La voie PERK/eIF2α/ATF4 prévient l’apoptose induite par les LDL oxydées Effet du Salubrinal

Introduction

Les travaux rapportés dans les articles précédents montrent que les LDL oxydées induisent un stress du RE soutenu dans le temps et impliqué dans l’apoptose, et mettent également en évidence un effet protecteur de la chaperonne ORP150 induite par les LDL oxydées via le stress du RE. L’induction du stress du RE et de l’UPR sous l’effet des LDL oxydées, comme sous l’effet d’autres inducteurs, correspond à une réponse biphasique, qui dans un premier temps est induite dans un but de protection et d’adaptation au stress, puis qui oriente dans un second temps la cellule vers l’apoptose si l’adaptation échoue 260. Lors de la phase adaptative de l’UPR, une des premières étapes est caractérisée par la diminution ou l’arrêt de la synthèse protéique qui permet d’économiser l’énergie, en particulier dans des conditions d’hypoxie, où la disponibilité en oxygène est plus faible pour la cellule 310. La synthèse protéique est contrôlée par la régulation de facteurs d’initiation de la traduction des protéines, en particulier la famille des multiples facteurs eukaryotiques d’initiation protéique (eIFs) 311.

La famille eIF pour ‘eucaryotic Initiation Factor’ est représentée par plusieurs membres : eIF1, eIF2, eIF3, eIF4, eIF5 et leurs différents sous-types. Ces facteurs sont impliqués dans les différentes étapes de l’initiation de la traduction en permettant l’association de l’ARN de transfert avec la sous-unité 40S du ribosome, puis l’ancrage de la sous-unité 60S et l’initiation de la traduction. eIF2 catalyse précisément l’étape d’ancrage de l’ARN de transfert sur la sous-unité 40S du ribosome. Il s’agit d’un hétérotrimère composé de trois sous-unités α, β et γ, et associé au GDP à l’état basal. L’intervention du facteur eIF2B catalyse l’échange du GDP contre un GTP au niveau de la sous-unité α d’eIF2, et permet le recrutement de l’ARN de transfert. Or cette sous-unité est la cible de nombreuses kinases susceptibles de la phosphoryler en position sérine 51 ,et par conséquent de bloquer l’échange GDP/GTP puis l’initiation de la traduction (cf. : Chapitre Stress du RE p75). La phosphorylation de la sous-unité α d’eIF2 se produit sous l’influence de divers stress et actuellement au moins 4 kinases possèdent cette propriété : PKR, PERK, GCN2 et HRI. HRI (Heme-Regulated Inhibitor) est une kinase activée par la déprivation en hème dans les réticulocytes. GCN2 (General Control of Nitrogen metabolism) est activée lors d’une déplétion en acides aminés. PKR (Protein Kinase RNA-dependant) est activée par les ARN doubles brin (dsRNA), mais également par l’IFN, les cytokines (TNFα) et par des stress

divers tels que la déprivation en sérum. PERK (PKR-like ER Kinase) serait la forme de PKR présente dans le reticulum endoplasmique.

PERK est une protéine transmembranaire du RE, qui en conditions basales, est fixée à la chaperonne BiP côté lumière du RE (comme ATF6 et Ire-1). Au cours d’un stress du RE, BiP relargue PERK qui se dimérise et s’active par autophosphorylation 257. L’activation de PERK induit directement la phosphorylation d’eIF2α et l’inhibition de la traduction 312. Cette réponse immédiate au stress permet de réduire la charge protéique dans le RE 310. Cependant, d’autres protéines impliquées dans la protection du RE et plus généralement dans la survie cellulaire, voient leur traduction activée lors de la phosphorylation d’eIF2α 311. C’est le cas pour le facteur de transcription ATF4, dont une partie des réponses de survie associées à l’activation de PERK et la phosphorylation d’eIF2α est directement dépendante

310_{. ATF4 est un membre de la famille CREB (cAMP Responsive Element Binding protein}

family) et sa traduction est rendue possible grâce à la présence d’une phase ouverte de lecture à l’extrémité 5’ du messager qui permet l’association des sous-unités du ribosome en aval de cette séquence 221. ATF4 permet d’adapter le métabolisme de la cellule et le statut redox du RE lorsque l’UPR est initié. En effet, les gènes présentant des sites de fixations pour ATF4 sont impliqués dans la restauration des fonctions du RE en réponse aux stress impliquant la déprivation en sérum, en acides aminés, ou l’hypoxie 313314.

Le salubrinal est une petite molécule qui prévient l’apoptose dépendante du stress du RE. Cet agent a été découvert lors du screening de plus de 19000 molécules testées sur l’apoptose de cellules tumorales PC12, provoquée par des agents inducteurs du stress du RE (tunicamycine) 315. L’effet antiapoptotique du salubrinal est associé à une phosphorylation basale d’eIF2α et à l’activation d’ATF4, donc à l’activation de voies de survie. Le mécanisme impliqué dans la phosphorylation d’eIF2α par le salubrinal pourrait impliquer l’inhibition d’un complexe phosphatase PP1/GADD34. PPI (Protein Phosphatase 1) est une protéine phosphatase associée à GADD34 (Growth Arrest and DNA Damage induced protein), un co-facteur protéique non enzymatique induit par le stress du RE. PPI/GADD34 déphosphoryle eIF2α et permet de lever l’inhibition de la synthèse des protéines 316. Cependant ce mécanisme n’est pas encore clairement identifié.

Figure 27 : Structure chimique du Salubrinal.

Dans nos précédents travaux, nous avons montré que le stress du RE était impliqué dans l’apoptose des CE, en partie suite à l’activation prolongée d’Ire-1α et à la phosphorylation de JNK. L’objectif du travail présenté dans cette dernière partie a été d’étudier l’implication de la voie PERK/eIF2α/ATF4 dans la survie ou l’apoptose induites par les LDL oxydées, et d’évaluer l’effet antiapoptotique du salubrinal.

Résultats

La phosphorylation d’eIF2α induite par les LDL oxydées dépend de PERK Nous avons précédemment montré que les LDL oxydées induisaient l’apoptose des CE HMEC-1 via une dérégulation du calcium cytosolique et l’induction d’un stress du RE prolongé et caractérisé par la phosphorylation des senseurs de l’UPR, PERK, Ire-1α et ATF6, ainsi que par la phosphorylation d’eIF2α, impliqué dans l’arrêt de la synthèse protéique (Sanson et al, 2008, soumis). Il est probable que dans notre système, la phosphorylation d’eIF2α provienne de PERK, mais nous avons également étudié l’implication potentielle de la PKR dont l’activation est initiée par de nombreux facteurs très diverses 317, et pourrait donc être phosphorylée par les LDL oxydées. L’incubation des HMEC-1 avec des concentrations apoptotiques de LDL oxydées (200 µg/ml), induit la phosphorylation rapide et prolongée de PERK, PKR et eIF2α (Fig.1 A-C). Nous avons ensuite étudié l'implication de PERK ou de PKR dans la phosphorylation d’eIF2α sur la serine51 induite par les LDL oxydées. Les cellules ont été transfectées de façon transitoire avec des siRNA spécifiques de PERK ou de façon stable avec un plasmide codant pour un siRNA de PKR 318. L’extinction de PERK supprime la phosphorylation d’eIF2α (Fig.1D), alors que les cellules n’exprimant plus la protéine PKR ne montrent pas de modifications de la phosphorylation d’eIF2 par les LDL oxydées (Fig.1E). Ces résultats indiquent que la phosphorylation d’eIF2α induite par les LDL oxydées dans les HMEC-1 est médiée par PERK.

La phosphorylation d’eIF2α induite par PERK protége de l’apoptose

La phosphorylation d’eIF2α induite par PERK résulte en l’atténuation ou l’inhibition de la synthèse générale des protéines, alors que la traduction de certaines protéines de survie est favorisée en réponse au stress du RE, en particulier la traduction du facteur de transcription ATF4 319. Nous avons étudié l’implication de la voie PERK/eIF2α dans la survie ou l’apoptose induite par les LDL oxydées. Les résultats de la figure 2 montrent que la suppression de PERK par siRNA sensibilise de façon significative les cellules HMEC-1 à l’apoptose induite par les LDL oxydées (Fig.2A,C). A l’inverse, la suppression de la PKR a un effet largement protecteur (Fig.2B,D), ce qui indique que i/ PERK et eIF2α phosphorylé sont impliqués dans la survie, et que ii/ PKR est activée par les LDL oxydées et impliquée dans l’apoptose, mais ne participe pas à la phosphorylation d’eIF2α. Nous avons par ailleurs étudié l’expression et le rôle d’ATF4 qui est induit dans les HMEC-1 stimulées par les LDL oxydées (Fig.2E). Comme observé précédemment avec PERK, la suppression de l’expression d’ATF4 par siRNA (Fig.2F), sensibilise les cellules à l’effet toxique des LDL

oxydées (Fig.2G), ce qui confirme le rôle majeur de la voie PERK/eIF2α/ATF4 dans la protection antiapoptotique.

Le Salubrinal protège contre l’apoptose via la phosphorylation d’eIF2α

Le Salubrinal (SAL) est un modulateur du stress du RE, qui inhibe le complexe phosphatase PP1/GADD34 impliqué dans la déphosphorylation d’eIF2α 315. Nous avons étudié l’effet du salubrinal sur la mort cellulaire induite par les LDL oxydées. Comme observé dans la figure 3, le SAL protège de l’apoptose de façon dose-dépendante. 50 µM est la concentration la plus efficace, mais un effet toxique étant observé pour cette dose, nous avons utilisé la concentration de 10µM (Fig.3A). Le marquage en Syto13/IP illustre l’effet inhibiteur du salubrinal sur l’apoptose des CE induite par les LDL oxydées (Fig.3B). De même, le SAL inhibe l’apoptose induite par la tunicamycine, un inducteur d’apoptose dépendante du stress du RE, mais n’a pas d’effet sur la mort cellulaire induite par le taxol qui agit sur le cytosquelette (Fig. 3C). La SAL prévient l’apoptose en inhibant la dérégulation calcique (Fig. 3F) de même que la signalisation calcium-dépendante impliquée dans l’apoptose, telle que les calpaïnes et l’activation de DVDase (Fig.3D,E). Par ailleurs, le SAL induit la phosphorylation d’eIF2α (Fig. 4A) ainsi que l’expression (Fig.4B) et la translocation nucléaire d’ATF4 (Fig.4C) qui est initiée en présence de LDL oxydées. Enfin, le salubrinal ne présente plus d’effet protecteur contre l’apoptose induite par les LDL oxydées lorsque l’expression de PERK est éteinte par siRNA. (Fig.4D) Ces résultats indiquent que le SAL protège de l’apoptose via la voie de survie PERK/eIF2α/ATF4, en accord avec les travaux précédents de Boyce et al 315.