Hydrolyse enzymatique sur extrait

De même que pour le tournesol, l’hydrolyse enzymatique a également été réalisée sur l’extrait méthanolique sec du tourteau non-industriel de colza. Nous avons reporté sur la Figure 50-A l’évolution au cours du temps des concentrations en sinapine, acide sinapique et DAST dans l’extrait traité avec AnFaeA (39 nkat/g de tourteau, 55°C, pH 5,5).

Premièrement, et de façon inattendue, il peut être constaté (i) une teneur maximale en acide sinapique (32,3 ± 0,4 µmol/g MSD) inférieure à celle obtenue lors de l’hydrolyse du tourteau non-industriel correspondant (41,3 ± 0,3 µmol/g MSD) et (ii) la formation concomitante d’un nouveau composé phénolique (Figure 50-A, barre verte) dont l’apparition peut également être observée sur le chromatogramme (pic numéro 8) de la Figure 49-B. D’une part, ce composé a une longueur d’onde maximale d’absorption de 326 nm, ce qui indique qu’il contient une ou plusieurs unité(s) sinapoyle. D’autre part, son temps de rétention de 22,4 min est compris entre celui du composé 5b (isomère de di-sinapoyl glucopyranoside) à 21,6 min et celui du groupe 6 des tri-sinapoyl gentiobioside (autour de 23 min). Or, il ne peut s’agir d’un isomère de tri-sinapoyl glucopyranoside, puisque sa polarité plus faible que celle des tri-sinapoyl gentiobioside (le gentiobioside est un disaccharide alors que le glucose est un monosaccharide), supposerait un temps de rétention au-delà de 23 min. Par conséquent, il est raisonnable de penser qu’il s’agit davantage d’un isomère de di-sinapoyl glucopyranoside (nous attendons les résultats d’analyses de RMN 1H, RMN 13C, et de masse sur le produit isolé par chromatographie afin d’établir définitivement sa structure). En effet, en tenant compte de la présence significative de glucose et de sinapoyl glucopyranoside dans l’extrait méthanolique sec, le composé néoformé pourrait provenir de la trans-estérification de la sinapine avec les molécules susmentionnées. Il est en revanche peu probable que le composé néoformé provienne de l’estérification de l’acide

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sinapique puisque sa concentration atteint un palier et reste stable au cours du temps. Cette hypothèse est d’autant plus vraisemblable que l’activité acyle transférase de l’enzyme AnFaeA a déjà été mentionnée par ailleurs, notamment dans les travaux de Hatzakis and Smonou (2005), Hüttner et al. (2017) et Vafiadi et al. (2009).

Cependant, les raisons pour lesquelles cette réaction a lieu uniquement lors du traitement enzymatique de l’extrait méthanolique sec restent à élucider, une possibilité étant la meilleure accessibilité de l’enzyme aux différents substrats isolés des matrices cellulaires et solubilisés dans le tampon.

Figure 50 : Hydrolyse de l’extrait méthanolique de tourteau de colza non-industriel avec 39 nkat de AnFaeA /g de tourteau à 55°C (A) et 37°C (B) et pH 5,5. Evolution au cours du temps des teneurs en sinapine ( ), acide sinapique ( ), nouveau composé phénolique ( ) et DAST [avec Enzyme ( ), contrôle ( )]. Les lignes en pointillés représentent les teneurs initiales en sinapine (), acide sinapique () et DAST () dans l’extrait. Les valeurs sont des moyennes ± ET (n=2). Les valeurs suivies des mêmes lettres ne sont pas significativement différentes, p ≥ 0,05.

Deuxièmement, la teneur en DAST au cours de l’hydrolyse s’avère significativement plus élevée dans l’extrait méthanolique traité (59,2 ± 2,3 µmol EAS/g MSD) que dans le tourteau non-industriel (53,1 ± 1,0 µmol EAS/g MDS), mais légèrement inférieure de 8% à la valeur initiale dans le tourteau non-industriel (64,2 ± 1,2 µmol EAS/g MSD). Cette faible perte a pu être attribuée à l’effet de la température puisque la cinétique d’hydrolyse de l’extrait à 37°C a montré que la teneur en DAST était stable au cours du temps (65,6 ± 2,3 µmol/g MSD) et équivalente à celle du

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tourteau initial (Tableau 26 et Figure 50-B ligne pointillé bleu). Ces résultats démontrent donc l’impact négatif d’une température de 55°C sur la préservation des composés phénoliques lors de l’hydrolyse de l’extrait.

Troisièmement, d’un point de vue cinétique, la sinapine est hydrolysée plus lentement à 37°C qu’à 55°C. Sa conversion est complète après 120 min d’incubation à 55°C, alors que 3% de sinapine sont encore présents dans le milieu après 240 min à 37°C. Par ailleurs, la formation d’acide sinapique est plus lente à 37°C, avec une concentration maximale atteinte au bout de 60 min, contre 30 min à à 55°C. Enfin, on pourra noter qu’en fin de traitement (240 min) la teneur en composé néoformé (présumé isomère de di-sinapoyl glucopyranoside) est significativement plus importante à 37°C (8,0 ± 0,8 µmol EAS/g MSD) qu’à 55°C (5,7 ± 0,3 µmol EAS/g MSD), ce qui pourrait indiquer que l’activité acyle transférase est favorisée à basse température au détriment de l’activité d’hydrolyse.

Finalement, les rendements d’hydrolyse (ou rendement en acide sinapique) ont été calculés pour chaque expérience et reportés dans le Tableau 28. Comme pour le tournesol (voir section 3.3.2), nous avons déterminé un « rendement global » à partir des teneurs initiales en DAST avant traitement, et un « rendement spécifique » d’hydrolyse à partir des teneurs en DAST après pré-incubation et avant ajout de l’enzyme (t=0).

Dans le cas des tourteaux, le rendement global d’hydrolyse du tourteau industriel (71%) est supérieur à celui du tourteau non-industriel (64%) alors que les rendements spécifiques sont respectivement de 69% et 78%. Les différences au niveau des rendements globaux s’expliquent par l’absence de dégradation des composés phénoliques dans le tourteau industriel lors de l’étape de pré-incubation (teneur en DAST stable), alors que l’inverse se produit dans le cas du tourteau non-industriel. En revanche, la raison pour laquelle les rendements globaux et spécifiques sont du même ordre de grandeur dans le cas du tourteau industriel reste à déterminer. Enfin, on pourra remarquer des rendements d’hydrolyse (spécifiques ou globaux), nettement plus faibles pour les extraits méthanolique secs en raison des réactions de transestérification évoquées plus haut.

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Pour conclure, les résultats exposés dans cette partie montrent que l’hydrolyse enzymatique appliquée au tourteau non-industriel de colza permet la plus importante production d’acide sinapique, malgré une perte conséquente en DAST lors de l’étape de pré-incubation. A l’inverse, si les pertes en DAST sont moins importantes lors du traitement de l’extrait, l’existence de réactions secondaires de transfert d’acyle limitent considérablement les teneurs finales en acide sinapique.

Tourteaux de colza (hydrolyse à 55°C)

Extrait de tourteau de colza non-industriel

Non-industriel Industriel ^{Hydrolyse à} 55°C

Hydrolyse à 37°C Teneur en DAST à t = 0 (µmol EAS/g MSD) 53,1 ± 1,0c 46,0 ± 0,3d 59,2 ± 2,3b 65,6 ± 2,3a

Teneur initiale en DAST (µmol EACa/g MSD 64.2 ± 1,2a 44,8 ± 0,2g 64.2 ± 1,2a 64.2 ± 1,2a

Acide sinapique libéré après 240 min

d’incubation (µmol/g MSD) ^{41,3 ± 0,3e 31,6 ± 0,1f 32,3 ± 0,4f 30,6 ± 1,2f} Rendement global d’hydrolyse (%) 64,3 70,5 50,3 47,7 Rendement spécifique d’hydrolyse (%) 77,7 68,6 54,6 46,6

Tableau 28 : Concentration en acide sinapique, DAST et rendements d’hydrolyse (%) après hydrolyse enzymatique des tourteaux industriel et non-industriel de colza et de l’extrait méthanolique sec du tourteau non-industriel de colza avec AnFaA à 55°C et 37°C. Les valeurs suivies des mêmes lettres ne sont pas significativement différentes, p ≥ 0,05.