La technique utilisée

Pour effectuer cette étude, l’utilisation d’une technique autrefois révolutionnaire, mais aujourd’hui encore très fiable, a été choisie. L’injection stéréotaxique d’un traceur antérograde assure le marquage entier de quelques neurones seulement, des dendrites à l’axone. Elle permet d’effectuer des reconstructions individuelles et en trois dimensions de neurones ayant capté le traceur, incluant le traçage détaillé du trajet et de l’arborisation de leur axone.

Afin d’étudier les neurones de la couche V du cortex moteur primaire de singes macaques, d’où origine la voie hyperdirecte, l’utilisation d’injections stéréotaxiques par microiontophorèse a été choisi. Comme traceur neuronal, nous avons utilisé la biotine dextran amine (BDA), un traceur antérograde qui est capté par le corps cellulaire du neurone et qui voyage le long de ses dendrites et de son axone. La BDA est d’abord dissoute (2%) dans une solution d’acétate de potassium (0,5 M). Cette solution est ensuite introduite dans une micropipette de verre de 2-3 µm de diamètre. De manière intéressante, cette même micropipette permet l’enregistrement électrophysiologique de neurones rencontrés lors de la descente. L’enregistrement des patrons de décharge, qui diffèrent d’une population neuronale à l’autre, assure un meilleur guidage lors de la descente de la micropipette. Comme il s’agit ici d’injections dans le cortex moteur primaire, dont l’emplacement varie peu d’un animal à l’autre, nous n’avons pas senti le besoin de procéder à une ventriculographie. Une telle

procédure est surtout nécessaire lorsque les injections visent des structures sous-corticale profondes. Le traceur est injecté à l’aide d’un courant positif de 300-400 nA appliqué pendant 25 minutes, 1 seconde ON et une seconde OFF. Par la suite, on laisse l’animal survivre pour une période de 8 à 10 jours afin que le traceur puisse migrer jusqu’aux terminaisons axonales. L’animal est ensuite sacrifié par perfusion transcardiaque dans le but de fixer le cerveau. À cet effet, on procède d’abord à un lavage avec une solution de NaCl 0,9%, suivie de paraformaldéhyde à 4% et d’une solution de sucrose 10%. Par la suite, une post-fixation est faite. Le cerveau est placé dans une solution composée d’un tiers de paraformaldéhyde 4% et de deux tiers de sucrose 30%, pendant 24h.

Afin d’être en mesure de visualiser le traceur, on doit traiter le cerveau à l’aide d’une méthode d’immunohistochimie. Celui-ci est d’abord coupé en tranches de 70 µm d’épaisseur à l’aide d’un microtome à congélation. Les sections sont ensuite incubées dans une solution contenant le complexe avidin-biotine couplé à la peroxydase (kit ABC) à 4° Celsius pendant une nuit. Le traceur injecté est révélé à l’aide de peroxyde d’hydrogène 30% et un chromogène, le 3,3’-diaminobenzidine tétrahydrochloride (DAB). Afin de mieux visualiser l’ensemble des structures cérébrales, les sections sont contre-colorées grâce à une réaction enzymatique médiée par la cytochrome oxydase.

Le marquage des neurones injectés étant d’une qualité semblable à celle obtenue par l’imprégnation argentique de la méthode de Golgi, la reconstruction neuronale entière à l’aide de sections sériées put s’effectuer. L’utilisation d’un microscope optique, d’une caméra lucida et du logiciel Neurolucida (MicroBright-Field, Colchester, VT) a été nécessaire afin de compléter l’étude.

De plus, afin de décrire en détail la morphologie et l’incidence synaptique des varicosités axonales libérant du glutamate dans le STN et dont le corps cellulaire est situé dans le cortex cérébral, le cerveau d'un singe cynomolgus a été préparé pour la microscopie électronique. Ce singe a préalablement été sacrifié par perfusion transcardiaque avec 400 ml de PBS, suivi de 600 ml d'acroléine dilué à 3% dans du PBS, d’une solution de 700 ml de PFA 4% avec

rapidement extrait puis post-fixé par immersion dans une solution de PFA 4% pendant 1 heure à 4°C. Par la suite, le cerveau a été coupé au vibratome en sections transversales de 50 µm d'épaisseur. Trois sections prises au centre du STN ont été immunomarquées pour le transporteur vésiculaire du glutamate 1 (VGluT1), un marqueur spécifique des axones corticofuges (Fujiyama et al., 2006; Raju et al., 2006). En bref, ces sections ont été incubées à température pièce dans (1) une solution bloquante pendant 1 heure, (2) la même solution contenant une dilution 1:1000 d'anticorps polyclonaux de cobaye dirigés contre VGluT1 pendant une nuit et (3) une dilution 1:1000 d'anticorps biotinylés anti-cobaye pendant 1 heure dilués dans la solution de blocage initiale. Les sections ont ensuite été incubées dans une solution contenant le complexe avidin-biotine couplé à la peroxydase (kit ABC) à 4°C pendant 1 heure. Le marquage VGluT1 est révélé à l’aide de peroxyde d’hydrogène 0,005% et de DAB 0,05%. Les coupes ont ensuite été incubées pendant 30 minutes dans une solution d'OsO4 1%. Elles ont ensuite été déshydratées dans de l'éthanol et de l'oxyde de propylène

pour finalement être mises sur lame avec du Durcupan. Des régions quadrangulaires du STN dorsolatéral ont été découpées à partir des coupes marquées pour VGluT1. Celles-ci ont ensuite été coupées en sections ultra-fines (~80 nm) à l’aide d’un ultramicrotome. Après avoir été collectées sur grilles et colorées au citrate de plomb, les sections ultra-fines ont été examinées au microscope électronique à transmission équipé d’une caméra digitale intégrée. Les varicosités axonales positives pour VGluT1 (+) ont été échantillonnées de manière aléatoire à un grossissement de 11 000x en prenant une photo à chaque fois qu'elles étaient rencontrées. Les varicosités axonales VGluT1+ ont été analysées en utilisant le logiciel de traitement IMAGE J pour mesurer leurs axes longs et courts. Elles ont ensuite été classées comme contenant ou non une mitochondrie et montrant ou non une jonction synaptique. Toutes les jonctions synaptiques ont également été caractérisées comme symétriques ou asymétriques, puis la cible synaptique a été identifiée et la longueur des jonctions mesurée. L'incidence synaptique mesurée à partir de sections ultra-fines a ensuite été extrapolée au volume total des varicosités axonales au moyen de la formule de Beaudet et Sotelo (Beaudet & Sotelo, 1981), en utilisant le grand axe comme diamètre, selon Umbriaco et al. (Umbriaco et al., 1994).

Pour obtenir de plus amples informations sur la technique, veuillez référer à la section « Materials and Methods » de l’article intégré dans ce mémoire.