- Western blot
El Western blot o inmunoblot es una técnica que permite identificar una proteína de interés de forma específica, y cuantificarla de forma relativa en una muestra de tejido. Se basa en la electroforesis en gel que permite separar las proteínas por su
peso molecular. La proteína en estudio es reconocida por un anticuerpo específico, el anticuerpo primario, y de forma adicional, obtenemos información sobre su peso molecular y su cantidad relativa en la muestra.
La técnica comprende la preparación de la muestra con un lisado celular, y la degradación mecánica que permite liberar las proteínas. Luego se realiza una electroforesis en gel en las que se separan las proteínas. A continuación se hace una transferencia a una membrana que actuará como soporte. Finalmente, se procede a la inmunodetección específica de la proteína de interés con un anticuerpo primario. El resultado se hace visible gracias a un anticuerpo secundario que utiliza reacciones colorimétricas por autorradiografía, o sistemas de lectura para anticuerpos secundarios fluorescentes (Figura 12).
Modificado de Virology blog Figura 12. Técnica de Western blot. El Western blot o inmunoblot permite reconocer una proteína con un anticuerpo de forma específica. Esta técnica se basa en el principio de la aplicación de la electroforesis en gel. Proporciona información sobre el peso molecular de la proteína de interés y su cantidad relativa en la muestra.
Utilizamos la técnica de Western blot para medir las fracciones solubles de Aβ, tau total, p-Tau, y del enzima glucógeno sintetasa kinasa-3-β, en los compartimentos sináptico y citosólico, tal y como se describe a continuación.
Previamente obtuvimos extractos de citosol y de sinaptoneurosomas de el surco temporal superior y la corteza entorrinal (para más detalle ver apartado de extracción de sinaptoneurosomas). Determinamos entonces la concentración de
proteína en cada muestra utilizando suero bovino de albúmina (Bovine serum albumin, o BSA) según el protocolo del kit de ensayo de Pierce™ BCA Protein (ThermoScientific, Waltham, MA).
En función de las características de migración de las proteínas de interés utilizamos uno de los siguientes geles de electroforesis (Invitrogen, Waltham, MA):
- 4%-12% Bis-Tris, 1,5 mm, tampón MES.
- 10% Bis-Tris, 1,5 mm, tampón MOPS.
Preparamos las muestras añadiendo agente reductor NuPAGE® 10x, tampón LDS 4x, y un volumen suficiente para obtener 20 µg de proteína.
Desnaturalizamos las proteínas calentando a 95 °C durante 5 minutos, y añadimos SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard para su visualización durante la migración. Todos los reactivos utilizados fueron adquiridos de ThermoScientific, Waltham, MA.
Separamos las proteínas utilizando un gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). Para ello cargamos las muestras en 4%-12% Bis-Tris, 1,5 mm, tampón MES o 10% Bis-Tris, 1,5 mm, tampón MOPS según la proteína de interés, y aplicamos un voltaje de 140 V durante 90 minutos. Transferimos las proteínas separadas durante la electroforesis a una membrana de nitrocelulosa Amersham Protran 0.4 (GE Healthcare, Chicago, IL) en una solución tampón de transferencia a 300 mA durante 90 minutos. Todo el procedimiento se realizó en un dispositivo para transferencia blot XCell SureLock™ Mini-Cell (ThermoScientific, Waltham, MA).
Previo a la inmunodetección realizamos un bloqueo de anticuerpos inespecíficos con una incubación de la membrana en solución tampón Tris, y tampón de bloqueo de Licor durante al menos 2 horas a 4°C. Finalmente, incubamos la membrana con el anticuerpo primario adecuado por un período de 12 horas.
Realizamos lavados secuenciales y finalmente, añadimos el anticuerpo secundario de fluorescencia correspondiente. Detectamos la señal con el sistema de imagen Li-cor y el software Odyssey (Li-cor bioscience, Lincoln, MA).
En la Tabla 5 se enumeran los anticuerpos primarios utilizados en el Western blot.
Tabla 5. Anticuerpos primarios de Western blot
Parámetro Anticuerpo
primario Huésped Dilución
Sinaptoneurosomas
Sinaptofisina Conejo 1:1000
PSD95 Ratón 1:1000
Amiloide beta soluble 82E1/6E10 Ratón 1:1000
Tau total soluble H7 Ratón 1:1000
p-Tau soluble PHF-1 Ratón 1:1000
Glucógeno sintetasa kinasa-3-β GSK-3-β Conejo 1:1000
- ELISA
El ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA por sus siglas en inglés:
“enzyme-linked immunosorbent assay”) es una técnica de inmunoensayo que permite reconocer un antígeno fijado a una matriz al combinar la especificidad de un anticuerpo con la sensibilidad de una reacción enzimática. Esta técnica, además de ser altamente específica, ofrece una alta sensibilidad por lo que permite realizar cuantificaciones absolutas en microgramos o incluso nanogramos a nivel celular o subcelular.
En general, el ELISA comprende el uso de un plato de microtitulación que se recubre con un antígeno. Se sigue de un bloqueo para evitar el reconocimiento de sitios inespecíficos y de falsos positivos, y de una incubación con un anticuerpo primario. Finalmente, la adición de un anticuerpo secundario etiquetado, permite gracias a una reacción enzimática colorimétrica, visualizar el resultado del ensayo. Existen variaciones de este método general, a continuación describiremos el método de “ELISA sándwich” que utilizamos en nuestro estudio.
Recubrimos un plato de ELISA de 96 micropocillos con un anticuerpo de captura y lo incubamos durante 12 horas a 4 °C. Hicimos lavados secuenciales, incubamos con la solución de bloqueo durante 30 minutos, lavamos de nuevo, y añadimos 100 µL de las muestras diluidas que incubamos durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, incubamos las muestras con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano durante una hora, lavamos, y añadimos el sustrato de la reacción enzimática colorimétrica para revelar el ensayo y obtener las medidas en un lector de microplatos (Figura 13).
Modificado de Sino Biological
Figura 13. Técnica de ELISA Sándwich. La técnica de ELISA permite reconocer un antígeno fijado a una matriz combinando la especificidad de un anticuerpo con la sensibilidad de una reacción enzimática. Ofrece la ventaja de poder realizar cuantificaciones absolutas en microgramos o incluso nanogramos a nivel celular o subcelular.