VOIES DE SYNTHESES POUR LA LIPOPHILISATION DES COMPOSES PHENOLIQUES

- d’évaluer des antioxydants hydrophiles ou lipophiles,

- la mise en œuvre d’antioxydant en quantité faible par rapport à celle du substrat oxydable.

La méthode est basée sur suivi de l’oxydation d’une émulsion d’huile de tung (débarrassée de ses tocophérols) dans du tampon phosphate (pH 7,2) et stabilisée avec du Brij 35, un émulsifiant non ionique. L’huile de Tung est naturellement composée de triglycérides dont l’acide gras majoritaire est l’acide α-éléostéarique (≈ 86%) dont la structure est représentée sur la Figure 16.

Figure 16 : Structure chimique de l’acide α-éléostéarique

Cet acide gras à 18 atomes de carbone possède un triène conjugué extrêmement sensible à l’oxydation qui absorbe fortement dans l’UV sous forme d’un signal trifide avec une longueur d’onde maximale de 273 nm. L’oxydation est accélérée par l’AAPH [2,2’-azobis (2-amidinopropane) dihydrochlorydrique] un azo-initiateur radicalaire hydrophile solubilisé dans la phase aqueuse. Le suivi spectrophotométrique de l’oxydation au travers de la mesure de la décroissance de l’absorbance à 273 nm, en présence et absence d’antioxydant, conduit à une détermination directe de la capacité d’une molécule à protéger cette huile de l’oxydation.

6.2. VOIES DE SYNTHESES POUR LA LIPOPHILISATION DES COMPOSES PHENOLIQUES

Comme évoqué en section 2.4.2., la lipophilisation des acides phénoliques est une stratégie qui a été envisagée pour moduler leur balance hydrophile/hydrophobe et améliorer leur capacité antioxydante dans des milieux multiphasiques. Généralement, cette modification consiste à associer de façon covalente des groupements lipidiques via différents types de réactions (éthérification, estérification, amidation) et d’approches catalytiques (homogène vs hétérogène, chimique vs enzymatiques) en fonction de la structure et de la réactivité des substrats de départ (Figueroa-Espinoza et al., 2013; Figueroa-Espinoza and Villeneuve, 2005). Les produits issus des réactions de lipophilisation des composés phénoliques sont classiquement nommés « phénolipides ».

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A ce jour, la majorité des réactions de lipophilisation des acides phénoliques a été réalisée par voies chimique, enzymatique ou chimio-enzymatique, au travers de réactions d’estérification de la fonction acide (-COOH) ou de la fonction phénol (-OH), avec respectivement des alcools gras ou des acides gras aliphatiques de longueur variable. Néanmoins, l’estérification de la fonction acide reste la voie de synthèse privilégiée car elle permet de préserver les hydroxyles phénoliques responsables de l’activité antioxydante. Nous y avons donc consacré les chapitres qui suivent.

6.2.1. Voie chimique

Un exemple de voie synthèse de phénolipides par voie chimique est l’estérification de Fisher, qui permet l’estérification des acides phénoliques avec une grande chimio-sélectivité. Quelques exemples trouvés dans la littérature sont présentés dans le Tableau 8.

Acide phénolique

Alcool aliphatique

(nb de carbone) ^{Solvant Catalyseur T (°C) Temps Rendement Réf.}

Sinapique 1 à 4 ^Milieu

fondu ^{H2SO4 t.a. 5 jours 79-83%}

Gaspar et al. (2010) Sinapique, Caféique, férulique 8 ^Milieu fondu ^{H2SO4 100 2-3 h 67-93%} Szydłowska-Czerniak et al. (2018) Protocatéchique 1 à 18 THF H2SO4 45-65 ^5-10 jours ^59-94% Grajeda-Iglesias et al. (2016) Rosmarinique 1 à 20 ^Milieu fondu Résine Amberlite® IR-120H 55-70 ^4-21 jours ^82-99% Lecomte et al. (2010) p-coumarique, caféique et férulique 1 à 20 THF H2SO4 55 -- >90% ^{Sørensen et} al. (2014)

Tableau 8 : Quelques exemples de synthèse de phénolipides (esters aliphatiques d’acides phénoliques) par réaction de Fisher. (t.a. : température ambiante).

Cette réaction s’effectue par catalyse acide en phase homogène (acides forts de type chlorhydrique, sulfurique ou para-toluène sulfonique) ou en phase hétérogène (résines sulfoniques), en présence de tamis moléculaire pour absorber l’eau générée pendant la réaction et éviter la réaction inverse d’hydrolyse de l’ester formé. Pour améliorer la conversion de l’acide phénolique en son ester correspondant, l’alcool gras peut être utilisé en large excès et jouer ainsi le rôle de réactif et de solvant. Ce type de réaction en milieu « fondu » est simple, rapide et permet d’accélérer la réaction d’estérification.

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Cependant, elle est fortement dépendante de la température de fusion de l’alcool gras et de la solubilité de l’acide phénolique dans l’alcool fondu. Pour augmenter la solubilité des différents réactifs, un solvant peut être ajouté dans le milieu réactionnel. Cependant, l’ajout de solvant diminue la réactivité des acides phénoliques entrainant des temps de réactions plus élevés. Par ailleurs, malgré tous les avantages de cette voie de synthèse, ces conditions dures de réaction peuvent conduire à la formation de produits secondaires indésirables et à plusieurs étapes de purification pour éliminer les différents coproduits de la réaction (Pion et al., 2013). De plus, les phénolipides synthétisés peuvent avoir des polarités très similaires aux alcools gras initiaux ce qui peux entrainer des difficultés de purification.

Une autre voie de synthèse de phénolipides est la réaction de Mitsunobu, qui permet la formation chimio sélective d’esters mais aussi d’éthers, d’azides et de nitriles avec inversion de configuration. Il s’agit d’une réaction de substitution nucléophile bimoléculaire (SN2) sur un alcool (primaire ou secondaire), catalysée par une phosphine, telle que la triphénylphosphine (TPP), et un dérivé azo comme l'azodicarboxylate de diéthyle (DEAD). Le mécanisme réactionnel de la réaction de Mitsunobu peut être observé sur la Figure 17.

Figure 17: Mécanisme de la réaction de Mitsunobu appliquée à la synthèse de phénolipides. Ici, la fonction acide carboxylique de l’acide phénolique joue le rôle de l’espèce nucléophile tandis que les groupements hydroxyles du cycle aromatique restent inertes (Appendino et al., 2003). En

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effet, lorsque les réactifs sont introduits dans des conditions stœchiométriques, les aza-énolates stabilisés (bases faibles) assurent la déprotonation de la fonction carboxylique (pKa ≈ 4) et non celle des phénols (pKa ≈ 10).

Il est à noter que cette voie de synthèse a été utilisée dans plusieurs travaux de synthèse de phénolipides (Appendino et al., 2003; Durand et al., 2015; Reddy et al., 2012).

6.2.2. Voie enzymatique

Les réactions par voie enzymatique attirent de plus en plus l’attention. En effet, elles sont plus sélectives et considérées comme des procédés plus respectueux pour l’environnement en raison des conditions de réaction plus douces (températures plus faibles, sans catalyseurs chimiques, etc.) qui engendrent moins d'étapes de purification et qui produisent moins de déchets (Figueroa-Espinoza and Villeneuve, 2005; Laguerre et al., 2013; López Giraldo et al., 2007). Cependant, à ce type de procédé sont associés des durées de réactions beaucoup plus longues, des coûts de catalyseurs élevés et des phénomènes d’inhibition/désactivation des enzymes liés aux conditions réactionnelles (nature des substrats, produits, solvants, pH, etc.).

Les enzymes qui permettent de réaliser ce type de réactions appartiennent à la famille des esters carboxyliques hydrolases comme par exemple les lipases, cutinases et féruloyl estérases. Les lipases, telles que la lipase B de Candida antarctica, ont largement été utilisées pour la synthèse de phénolipides (Sabally et al., 2006, 2005; Zago et al., 2015a). Quelques exemples trouvés dans la littérature sont exposés dans le Tableau 9. Immobilisées sur un support, ces enzymes sont tolérantes à une grande variété de solvants organiques (acétone, butanol, cyclohexane, diéthyle éther, etc.) et peuvent également être utilisées en milieu fondu (l’alcool joue le rôle de réactif et de solvant).

Par contre, ces enzymes sont très sélectives et leur site actif ne reconnait pas certains acides phénoliques. Par exemple, la plupart des lipases ont une activité très faible lorsque la fonction acide carboxylique de l’acide phénolique (relié directement au cycle aromatique ou par une double liaison) est conjuguée avec un groupement hydroxyle –OH en position para- du cycle aromatique. Par exemple, Grajeda-Iglesias et al. (2016) ont essayé de réaliser la synthèse d’esters

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de l’acide protocatéchique par voie enzymatique en présence de la lipase B de Candida antarctica mais ils n’ont pas observé la formation des différents esters du fait que l’acide protocatéchuique possède une fonction hydroxyle en position –para. Par ailleurs, la présence de la double liaison en position β des acides hydroxycinnamiques diminue également l’efficacité des lipases (Pion et al., 2013; Sabally et al., 2005).

Acide phénolique Alcool gras Solvant Enzyme T (°C) Temps Rendement Référence

Dihydrocaféique C18:3 Hexane/2-butanone 75:25 (v/v) Novozym 435® ⁵⁵ 10 jours ^99% Sabally et al. (2005) Férulique C18:3 Hexane/2-butanone 75:25 (v/v) Novozym 435 ® ⁵⁵ 10 jours ^16% Sabally et al. (2005) Dihydrocaféique ^{Trilinoléine,} Trilinolénine Hexane/2-butanone 75:25 (v/v) Novozym 435 ® ^{5 jours 62-66%} Sabally et al. (2006) Caféique

n-butanol n-butanol ^Novozym 435 ® ⁶⁰ 15 jours 0% Figueroa-Espinoza and Villeneuve (2005) Cinnamique 97% Dihydrocaféique 78% Férulique Traces

Tableau 9 : Quelques exemples de synthèse de phénolipides (esters d’acides phénoliques) par voie enzymatique. Note : Novozym 435® est le nom commercial de la lipase B de Candida antartica immobilisée, distribuée par la société Novozymes.

6.2.3. Voie chimio-enzymatique

Une stratégie intermédiaire est la synthèse par voie chimio-enzymatique en milieu fondu, qui est réalisée en deux temps. D’abord, l’acide phénolique de départ est converti par voie chimique en son ester méthylique (ou éthylique, vinylique) correspondant. L’ester formé est alors transestérifié en présence d’une enzyme et de l’alcool gras. Cette technique permet d’améliorer la solubilité des différents substrats dans le milieu réactionnel du fait que le méthyl ester phénolique est plus soluble dans les alcools gras que l’acide phénolique de départ. De plus, le méthanol (ou l’éthanol, ou l’alcool vinylique) libéré pendant la réaction de transestérification peut facilement être éliminé par évaporation, dirigeant ainsi la réaction vers la formation de l’ester désiré.

Cette technique a largement été utilisé pour la synthèse de différentes séries de phénolipides (López Giraldo et al., 2007; Pion et al., 2014, 2013; Reano et al., 2015).

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Par exemple, López Giraldo et al., (2007) ont comparé la lipohilisation enzymatique et chimio-enzymatique de l’acide chlorogénique et de son ester méthylique en présence de Candida antarctica B immobilisée (Novozym 435®). Dans un premier temps, la formation de l’ester méthylique de l’acide chlorogénique a été réalisée avec 10 mmol d’acide chlorogénique en présence de 240 mL de méthanol à 55°C et de 10 g de résine sulfonique Amberlite IR 120 H. En fin de synthèse, les auteurs ont déterminé un rendement de 95% après purification. Ensuite, 56 µmol d’acide chlorogénique ou de son méthyl ester ont été mis en présence de 10 mL de différents alcools aliphatiques de longueur de chaîne alkyle allant de C4:0 à C16:0 à 55°C et sous agitation. Puis, trois concentrations d’enzymes ont été testées (2, 5 et 10 %, m/m calculé en fonction de la masse totale de tous les substrats). Les résultats obtenus à la fin de la synthèse peuvent être observé dans la Figure 18.

Figure 18: Effet de la concentration en enzyme sur le rendement de formation des chlorogénates de butyle (□), octyle (), dodécyle () et héxadécyle (○) pendant l’estérification de l’acide chlorogénique (A) et la transestérification du chlorogénate de méthyle (B).

Les résultats ont montré que, quelle que soit la concentration en enzyme, les rendements de formation de tous les chlorogénate d’alkyles étaient plus élevés lorsque la synthèse était réalisée par voir chimio-enzymatique (Figure 18-B) par rapport à la voie enzymatique (Figure 18-A).

Par ailleurs, Ils n’ont pas observé de différence importante dans les rendements de formation des chlorogénate d’alkyles pour les concentrations en enzyme de 5% m/m et 10% m/m et ont donc fixé la concentration optimale en enzyme à 5% m/m.

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esters à base d’acide férulique et de glycérol destinés à la synthèse de nouveaux biopolymères. L’objectif de cette étude était de réaliser des nouveaux composés de type di-esters phénoliques à base de produits issus de la biomasse lignocellulosique (comme l’acide férulique) et de la biomasse oléagineuses (tel le glycérol) ayant de bonnes propriétés antioxydantes.

Ici, le catalyseur utilisé a été la lipase B de Candida antarctica immobilisée (iCAL-B) et ils ont montré la faisabilité de la transestérification sélective du férulate d’éthyle avec les hydroxyles primaires du glycérol (positions sn-1 et sn-3), laissant ainsi la position centrale intacte. Après purification, le rendement de récupération obtenu a été de l’ordre de 93%.

Dans un second temps, l’alcool secondaire libre a été estérifié par réaction de Steglich (estérification chimique) avec différents acides aliphatiques de longueur de chaîne alkyle allant de 10 à 16 atomes de carbone. Finalement, après purification, les rendements ont été de l’ordre de 81-87%

6.3. MISE EN EVIDENCE DE L’EFFET DE SEUIL DE L’HYDROPHOBIE SUR L’ACTIVITE