segment interne (GPi) et externe (GPe), de la (3) substance noire divisée en pars reticulata (SNr) et en pars compacta (SNc), et du (4) noyau subthalamique (STN) (Mink & Thach, 1993; Parent & Hazrati, 1995a; Parent & Parent, 2016; Steiner & Tseng, 2016). De ces noyaux, le striatum est considéré comme la porte d’entrée principale alors que le STN est vu comme une porte d’entrée secondaire des GB. Le GPi et la SNr sont considérés comme des portes de sortie des GB puisque ces structures projettent directement au thalamus. Les noyaux moteur de cette dernière structure viennent ensuite innerver le cortex cérébral et engager l’initiation du mouvement (Steiner & Tseng, 2016; Tewari et al., 2016). De cet ensemble de structures nait la boucle cortico-GB-thalamo-corticale. Cette boucle est d’une importance particulière pour le contrôle moteur. D’ailleurs, l’une des principales pathologies neurodégénératives qui affectent les GB est la maladie de Parkinson (MP) (Mink, 1996; Levy et al., 1997). Il est à noter que certains noyaux neuromodulateurs situés en marge des GB viennent significativement influencer le flot d’information neuronale qui circule tout au long de l’axe principal de cette boucle. Parmi ceux-ci, (1) le noyau dorsal du raphé (DRN), (2) les noyaux intralaminaires du thalamus et (3) le noyau pédonculopontin sont considérés comme ayant le plus d’impact sur le fonctionnement des GB (Steiner & Tseng, 2016). Le texte qui suit portera une attention particulière au STN puisque cette structure est centrale à la problématique ayant guidée la présente étude.
1.1.2 Le noyau subthalamique
Morphologie, neurochimie et propriétés électriques des neurones du noyau subthalamique
Le STN joue un rôle crucial dans l’organisation anatomo-fonctionnelle des GB puisqu’il est le seul noyau excitateur faisant partie de cet ensemble de structures sous-corticales (Parent & Hazrati, 1995b). Ses neurones de projection utilisent majoritairement le glutamate comme neurotransmetteur excitateur, mais le noyau renferme aussi un faible nombre d’interneurones qui exercent leur rôle modulateur via l’acide γ-aminobutyrique (GABA), un neurotransmetteur inhibiteur (Lévesque & Parent, 2005a). Étant donné la présence du transporteur vésiculaire du glutamate 2 (VGluT2) au sein des neurones glutamatergiques du STN, il est facile de les identifier en utilisant des techniques d’immunomarquages simples (Schweizer et al., 2014). Le STN est un noyau dit « fermé » puisqu’il est entouré de différents faisceaux de fibres : la capsule interne (ic) le borde latéralement, les champs de Forel en ferme l’accès médialement alors que le faisceau lenticulaire le couvre dorsalement (Hamani et al., 2004). La taille du STN varie significativement d’une espèce à l’autre, mais sa composition neuronale est très peu affectés par les variations interspécifiques (Parent & Hazrati, 1995b). Les corps cellulaires des neurones du STN sont principalement de type ovoïde et émettent de 5 à 8 dendrites généralement lisses et quasi dépourvues d’épines (Sato et al., 2000). Ces dendrites semblent confinées à l’intérieur du noyau et couvrent la totalité de celui-ci chez le rat, mais seulement le neuvième de son volume chez le primate (Parent & Hazrati, 1995b). En conditions normales, les neurones du STN ont une activité électrophysiologique autonome, c’est-à-dire qu’ils sont en mesure de s’activer indépendamment de signaux excitateurs extrinsèques (Steiner & Tseng, 2016). Cette activité autonome serait due à la présence de canaux sodiques transitoires axosomatiques qui se referment très lentement et qui sont en mesure de dépolariser les neurones de manière cyclique (Atherton et al., 2008). Les projections afférentes et efférentes du STN seront abordées lors des prochaines sections de ce texte.
Les projections afférentes au noyau subthalamique
Les projections afférentes au noyau subthalamique (STN) proviennent de sources multiples. Il existe néanmoins deux projections afférentes majeures, soit celles provenant du GPe et celles émergeant du cortex cérébral (Parent & Hazrati, 1995b). À l’aide de synapses axosomatiques ou axodendritiques ciblant les récepteurs GABAA exprimés par les neurones
du STN, l’innervation GABAergique du GPe aurait un effet fortement inhibiteur sur l’activité du noyau (Baufreton et al., 2001). Cette projection couvre d’ailleurs la majorité du volume occupé par le STN et respecte une organisation topographique bien précise. En effet, chez le primate, les neurones retrouvés au centre du GPe projettent au tiers latéral du STN alors que ceux antérieurs innervent les neurones présents dans les deux tiers antérieurs du noyau. Cette organisation laisse croire à la possibilité de populations neuronales distinctes, ayant des fonctions différentes, au sein même du STN (Carpenter et al., 1981). Comme le GPe, le cortex cérébral innerve le STN en respectant une organisation somatotopique très spécifique (Nambu et al., 1996; Haynes & Haber, 2013). Par exemple, le cortex cingulaire antérieur, impliqué dans le phénomène d’empathie, innerve la pointe médiale du STN. Le cortex préfrontal dorsolatéral, quant à lui impliqué dans les fonctions cognitives complexes et associatives, projette majoritairement sur le STN ventral. Pour sa part, le cortex moteur primaire, qui joue un rôle dans la planification et l’exécution des mouvements, innerve massivement la pointe dorsolatérale du STN. Cette topographie, imposée par les projections axonales en provenance des régions limbiques, associatives et motrices du cortex cérébral, donne finalement naissance à trois territoires fonctionnels distincts au sein du STN : la pointe ventromédiale du noyau est considérée comme le territoire limbique, la partie dorsolatérale comme le territoire sensorimoteur et la partie ventrale du noyau comme le territoire associatif (Alkemade, 2013; Alkemade et al., 2015). Les afférences corticales proviennent de neurones de la couche V du cortex cérébral et interagissent principalement avec les dendrites des neurones du STN, où elles forment des synapses de type asymétrique (Romansky et al., 1979; Villalba & Smith, 2011). L’effet excitateur du cortex cérébral s’exercent par l’intermédiaire de récepteurs glutamatergiques de type métabotropique ainsi que de récepteurs ionotropiques AMPA et NMDA exprimés par les neurones du STN (Awad et al., 2000; Chu et al., 2015).
Le STN reçoit aussi des projections moins denses en provenance de diverses régions cérébrales autre que le GPe et le cortex cérébral. Parmi celles-ci, notons une projection glutamatergique provenant du complexe centremédian-parafasciculaire du thalamus qui cible préférentiellement les dendrites des neurones du STN (Sadikot et al., 1992). Cette projection thalamo-STN conserve, elle aussi, une certaine topographie qui respecte les territoires fonctionnels de cette structure. Le noyau centremédian du thalamus, considéré comme ayant un rôle dans les fonctions motrices, innerve le territoire sensorimoteur du STN alors que le noyau parafasciculaire, ayant des fonctions limbiques et associatives, projette à l’aire associative du STN (Parent & Hazrati, 1995b). En plus de la projection d’origine thalamique, le noyau pédonculopontin (PPN) du tronc cérébral impliqué dans la locomotion procure, lui aussi, un apport considérable en glutamate au STN. L’effet de cette afférence du tronc cérébral serait de stimuler le STN. Cependant, le PPN renferme aussi des neurones qui relâchent de l’acétylcholine au sein du STN. L’acétylcholine favoriserait l’activation du STN en exerçant un effet inhibiteur pré-synaptique sur les afférences GABAergiques en provenance du GPe, le tout médié par l’activation de récepteurs muscariniques métabotropiques (m1 et m3) situés sur l’axone des afférences en provenance du GPe, mais
également directement sur les neurones du STN (Flores et al., 1996; Xiang et al., 2012). Le STN est également soumis à une neuromodulation complexe exercée par deux autres neurotransmetteurs: la dopamine et la sérotonine (Mori et al., 1985; Lavoie et al., 1989; Hassani et al., 1997; Wallman et al., 2011). Effectivement, les neurones provenant de la SNc et du DRN seraient en mesure de stimuler l’activité des neurones du STN en utilisant respectivement la dopamine et la sérotonine comme neurotransmetteurs (Stanford et al., 2005; Loucif et al., 2008). Les actions de ces neurotransmetteurs sont complexes. En agissant sur de multiples récepteurs sérotoninergiques (5-HT1A, 5-HT2C, 5-HT4 et 5-HT1B) et
dopaminergiques (D1 et D2) situés sur le domaine somatodentritique des neurones du STN,
mais également sur les différentes projections afférentes, le DRN et la SNc viennent moduler l’effet des afférences innervant le STN tout en agissant directement sur les neurones glutamatergiques intrinsèques au noyau (Hassani et al., 1997; Cragg et al., 2004; Shen & Johnson, 2008; Wallman et al., 2011; Miguelez et al., 2014).
Les projections efférentes du noyau subthalamique
Les neurones du STN établissent une panoplie de connections efférentes vers d’autres composantes des GB. Ces projections ont été grandement étudiées à l’aide de traceurs antérogrades, soit différents composés chimiques qui sont incorporés au niveau du corps cellulaire et qui voyagent le long des dendrites et de l’axone des neurones qui le captent (Kita & Kitai, 1987; Sato et al., 2000). Les résultats les plus pertinents concernant les efférences du STN proviennent du laboratoire Parent où une étude de traçage unitaire a été fait chez le singe macaque (Sato et al., 2000). De cette étude, cinq types de neurones composant le STN ont été observés : (1) les neurones projetant au GPe, au GPi et à la SNr, (2) ceux qui projettent au GPi et à la SNr, (3) les neurones qui innervent le GPe et le GPi, (4) les neurones projetant seulement au GPe et (5) ceux qui innervent le striatum. Malgré la diversité de populations neuronales retrouvée, la projection la plus dense était celle innervant le GPe. Il est présentement accepté que cette connexion se fasse sur des neurones innervant à leur tour le STN afin d’assurer un rétrocontrôle direct sur l’activité du noyau. En plus des projections vers des structures sous-corticales, il existe des évidences à l’effet que le STN projette aussi au cortex cérébral (Degos et al., 2008). De manière intéressante, les neurones du STN innerveraient préférablement les couches II, III et IV des régions limbiques, associatives et motrices du cortex cérébral. De plus, le STN semble innerver le noyau pédonculopontin. Malheureusement, les populations de neurones visées dans cette structure ne sont toujours pas connues, mais une innervation globale des neurones GABAergiques, glutamatergiques et cholinergiques est fort probable (Steiner & Tseng, 2016). Finalement, certains neurones du STN innervent aussi la SNc (Watabe-Uchida et al., 2012). En exerçant une action excitatrice sur la SNc, le STN renforce sa position d’importance au sein des ganglions de la base. En effet, en plus d’être le seul noyau glutamatergique de cet ensemble de structure sous corticales, le STN serait en mesure d’influencer l’activité de la SNc, l’une des structures modulatrices les plus importantes des GB.
1.2 Le modèle classique anatomo-fonctionnel des ganglions de la
base
1.2.1 La voie directe et indirecte
Bon nombre d’études effectuées à l’aide de modèles animaux, ainsi que chez différents patients atteints de la maladie de Parkinson, ont permis de développer un modèle anatomo-fonctionnel des ganglions de la base (GB). Vers les années 80, le concept de voie directe et indirecte voyait le jour dans le but d’expliquer le fonctionnement normal et pathologique des GB (Penney & Young, 1983; Albin et al., 1989; Mink & Thach, 1993; Parent & Hazrati, 1995a).
Tel que décrit plus haut, la boucle cortico-GB-thalamo-corticale assure une connexion réciproque entre les GB et le cortex cérébral. Le modèle considère le striatum comme la porte d’entrée principale des GB. En effet, les afférences glutamatergiques excitatrices du cortex cérébral seraient en mesure de contrôler de façon importante l’activité des neurones du putamen et/ou du noyau caudé. D’ailleurs, le cortex sensorimoteur innerverait principalement le putamen, le cortex associatif le noyau caudé et le cortex limbique innerverait préférentiellement le striatum ventral, dont la partie principale est le noyau accumbens. Il existe donc, au sein du striatum, une ségrégation des territoires fonctionnels semblable à celle retrouvée au STN. Suite à l’innervation corticale du striatum, l’information est transmise jusqu’aux portes de sortie des GB : le GPi et la substance noire pars reticulata (SNr). Ces noyaux GABAergiques inhibiteurs innervent alors certains neurones glutamatergiques contenus au sein du tiers ventral du thalamus afin qu’ils puissent, ou non, transmettre le message filtré au cortex cérébral qui est responsable d’envoyer une commande motrice descendante vers les motoneurones de la moelle épinière.
Selon le modèle classique de l’organisation anatomique et fonctionnelle des GB, l’information voyage au travers des GB d’une manière parallèle et ségréguée au sein de la voie directe et indirecte. La voie directe doit son nom au fait que les neurones qui la
constituent projettent directement aux portes de sortie des GB alors que les neurones de la voie indirecte projettent indirectement, via un relais dans d’autres noyaux, à celles-ci. Cependant, certaines études récentes suggèrent qu’il existe de nombreuses interactions entre ces deux voies, ce qui vient complexifier significativement le modèle classique (Parent et al., 2000; Parent & Parent, 2016). Les quelques lignes qui suivent résument les principales caractéristiques du modèle classique de l’organisation anatomique et fonctionnelle des GB de manière abrégée.
La voie directe est constituée de neurones striataux GABAergiques qui expriment le récepteur dopaminergique D1, ainsi que la substance P et la dynorphine (Parent & Parent,
2016). Ces neurones, une fois excités, projettent de manière directe et monosynaptique sur certains neurones du GPi et de la SNr afin de les inhiber. Ce faisant, l’inhibition du thalamus est levée et celui-ci peut communiquer avec le cortex cérébral dans le but, bien souvent, de l’informer sur l’action motrice sélectionnée. La voie directe est alors considérée comme favorisant la sélection d’une action motrice, l’accomplissement de celle-ci et, donc, l’exécution d’un mouvement.
Pour sa part, la voie indirecte est constituée de neurones striataux GABAergiques qui expriment le récepteur dopaminergique D2, ainsi que l’enképhaline (Parent & Parent, 2016).
Leur influence sur les portes de sortie des GB se fait de manière polysynaptique puisque leur projection primaire vise les neurones du GPe. Cette structure, tel que décrit plus haut, cible principalement les neurones du STN afin de diminuer leur activité. Une fois inhibés par les neurones de la voie indirecte, les neurones du GPe subissent une baisse d’activité qui conduit à une désinhibition des neurones du STN. Cette perte d’inhibition permet aux neurones du STN de stimuler les portes de sortie des GB via leurs projections glutamatergiques. Ceci a pour effet d’inhiber de manière globale le thalamus et, par le fait même, d’empêcher la sélection motrice ainsi que l’exécution du mouvement. La voie indirecte est alors perçue comme défavorable à l’initiation du mouvement. Il est important de souligner ici la position cruciale qu’occupe le STN au sein de la voie indirecte des ganglions de la base.
On présume que le fonctionnement harmonieux des GB repose en grande partie sur l’équilibre entre la voie directe et indirecte. Il s’agit là d’un équilibre précaire puisqu’il repose principalement sur la fluctuation d’un neuromodulateur qui influence grandement le fonctionnement des GB. En effet, la dopamine provenant de la SNc est d’une grande importance pour le fonctionnement du striatum. Une augmentation subite ou une diminution à long terme de sa concentration au sein de la structure viendra grandement débalancer l’équilibre entre la voie directe et indirecte. Ces changements sont la cause de ce qui mène, entre autres, à l'expression des symptômes moteurs de nature hypokinétiques qui caractérisent la maladie de Parkinson (MP) (Levy et al., 1997; DeLong & Wichmann, 2007; Obeso et al., 2008). En effet, puisque les neurones de la voie directe expriment le récepteur D1 couplé positivement à l’adénylate cyclase, ces neurones seront excités par la dopamine.
D’un autre côté, les neurones de la voie indirecte expriment le récepteur D2, inhibiteur,
puisque celui-ci est couplé négativement à l’adénylate cyclase. La présence de la dopamine au sein du striatum permet donc de réguler l’activité des voies directe et indirecte. Une perte de dopamine, telle qu’observée dans la MP par exemple, provoque un déséquilibre important entre ces voies. La voie directe deviendra moins active alors que la voie indirecte deviendra beaucoup plus active sans l’inhibition que lui procurait la dopamine. Ceci résulte, au final, en l’apparition de symptômes moteurs si caractéristiques chez les patients parkinsoniens, comme la bradykinésie, les tremblements au repos, les problèmes posturaux et la difficulté d’initier des mouvements.
Tel que décrit plus haut, ce modèle ne tient pas en compte certaines études récentes qui suggèrent qu’il existe de nombreuses interactions entre la voie directe et indirecte (Parent et al., 2000; Lévesque & Parent, 2005b; Parent & Parent, 2016). Par exemple, on sait maintenant que la plupart des neurones striatofuges innervent aussi le GPe. Le degré de collatéralisation des neurones qui composent les GB est beaucoup plus complexe que ce qui est présenté dans le modèle classique. Bien que très utile à la compréhension du fonctionnement et de l’organisation des GB, je crois important de mentionner qu’il faut tempérer cet ancien modèle dans le contexte actuel.
1.2.2 La voie hyperdirecte
Le noyau subthalamique comme seconde porte d'entrée des ganglions de la base
Tel que mentionné plus haut dans ce mémoire, le STN reçoit différentes projections afférentes en provenance du cortex cérébral (Nambu et al., 1996; Kita & Kita, 2012; Haynes & Haber, 2013). À la suite du modèle classique proposé dans les années 80, les projections corticales forment une troisième voie neuronale qui s’ajoute à l’ancien modèle. Cette projection du cortex au STN fut nommée la projection corticosubthalamique, mieux connue sous le nom de « voie hyperdirecte » (Nambu et al., 2002). Cette projection était nécessaire afin d’expliquer certains phénomènes observables au niveau du fonctionnement des GB, mais dont on ne connaissait pas la cause. En effet, après stimulation du cortex cérébral, il était possible d’observer une forte, mais courte, activation des neurones du STN et du GPi avant même l’arrivée de l’information en provenance de la voie indirecte et directe (Nambu et al., 2000; Nambu et al., 2002). La compréhension des mécanismes reliés à la voie hyperdirecte permet de mieux expliquer ces phénomènes.
Des études électrophysiologiques chez le macaque ont permis d’observer que les neurones pallidaux passaient au travers de trois phases suite à une stimulation corticale : (1) une courte excitation suivie (2) d’une inhibition puis (3) d’une excitation tardive (Nambu et al., 2000). De manière intéressante, une lésion de la voie hyperdirecte chez le singe macaque élimine l’excitation initiale normalement perçue dans les neurones pallidaux de singes normaux (Inoue et al., 2012; Mathai et al., 2015; Chu et al., 2017). Ainsi, on croit que la voie corticosubthalamique permettrait au cortex cérébral d’acheminer indirectement de l’information au pallidum, via un relais au STN, tout en court-circuitant le striatum. Ce mécanisme permettrait alors d’inhiber de larges portions du thalamus lors d’une présélection d’une action motrice par le cortex cérébral. Par la suite, le signal transmis par la voie directe serait en mesure d’inhiber des neurones spécifiques appartenant aux portes de sortie des GB. En inhibant les neurones GABAergiques, on assure une sélection fine et précise de l’action motrice à exécuter en désinhibant les noyaux moteurs du thalamus. Finalement, le signal parvenant par la voie indirecte arriverait au GPi par le STN ce qui permettrait une seconde
inhibition du thalamus afin de s’assurer une terminaison du mouvement et une inhibition des mouvements involontaires.
Le projet de recherche présenté dans ce mémoire tentera de valider cette hypothèse en faisant l’inventaire des noyaux, autre que le STN, qui sont innervés par la voie hyperdirecte. Ce type d’information nous permettra de mieux mieux comprendre le rôle de la voie hyperdirecte au sein des GB.
Le noyau subthalamique en conditions pathologiques
L'implication du noyau subthalamique dans la maladie de Parkinson
La maladie de Parkinson (MP) est reconnue pour être causée par la dégénérescence des neurones dopaminergiques qui composent la SNc et dont les axones s’arborisent au sein du striatum (Albin et al., 1989; DeLong & Wichmann, 2007; Galvan & Wichmann, 2008). Tel que décrit plus haut, cette perte en dopamine dans le striatum causerait un débalancement entre la voie directe et la voie indirecte. Ceci aurait comme conséquence immédiate de produire les symptômes moteurs décrits plus haut qui sont si facilement visibles chez les patients atteints de la maladie. En effet, la perte de dopamine striatale lève l’inhibition normalement produite par ce neurotransmetteur au niveau des neurones de la voie indirecte qui exprime le récepteur D2. Cette voie devient alors anormalement active, ce qui vient
bloquer de manière efficace une partie du contrôle moteur.
Bien que la perte en dopamine au sein du striatum soit à la base des changements fonctionnels observés dans les GB, plusieurs autres modifications sont visibles et mesurables (Galvan & Wichmann, 2008). Par exemple, la hausse d’activité de la voie indirecte viendrait diminuer le niveau d’activité du GPe normalement observé en conditions saines. En revanche, le débalancement entre les voies directe et indirecte induirait une augmentation de l’activité du GPi et du STN (Galvan & Wichmann, 2008; Mathai et al., 2015). Bien que le STN possède une activité autonome en conditions normales, les neurones du noyau deviendraient
hyperactifs suite à la perte des mécanismes de rétroaction du GPe : les patrons de décharge normalement stables et rythmés changent pour des patrons de décharge en rafale dans la MP (Bergman et al., 1994). L’augmentation de l’activité du STN expliquerait alors une activité du GPi accrue, un phénomène qui renforce davantage l’inhibition du mouvement causée par la voie indirecte. D’ailleurs, un autre changement est observé dans le STN en condition pathologique. Étrangement, les neurones composant le STN synchronisent leurs décharges avec d’autres structures des GB dans la MP (Bergman et al., 1994; Hammond et al., 2007). Cette synchronicité anormale est présentement considérée comme étant en partie la cause des symptômes moteurs observés lors de la MP.
La voie hyperdirecte subit à son tour des changements fonctionnels et morphologiques dans la MP. Tel que démontré chez le modèle primate de la MP, cette voie se réorganise d’un point de vue ultra-structurel (Mathai et al., 2015). Une perte d’innervation, ou plutôt une diminution du nombre de varicosités axonales glutamatergiques est observée au sein du STN chez les modèles animaux de la MP. Cette perte serait concentrée sur le territoire sensorimoteur du STN, suggérant que les projections du cortex moteur seraient le plus fortement touchées par la MP. La diminution d’innervation corticale au STN permettrait ainsi d’expliquer en partie la quantité de mouvements involontaires observés suite à l’initiation du mouvement chez les patients parkinsoniens; en ayant une diminution d’intensité dans le premier signal du cortex au STN relayé par la voie corticosubthalamique, qui permet d’inhiber une bonne partie du thalamus moteur avant le choix du programme moteur à effectuer par la voie directe, certains symptômes moteurs seraient en mesure de faire leur apparition chez le patient (Inoue et al., 2012).
Une cible de choix pour la stimulation cérébrale profonde
Les patients atteints de la MP reçoivent normalement de la L-Dopa. Cette molécule, qui est le précurseur de la dopamine, est régulièrement utilisée comme première ligne de traitement afin de diminuer l’ampleur des symptômes moteurs provoqués par la dégénérescence des neurones dopaminergiques de la SNc. En effet, les symptômes moteurs de la maladie, tels
que les tremblements au repos, la difficulté d’initier un mouvement et la rigidité musculaire, se voient grandement améliorés suite à ce traitement pharmacologique (Connolly & Lang, 2014). Bien que ce médicament soit très efficace durant les premières années de traitement, il ne permet pas d’arrêter le processus neurodégénératif associé à la MP. Certains patients finissent par ne plus répondre à la L-Dopa alors que d’autres voient leurs symptômes moteurs associés à la MP revenir. De plus, la L-Dopa cause fréquemment des dyskinésies chez plusieurs patients après seulement quelques années de traitement (Manson et al., 2012). Ces patients deviennent alors de parfaits candidats pour un nouveau type de thérapie, la stimulation cérébrale profonde (DBS) (Jahanshahi, 2013; Akram et al., 2017).
Présentement, deux composantes des GB sont principalement visées lors de cette chirurgie : le GPi et le STN (Steiner & Tseng, 2016; Wichmann & DeLong, 2016). Cependant, la petite taille du STN fait de cette structure la zone de choix pour l’implantation des électrodes. En effet, le territoire sensorimoteur étant plus facile à atteindre dans le STN comparativement au GPi, les effets thérapeutiques de la DBS sont alors plus prononcés. De plus, les patients qui reçoivent des implantations d’électrodes DBS dans le STN sont en mesure d’arrêter ou de diminuer progressivement leur médication en L-Dopa, contrairement à ceux qui reçoivent des implantations dans le GPi (Wichmann & DeLong, 2016).
Il est intéressant de noter qu’une lésion du STN chez un individu normal cause de l’hémiballisme (mouvements anormaux et involontaires de nature violente et désordonnée) alors qu’une inhibition fonctionnelle ou lésionnelle de cette même structure chez un patient souffrant de la MP atténue significativement certains des symptômes moteurs de la maladie (Steiner & Tseng, 2016). L’hémiballisme serait causé par la perte de l’action inhibitrice qu’exercent les portes de sortie des ganglions de la base sur le thalamus. Les neurones du STN étant lésés, ceux-ci ne sont plus en mesure de stimuler efficacement le GPi et de la SNr et donc d’inhiber les mouvements involontaires. En revanche, les effets bénéfiques de la DBS au niveau du STN chez les patients parkinsoniens seraient dus, en partie, à une perturbation électrique du noyau qui lui permettrait de retrouver un état d’activité semblable à la normale (Wichmann & DeLong, 2016). En ramenant le STN hyperactif à un niveau d’activité normal,
patients atteints de la MP. De plus, il est observé qu’une désynchronisation de l’activité des noyaux composant les GB permettrait l’amélioration des symptômes moteurs de la MP (Wichmann & DeLong, 2016). La voie corticosubthalamique serait-elle aussi impliquée dans ces effets bénéfiques? Certaines équipes de recherche (Li et al., 2007; Kuriakose et al., 2009; Devergnas & Wichmann, 2011) s’avancent en disant qu’une dépolarisation antidromique des axones constituant cette voie neuronale médierait une partie des effets thérapeutiques. Cependant, des recherches plus poussées sur ce mécanisme d’action sont nécessaires afin de pouvoir arriver à une meilleure compréhension des mécanismes à la base des effets thérapeutiques produits par la stimulation à haute fréquence du STN. Le projet de recherche présenté dans ce mémoire tentera d’éclaircir davantage ce mode d’action en décrivant de manière approfondie l’organisation morphologique de la voie hyperdirecte chez le macaque.
1.3 Objectifs du projet
1.3.1 État de la question et objectifs poursuivis
Le STN est la principale structure excitatrice des GB. La position cruciale que le STN occupe dans l’organisation anatomique et fonctionnelle de cet ensemble de structures sous-corticales impliqué dans le contrôle du comportement moteur nous a été révélée, entre autres, par des études de traçage unitaire détaillées portant sur les relations de ce noyau avec les autres structures sous-corticales. En revanche, notre connaissance des projections que le STN reçoit en provenance du cortex cérébral est très lacunaire. À ce jour, une seule étude de la voie corticosubthalamique par traçage neuronal unitaire a été réalisée (Kita & Kita, 2012). Ce travail, effectué chez le rat, rapporte plusieurs caractéristiques morphologiques et anatomiques intéressantes des neurones corticaux composant le cortex moteur primaire du rongeur. Celles-ci sont décrites dans le deuxième chapitre de ce mémoire. Malheureusement, la transposition de ces données aux primates pose problème car il existe de nombreuses variations neuroanatomiques entre rongeurs et primates. Bien que le modèle anatomique et fonctionnel des GB s’applique aussi bien aux rongeurs qu’aux primates, certains différences
interspécifiques fondamentales seront mises en évidence dans l’article présenté dans la section 2 de ce mémoire.
Certaines études des afférence corticales au STN ont été effectuées chez le singe avec des traceurs rétrogrades et antérogrades (Nambu et al., 1996; Nambu et al., 1997), ainsi qu’avec des virus (Haynes & Haber, 2013). Cependant, ces travaux ne rapportent qu’une vision globale de ces projections sans offrir une analyse détaillée au niveau neuronal unitaire de l’organisation de la voie hyperdirecte. Par exemple, on ne sait toujours pas si les neurones qui forment la voie corticosubthalamique émettent, le long de leur trajet descendant, des collatérales au striatum. Est-ce une seule et même population de neurones qui innervent à la fois le striatum et le STN, ou est-ce deux populations distinctes? Est-ce que ces neurones ciblent le STN de manière controlatérale, ipsilatérale ou un mélange des deux? De plus, nous n’avons qu’une vague idée des autres structures innervées par les neurones de la voie hyperdirecte. Existe-t-il plusieurs types morphologiques de neurones projetant au STN? Ces neurones sont-ils tous dédiés exclusivement au STN ou projettent-ils en plus à d’autres structures? En outre et tel que décrit plus haut, les mécanismes d’action de la stimulation cérébrale profonde sont encore peu compris. Serait-il possible que la voie hyperdirecte ait un rôle à jouer dans le mécanisme thérapeutique de la DBS, par activation orthodromique et antidromique des fibres de la voie cortisubthalamique? Afin de répondre à ces questions, des informations concernant la trajectoire et le degré de collatéralisation des axones glutamatergiques de la voie hyperdirecte chez le primate sont nécessaires, et ce, de manière neuronale unitaire.
L’objectif principal de mon projet de recherche est donc de mettre en évidence l’organisation anatomique et fonctionnelle unitaire des neurones formant la voie hyperdirecte. Pour se faire, j’ai utilisé une technique de marquage et de traçage de neurones unitaires (voir section 1.3.2) qui permet la reconstruction tridimensionnelle complète de l’arborisation axonale des neurones situés dans la couche V du cortex moteur primaire chez le primate. Pour la toute première fois, il sera possible de visualiser l’arborisation entière des neurones formant la voie corticosubthalamique. Différents types de neurones pourront être identifiés en portant une
de décrire l’arborisation la voie hyperdirecte en fonction des territoires fonctionnels du STN. Ceci permettra de mieux comprendre l’implication de cette projection corticofuge dans le contrôle moteur, limbique et associatif. Finalement, cette étude vise à améliorer la compréhension globale de l’organisation anatomo-fonctionnelle des GB. Elle s’inscrit donc dans un programme de recherche d’envergure qui permettra à plusieurs autres équipes de recherche, dont celles en bioinformatique, neuroanatomie et en neurochirurgie, de faire avancer les connaissances en ce qui a trait à la physiopathologie de la MP, mais aussi de ses traitements.
1.3.2 La technique utilisée
Pour effectuer cette étude, l’utilisation d’une technique autrefois révolutionnaire, mais aujourd’hui encore très fiable, a été choisie. L’injection stéréotaxique d’un traceur antérograde assure le marquage entier de quelques neurones seulement, des dendrites à l’axone. Elle permet d’effectuer des reconstructions individuelles et en trois dimensions de neurones ayant capté le traceur, incluant le traçage détaillé du trajet et de l’arborisation de leur axone.
Afin d’étudier les neurones de la couche V du cortex moteur primaire de singes macaques, d’où origine la voie hyperdirecte, l’utilisation d’injections stéréotaxiques par microiontophorèse a été choisi. Comme traceur neuronal, nous avons utilisé la biotine dextran amine (BDA), un traceur antérograde qui est capté par le corps cellulaire du neurone et qui voyage le long de ses dendrites et de son axone. La BDA est d’abord dissoute (2%) dans une solution d’acétate de potassium (0,5 M). Cette solution est ensuite introduite dans une micropipette de verre de 2-3 µm de diamètre. De manière intéressante, cette même micropipette permet l’enregistrement électrophysiologique de neurones rencontrés lors de la descente. L’enregistrement des patrons de décharge, qui diffèrent d’une population neuronale à l’autre, assure un meilleur guidage lors de la descente de la micropipette. Comme il s’agit ici d’injections dans le cortex moteur primaire, dont l’emplacement varie peu d’un animal à l’autre, nous n’avons pas senti le besoin de procéder à une ventriculographie. Une telle
procédure est surtout nécessaire lorsque les injections visent des structures sous-corticale profondes. Le traceur est injecté à l’aide d’un courant positif de 300-400 nA appliqué pendant 25 minutes, 1 seconde ON et une seconde OFF. Par la suite, on laisse l’animal survivre pour une période de 8 à 10 jours afin que le traceur puisse migrer jusqu’aux terminaisons axonales. L’animal est ensuite sacrifié par perfusion transcardiaque dans le but de fixer le cerveau. À cet effet, on procède d’abord à un lavage avec une solution de NaCl 0,9%, suivie de paraformaldéhyde à 4% et d’une solution de sucrose 10%. Par la suite, une post-fixation est faite. Le cerveau est placé dans une solution composée d’un tiers de paraformaldéhyde 4% et de deux tiers de sucrose 30%, pendant 24h.
Afin d’être en mesure de visualiser le traceur, on doit traiter le cerveau à l’aide d’une méthode d’immunohistochimie. Celui-ci est d’abord coupé en tranches de 70 µm d’épaisseur à l’aide d’un microtome à congélation. Les sections sont ensuite incubées dans une solution contenant le complexe avidin-biotine couplé à la peroxydase (kit ABC) à 4° Celsius pendant une nuit. Le traceur injecté est révélé à l’aide de peroxyde d’hydrogène 30% et un chromogène, le 3,3’-diaminobenzidine tétrahydrochloride (DAB). Afin de mieux visualiser l’ensemble des structures cérébrales, les sections sont contre-colorées grâce à une réaction enzymatique médiée par la cytochrome oxydase.
Le marquage des neurones injectés étant d’une qualité semblable à celle obtenue par l’imprégnation argentique de la méthode de Golgi, la reconstruction neuronale entière à l’aide de sections sériées put s’effectuer. L’utilisation d’un microscope optique, d’une caméra lucida et du logiciel Neurolucida (MicroBright-Field, Colchester, VT) a été nécessaire afin de compléter l’étude.
De plus, afin de décrire en détail la morphologie et l’incidence synaptique des varicosités axonales libérant du glutamate dans le STN et dont le corps cellulaire est situé dans le cortex cérébral, le cerveau d'un singe cynomolgus a été préparé pour la microscopie électronique. Ce singe a préalablement été sacrifié par perfusion transcardiaque avec 400 ml de PBS, suivi de 600 ml d'acroléine dilué à 3% dans du PBS, d’une solution de 700 ml de PFA 4% avec
rapidement extrait puis post-fixé par immersion dans une solution de PFA 4% pendant 1 heure à 4°C. Par la suite, le cerveau a été coupé au vibratome en sections transversales de 50 µm d'épaisseur. Trois sections prises au centre du STN ont été immunomarquées pour le transporteur vésiculaire du glutamate 1 (VGluT1), un marqueur spécifique des axones corticofuges (Fujiyama et al., 2006; Raju et al., 2006). En bref, ces sections ont été incubées à température pièce dans (1) une solution bloquante pendant 1 heure, (2) la même solution contenant une dilution 1:1000 d'anticorps polyclonaux de cobaye dirigés contre VGluT1 pendant une nuit et (3) une dilution 1:1000 d'anticorps biotinylés anti-cobaye pendant 1 heure dilués dans la solution de blocage initiale. Les sections ont ensuite été incubées dans une solution contenant le complexe avidin-biotine couplé à la peroxydase (kit ABC) à 4°C pendant 1 heure. Le marquage VGluT1 est révélé à l’aide de peroxyde d’hydrogène 0,005% et de DAB 0,05%. Les coupes ont ensuite été incubées pendant 30 minutes dans une solution d'OsO4 1%. Elles ont ensuite été déshydratées dans de l'éthanol et de l'oxyde de propylène
pour finalement être mises sur lame avec du Durcupan. Des régions quadrangulaires du STN dorsolatéral ont été découpées à partir des coupes marquées pour VGluT1. Celles-ci ont ensuite été coupées en sections ultra-fines (~80 nm) à l’aide d’un ultramicrotome. Après avoir été collectées sur grilles et colorées au citrate de plomb, les sections ultra-fines ont été examinées au microscope électronique à transmission équipé d’une caméra digitale intégrée. Les varicosités axonales positives pour VGluT1 (+) ont été échantillonnées de manière aléatoire à un grossissement de 11 000x en prenant une photo à chaque fois qu'elles étaient rencontrées. Les varicosités axonales VGluT1+ ont été analysées en utilisant le logiciel de traitement IMAGE J pour mesurer leurs axes longs et courts. Elles ont ensuite été classées comme contenant ou non une mitochondrie et montrant ou non une jonction synaptique. Toutes les jonctions synaptiques ont également été caractérisées comme symétriques ou asymétriques, puis la cible synaptique a été identifiée et la longueur des jonctions mesurée. L'incidence synaptique mesurée à partir de sections ultra-fines a ensuite été extrapolée au volume total des varicosités axonales au moyen de la formule de Beaudet et Sotelo (Beaudet & Sotelo, 1981), en utilisant le grand axe comme diamètre, selon Umbriaco et al. (Umbriaco et al., 1994).
Pour obtenir de plus amples informations sur la technique, veuillez référer à la section « Materials and Methods » de l’article intégré dans ce mémoire.
1.3.3 Présentation du mémoire
La formule adoptée pour la présentation de ce mémoire est celle de l’intégration par article scientifique. Les résultats de cette étude ont été présentés en novembre 2017 lors de la quarante-septième édition du congrès de la « Society for Neuroscience » qui se tenait à Washington, D.C., aux États-Unis. Le manuscrit incorporé a récemment été accepté pour publication dans la revue Brain Structure and Function, un journal doté d’un comité de révision par les pairs. Suite à une brève introduction, la méthode y est décrite en détails et les différents résultats concernant l’arborisation axonale tridimensionnelle des neurones du cortex moteur primaire formant la voie hyperdirecte sont présentés. Une importante discussion suit la présentation des résultats afin de situer ces nouvelles observations par rapport à celles retrouvées précédemment dans la littérature.
Résumé de l’article
Des injections stéréotaxiques par microiontophorèse de biotine dextran amine, un traceur antérograde, ont été effectuées au niveau de la couche V du cortex moteur primaire chez quatre singes cynomolgus (Macaca fascicularis). Le traçage unitaire détaillé de l’arborisation axonale de 28 axones composant la voie corticosubthalamique montre que l’innervation de ces axones est ipsilatérale et que la population neuronale à l’origine de cette projection est distincte de celle composant la voie corticostriée. Ces axones voyagent jusqu’aux étages inférieurs du tronc cérébral et émettent, en passant, des collatérales de plus petit diamètre qui innervent à la fois la zona incerta, le noyau rouge, les noyaux supérieurs pontiques, le noyau réticulaire du thalamus et le noyau subthalamique. L’arborisation axonale de la voie hyperdirecte au sein du noyau subthalamique intéresse principalement le territoire sensorimoteur. Les résultats obtenus démontrent que la voie corticosubthalamique est majoritairement indirecte : celle-ci provient de collatérales émises par des axones principaux en route vers les étages inférieurs du tronc cérébral.
2. Article
SINGLE-AXON TRACING OF THE
CORTICOSUBTHALAMIC HYPERDIRECT
PATHWAY IN PRIMATES
Dymka Coudé, André Parent and Martin Parent*
Laboratoire de Neurobiologie
Centre de recherche Université Laval CERVO 2601, Chemin de la Canardière, Local F-6500
Beauport, Québec, Canada, G1J 2G3
Abbreviated title: The hyperdirect pathway in monkeys
Key words: basal ganglia, subthalamic nucleus, primary motor cortex, single-axon reconstruction, corticosubthalamic projections, monkeys.
*Correspondence to: Martin Parent, Ph.D.
CERVO Brain Research Centre 2601, Canardière, F-6500 Quebec City (Quebec) Canada, G1J 2G3
Tel: (418) 663-5747 (ext 6736) Fax: (418) 663-8756
E-mail: martin.parent@fmed.ulaval.ca
Grant sponsor: The study was supported by research grants from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR MOP-153068) and the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC 2018-06264 and 2018-522690) to M.P. who also benefited from of a Junior II career award from the Fonds de Recherche du Québec - Santé (FRQ-S). D.C. was recipient of MSc fellowship from FRQ-S. The authors have no conflict of interest to declare.
ABSTRACT
Individual axons that form the hyperdirect pathway in Macaca fascicularis were visualized following microiontophoretic injections of biotinylated dextran amine in layer V of the primary motor cortex (M1). Twenty-eight singly-labeled axons were reconstructed in 3D from serial sections. The M1 innervation of the subthalamic nucleus (STN) arises essentially from collaterals of long-ranged corticofugal axons en route to lower brainstem regions. Typically, after leaving M1, these large caliber axons (2-3 µm) enter the internal capsule and travel between caudate nucleus and putamen without providing any collateral to the striatum. More ventrally, they emit a thin collateral (0.5-1.5 µm) that runs lateromedially within the dorsal region of the STN, providing boutons en passant in the sensorimotor territory of the nucleus. In some cases, the medial tip of the collateral enters the lenticular fasciculus dorsally and yields a few beaded axonal branches in the zona incerta. In other cases, the collateral runs caudally and innervates the ventrolateral region of the red nucleus where large axon varicosities (up to 1.7 µm in diameter) are observed, many displaying perisomatic arrangements. Our ultrastructural analysis reveals a high synaptic incidence (141%) of cortical VGluT1-immunoreactive axon varicosities on distal dendrites of STN neurons, and on various afferent axons. Our single-axon reconstructions demonstrate that the so-called hyperdirect pathway derives essentially from collaterals of long-ranged corticofugal axons that are rarely exclusively devoted to the STN, as they also innervate the red nucleus and/or the zona incerta.
INTRODUCTION
The subthalamic nucleus (STN) occupies a pivotal position in the functional organization of the basal ganglia (BG). Being the only glutamatergic component of the BG, the STN is often viewed as a major driving force of this set of subcortical structures (Parent & Hazrati, 1995b; Mink, 1996; DeLong & Wichmann, 2007; Gerfen & Bolam, 2017). Our previous single-axon tracing studies in primates have revealed that STN neurons are endowed with a highly collateralized axon, which allows them to exert a direct excitatory influence on the two major output structures of the BG, namely, the internal pallidum and the substantia nigra pars reticulata, as well as on the external pallidum and the striatum (Sato et al., 2000). Besides these multiple efferent projections, the STN receives afferents from different brain regions (Parent & Hazrati, 1995b) and is often considered an important input station of the BG, as it acts in parallel with the striatum, the main entry structure, to directly collect and integrate cortical information (Nambu et al., 1996; Nambu et al., 2002). Although significant glutamatergic projections arising from the caudal intralaminar thalamic nuclei exist (Sadikot et al., 1992), the STN receives most of its glutamate-mediated excitatory input from neurons located in layer V of the primary motor cortex (M1) and the supplementary motor area (Hartmann-von Monakow et al., 1978; Rouzaire-Dubois & Scarnati, 1985; Canteras et al., 1990; Nambu et al., 1996), as well as from other prefrontal cortical regions (Haynes & Haber, 2013). This projection system, which has been called the hyperdirect pathway (Nambu et al., 1996), allows cortical information to be directly relayed to the STN, without being processed by striatal neurons (Steiner & Tseng, 2016). Because it bypasses the striatum, the hyperdirect pathway is seen as a route whereby cortical information can influence the BG output structures (the internal pallidum and the substantia nigra pars reticulata) with shorter latencies than through the so-called direct and indirect striatofugal pathways.
The abnormal activity of STN neurons in Parkinson's disease (PD) is believed to be associated with motor symptoms that characterize this neurodegenerative disorder, including rigidity, bradykinesia, resting tremors and postural instability (Galvan & Wichmann, 2008; Kita & Kita, 2011). For this reason, the STN has become a target of choice for chronic deep
(Wichmann et al., 2017). Moreover, antidromic activation of the motor cortex through the hyperdirect pathway following DBS of the STN is thought to play a key role in the mediation of DBS therapeutic effects in PD patients (Wichmann & DeLong, 2016; Anderson et al., 2018). Therefore, in the hope to reach a better understanding of the anatomical and functional organization of the primate BG, while obtaining new insights into the cellular mechanisms of DBS, we undertook, for the very first time, a detailed single-axon tracing study of the corticosubthalamic hyperdirect pathway in cynomolgus monkeys. Our main findings indicate that the hyperdirect pathway derives essentially from collaterals of long-ranged corticofugal axons, en route to lower brainstem regions.
MATERIALS AND METHODS
Injection procedures
A total of five adult cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis) of both sexes, with a body weight that ranged from 3-4 kg, were used in the present study. All experimental procedures were approved by the Comité de Protection des Animaux de l’Université Laval, in accordance with the Canadian Council on Animal Care’s Guide to the Care and Use of Experimental Animals (Ed2). Maximum efforts were made to minimize the number of animals used. The animals were first anesthetized with ketamine (75 mg/kg) plus xylazine (5 mg/kg) and their head placed in a specifically designed stereotaxic apparatus. They were then maintained under propofol (10 mg/ml, i.v.) anesthesia, while microiontophoretic injections of biotin dextran amine (BDA 10 000 MW, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Catalog no. D1956) were being made bilaterally in the forelimb area of the primary motor cortex (M1), as identified on physiological maps previously established (Woolsey, 1958; Kwan et al., 1978; Stepniewska et al., 1993). Because corticosubthalamic projections were found to originate mainly from layer V in primates (Nambu et al., 1996), BDA injections were centered upon this cortical layer. In some cases, neurons located in supragranular layers were also labeled. However, these neurons were very few in number, their staining was weak, and their axon could not be traced outside the cerebral cortex. They most likely represent neurons
whose neuronal processes (axons or dendrites) have transported a small amount of tracer from the periphery of the main injection loci.
Four injections were made in each animal, two on each side of the brain. We used the stereotaxic coordinates of the atlas of Szabo and Cowan (Szabo & Cowan, 1984) and microiontophoretic labeling was carried out with glass micropipettes (tip diameter 2-3 µm) filled with a solution of potassium acetate (0.5M) plus 2% BDA. These electrodes had impedance ranging between 10-15 MΩ and were used to monitor the extracellular activity of the neuronal populations encountered during the penetration of the micropipette. Layer V of M1 was easily recognizable by the characteristic bursting firing pattern of its neurons under propofol anesthesia (Fig. 1C). Once in the chosen target, the micropipette was connected to a high compliance iontophoresis device (NeuroData) and the tracer was injected by passing positive current pulses of 350 nA (1s on/ 1s off) for 25 min.
Tracer visualization and cytochrome oxidase staining
After a survival period of 8-10 days, the animals were deeply anesthetized with sodium pentobarbital and perfused transcardially with 1 liter of saline solution (0.9%) followed by 2 liters of a fixative solution containing 4% paraformaldehyde (PFA) in phosphate buffer (PB, 0.1M, pH 7.4) and 1 liter of 10% sucrose solution in PB. The brains were dissected out and placed in a cryoprotective solution composed of 1/3 PFA (4% solution in PB) and 2/3 sucrose (30% solution in PB) for 24h at 4°C. Sagittal (1 monkey) or frontal (3 monkeys) frozen sections of 70 µm were obtained from a sliding microtome. The sections were collected serially in phosphate buffer saline (PBS, 0.1M, pH 7.4) and processed for the visualization of BDA according to the avidine-biotin-peroxydase method (ABC Elite kit, Vector Labs, Burlingame, CA) with 3,3’diaminobenzidine (DAB; Sigma, St. Louis, MO) as the chromogen. In brief, the sections were incubated overnight at 4°C in a solution containing ABC diluted 1:100 in 0.1M PBS, pH 7.4, plus 1% normal rabbit serum and 1% triton X-100. They were then rinsed twice in PBS and once in Tris buffer. The bound peroxidase was revealed by incubating the sections in a solution containing 0.05% DAB, 0.3% nickel-ammonium sulfate, and 0.005% H2O2 in 0.05M Tris buffer (pH 7.6) for 8-10 minutes at room
temperature. The reaction was terminated by a rinse in Tris buffer followed by two rinses in PBS.
To help identify cortical layers, nuclei and structures that harbored labeled neurons and axons, sections were counterstained for cytochrome oxidase, according to the histochemical protocol of Wong-Riley (Wong-Riley, 1979). The counterstaining was performed before BDA revelation, and nickel-cobalt-intensified DAB (dark blue reaction) and unintensified DAB (diffuse brown precipitate) were used to reveal BDA and cytochrome oxidase, respectively.
Material analysis and neuronal reconstructions
All sections were mounted on gelatin-coated slides, dehydrated in graded alcohols, cleared in toluene, and coverslipped with Permount. Labeled axons were reconstructed in three dimensions by using a light microscope equipped with a motorized stage and an image analysis software (Neurolucida, MicroBrightField, Colchester, VT). Entire and individual axonal reconstructions were obtained from serial sagittal or transverse sections, each containing at least one axonal segment. By going from one section to another, we were able to follow and reconstruct individually injected axons. The terminal fields of labeled neurons were mapped at lower magnifications to determine their topographic localization according to the atlas of Szabo and Cowan (Szabo & Cowan, 1984). The photomicrographs were digitally captured (camera model DC 300, Leica, Wetzlar, Germany) and processed with the Adobe Photoshop software (version CS6, Adobe, San Jose, CA). The terminal arborization of each axon at the STN level was carefully examined. A neuron was considered projecting toward lower brainstem regions when its labeled axon could be traced into the cerebral peduncle, ventral and caudal to the substantia nigra. Each axonal varicosity encountered along the various branches of individual axons was precisely charted and the total number of such varicosities was determined to estimate the strength of the synaptic input provided by a single corticofugal axon.
