Visite en hôpital du Jour 3 HDJ Seuls les patients répondeurs ont été convoqués pour une

demi-journée à l’HDJ au cours de laquelle ont été réalisés :

- le test fonctionnel au midazolam mesurant l’activité du CYP3A4 (phénotypage du CYP3A4) - le dosage plasmatique de (R)- et (S)-méthadone ainsi que le recueil de l’heure de prise et le schéma d’administration

- le prélèvement sanguin pour les sérologies virales (VIH, VHC et VHB) - le prélèvement sanguin pour les analyses génétiques

- une recherche urinaire de drogues illicites.

Le diagramme suivant résume les effectifs des patients relatifs à chaque analyse.

2

Figure 17: Diagramme des inclusions de l’étude METHADOSE.

Abréviations : HDJ : Hopital du jour ; midaz : patients ayant entrepris le test au midazolam oral ; micro- array : patients pour lesquels une analyse génétique par puces a été réalisée.

Au total, ont été inclus dans l’étude:

 81 patients répondeurs (qui ont poursuivi leur étude en HDJ avec entre autres, test au midazolam oral, prises de sang pour dosage des concentrations résiduelles de méthadone et analyse génétique)

 30 patients non répondeurs (pour lesquels seuls les prélèvements génétiques ont été réalisés).

1

Pour l’analyse génétique, seuls les patients caucasiens ont été retenus pour éviter les biais dus aux différences inter-ethniques (73 patients répondeurs et 25 non répondeurs : total de 98 caucasiens).

2

Au total, 68 patients répondeurs ont subi le test au midazolam oral (63 caucasiens et 5 non caucasiens).

3

Treize patients répondeurs n’ont pas réalisé l’épreuve de midazolam oral soit parce que: - ils ne se sont pas présentés à leur rendez vous à plusieurs reprises en HDJ

- ils présentent une contre-indication à l’administration de midazolam (insuffisance respiratoire)

- ils présentent un très mauvais état veineux : prélèvement sanguin impossible.

4

Parmi les 63 patients répondeurs caucasiens, seuls 59 ont été inclus dans l’analyse de corrélation entre les facteurs génétiques et les concentrations résiduelles de méthadone. Quatre patients, prenant la méthadone de façon fractionnée, et la mesure de la concentration de méthadone sur le prélèvement réalisé à l’HDJ ne correspondant pas à la concentration résiduelle, ont été exclus de l’analyse.

b- Prélèvements d’ADN

Les prélèvements pour extraction d'ADN ont été réalisés par ponction veineuse au pli du coude. L’ADN génomique a été extrait des leucocytes du sang total (Extracteur Maxwell 16

et kits Promega) suivant les recommandations du fabriquant. La concentration d’ADN a été mesurée par spectrophotométrie à 260 nm (NanoDrop ND1000, Wilmington, Etats-Unis). La qualité de l’ADN a été évaluée par le rapport 260/280 correspondant au rapport ADN/impuretés. Il devait être compris entre 1,8 et 2.

La réalisation du projet s’est heurtée à la difficulté d’obtention d’échantillons sanguins chez certains patients, en raison notamment d’un capital veineux altéré. De plus, le recrutement des patients se faisant au niveau de nombreux sites parisiens, il était souhaitable de mettre au point une technique de prélèvement facilement praticable par le clinicien. Une étude de collecte des cellules buccales afin d’extraire l’ADN chez les patients toxicomanes a donc été entreprise. Il était nécessaire d’évaluer préalablement ce mode de prélèvement chez les toxicomanes qui présentent souvent une sécheresse buccale (xérostomie) ainsi que des lésions au niveau de la muqueuse dues au traitement par la méthadone, au manque d’hygiène bucco-dentaire, à la malnutrition et aux infections associées.

La technique que nous avons testé (Papiers FTA, Whatman International®) constitue une alternative efficace au prélèvement sanguin chez ces patients puisque la quantité et la qualité d’ADN obtenues étaient satisfaisantes, et 100% des échantillons ont pu être génotypés par différentes techniques de génotypages (PCR suivie de dHPLC, PCR en temps réel, ou séquençage). De plus, les patients et les cliniciens ont apprécié la simplicité et le caractère peu invasif du prélèvement (Hajj et al. 2010, Annexe 4).

c- Génotypages i. PCR en temps réel

Les génotypages par PCR en temps réel sur l’ADN génomique ont été réalisés à l’aide des kits de génotypage TaqMan® SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems, Foster City, Etats- Unis) suivant les recommandations du fabriquant. Le Tableau 22 détaille les SNPs étudiés. Les génotypages ont été réalisés sur un instrument StepOne plus (Applied biosystems).

a- Protocole opératoire

Brièvement, 5 µL de mélange réactionnel (Genotyping Master Mix) sont ajoutés à 0,25 μL du mélange amorces et sondes du SNP étudié (Genotyping assay 40 X) et d’eau distillée (qsp 10

μL). Neuf µL de ce mélange réactionnel est déposé dans chaque puit d’une microplaque. Une dilution de l’ADN est réalisée en fonction de sa concentration de départ afin d’obtenir une concentration finale de 10 ng/µL (10 ng). 1 µL de cette solution finale est déposé dans chaque puit selon le plan définit au préalable (Logiciel StepOne 2.0). Les plaques sont scellées, centrifugées puis déposées sur un Step One plus (Applied Bisoytems) pour permettre la réaction de PCR en temps réel.

b- Lecture et interprétation des résultats

Les résultats sont analysés à l’aide du logiciel StepOne qui permet de les visualiser (par intégration du signal de fluorescence des différents fluorochromes associés aux sondes) sous forme de trois nuages de points

correspondant aux trois génotypes (Figure 18).

Figure 18: Représentation graphique des résultats de génotypage du SNP c.3435C>T d’ABCB1 après analyse par le logiciel StepOne

Les points bleus correspondent aux homozygotes CC, les points verts aux hétérozygotes CT et les points rouges correspondent aux homozygotes TT.

Tableau 22: Liste des SNPs étudiés par PCR en temps réel dans le cadre de ce projet

Rs Gène SNP

Conséquence

fonctionnelle Localisation

PK rs1045642 ABCB1 c.3435C>T Synonyme Exon 26

PD rs1799971 OPRM1 c.118A>G p.Asn40Asp Exon 1

Casc ad e Dopamin er giq u e _{rs1611115 DBH g.4031T>C} Transcription Modifiée* Promoteur rs1800497 DRD2 (TaqI A)

g.17316G(C)>A(T) p.Glu713Lys Exon 8

rs6277 DRD2 c.957C>T Synonyme Exon 7

ii. Détermination du nombre de copies de gène

Nous avons mis au point la méthode de détermination du nombre de copie des gènes CYP3A4 et CYP2D6 par PCR en temps réel sur l’ADN génomique, en utilisant un kit Applied Biosystems, avec une normalisation par le gène de la RNAse P.

a- Principe

La quantification était fondée sur la méthode des CT comparatifs, qui comprend deux étapes :

1- Etape de quantification absolue par rapport à une droite d’étalonnage (préparation de la multiplex en rajoutant du Master Mix -gene copy number- des amorces et des sondes CYP2D6 ou CYP3A4 (marquées par le fluorochrome FAM) et des amorces et sondes RNAseP (marquées par le fluorochrome VIC) et de cinq concentrations (0,625 -1,25 - 2,5 -5 -10 ng/µl) d’ADN passées en triplet). La droite de régression obtenue est optimisée en fonction d’un certain nombre de critères de qualité :

 CT sd (Standart Deviation) <0,2

 20 <CT< 30: PCR efficace

 3,7 <Pente< 3,6: efficacité à 90-110%  E (RNAse P) – E(CYP2D6) <10%  Sachant que E= 10 (1/-pente) _–1

 R2

>0,98 (coefficient de la droite de régression)

2- Etape de quantification relative (en présence de contrôles négatifs et d’ADN contrôles – nombre de copies égal à 2) et comparaison des ∆CT. Le nombre de copies (A) du gène

d’intérêt (en l’occurrence CYP2D6 ou CYP3A4) étant déterminé par la formule suivante :

A=2

b- Protocole opératoire

Brièvement, 12,5 µL de mélange réactionnel (Master Mix) sont ajoutés à 1,25 µL du mélange amorces et sondes CYP2D6 ou CYP3A4, 1,25 µL du mélange amorces et sondes RNAse P et 5 µL d’eau distillée. 20 µL de ce mélange réactionnel sont déposés dans chaque puit. Une dilution de l’ADN est réalisée en fonction de sa concentration de départ afin d’obtenir une concentration finale de 2,5 ng/µL (12,5 ng). 5 µL de cette solution finale sont ensuite déposés dans chaque puit. La détermination des CT pour chaque patient et ceux de la droite

d’étalonnage pour les points à 12,5 ng permettent de déterminer le nombre de copies du gène d’intérêt.

iii. Génotypage par micro-arrays

Certains génotypages ont été réalisés à l’aide des puces à ADN (ou microarrays, Illumina), obtenues dans le cadre d’un projet INSERM collaboratif multi-équipes coordonné par l’UMR S775 (Pr Laurent-Puig; UFR Biomédicales - Paris Descartes), auquel était associée l’unité dans laquelle j’ai effectué ma thèse. Elles ont été utilisées afin de génotyper des patients du projet METHADOSE (répondeurs et non répondeurs) pour environ 18000 variants nucléotidiques (SNPs) de 1395 gènes regroupés en cinq catégories en fonction des grandes classes fonctionnelles d’intérêt. Les hybridations ont été réalisées par la société Integragen (Evry, France) sur la base des ADN fournis selon des concentrations et un format précis. Les résultats des génotypages nous ont été transmis sous forme de deux fichiers contenant environ 1 500 000 génotypes. Le premier fichier (« MAP ») contenait la liste des SNP étudiés (identifiés par leur dénomination de référence ou « rs ») et le second fichier (« PED ») contenait, pour chaque patient étudié, l’ensemble des génotypes pour les 18000 SNP, les allèles étant par convention notés 1 ou 2.

Ces fichiers ont été analysés à l’aide d’un logiciel « maison » dédié (PharCra, Cyril Bourdaillet, UMR S775) qui permet d’extraire les données gène par gène.

Pour chaque SNP retenu dans l’étude, les allèles associés aux chiffres 1 et 2 ont été identifiés grâce au fichier MAP et l’allèle dominant grâce à la référence du SNP par consultation de la banque de données.

Tableau 23 : SNPs du CYP3A4, CYP3A5 et POR génotypes par microarrays.

CYP3A4 CYP3A5 POR

1 rs2404955 rs41279854 rs12537282 2 rs12333983 rs28365083 rs1966363 3 rs4986913 rs10264272 rs239953 4 rs4986910 rs4646450 rs4728533 5 rs1041988 rs41279857 rs6949454 6 rs45614732 rs776746 rs7804806 7 rs2242480 rs28383468 rs7796654 8 rs28371759 rs10954724 9 rs3208363 rs4732513 10 rs4646437 rs10954732 11 rs2246709 rs4732516 12 rs4987161 rs1057870 13 rs12721627 14 rs4986908 15 rs4986907 16 rs3091339 17 rs12721634 18 rs2740574

Les résultats ont été ensuite inclus dans un tableau excel (Numéros d’anonymat des patients, SNPs recherchés et génotypes correspondants).

Parmi les gènes étudiés par cette approche, nous avons choisi d’exploiter 18 SNPs du CYP3A4, 7 de CYP3A5 et 12 de POR (tableau 23). D’autres gènes ont également été explorés dans l’exploration pharmacogénétique des effets secondaires cardiaque de la méthadone (cf. II.4- Evaluation des facteurs génétiques impliqués dans les effets secondaires cardiaques de la méthadone).

d- Test au midazolam oral

Les patients répondeurs et ne présentant pas de contre indications (n=68, figure 17) ont reçu 2 mg de midazolam oral4. Des prélèvements sanguins ont été réalisés à 30 min et 4 h. Le dosage du midazolam (CAS Number : 59467-70-8, Sigma, France) et de ses métabolites 1- et 4-OH midazolam (CAS Number : 59468-90-5 et 59468-85-8 respectivement, Sigma, France) a été réalisé par LC-MS (Thermo Fisher, Allemagne)5. Les ratios 1+4OH midazolam/midazolam

4

(RM) ont été calculés à 30 min et 4 h. Les limites de quantification étaient de 3,13 ng/mL pour le midazolam, 0,31 ng/mL pour le 1-OH midazolam et 0,16 ng/mL pour le 4-OH midazolam.

e- Dosage de la méthadone

La concentration plasmatique résiduelle de méthadone a été obtenue chez 59 patients répondeurs (figure 17) ; la méthadone a été dosée par LC-MS (Chromatographie liquide- spectrophotométrie de masse -TSQ Quantum Ultra, Fisher-)6. La séparation des énantiomères (R)-et (S)- de la méthadone a été réalisée sur le même appareil en utilisant une phase stationnaire chirale Chiralcel® JO-RH (150 mm x 2,1 mm, 5 µm) avec une colonne de garde (10 mm x 4,6 mm, 5 µm) (Daicel Chemical Industries, Tokyo, Japon).

f- Analyse statistique

Les tests non paramétriques de KW et de MW ont été utilisés pour les comparaisons entre sous-groupes en utilisant le logiciel StatEl (version 2.5). Les différences statistiques entre les différentes fréquences génotypiques et alléliques ainsi que les écarts à la loi de Hardy- Weinberg ont été déterminés par le test du χ2

ou le test exact de Fisher. Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. La correction de Holm a été appliquée pour les comparaisons multiples, les valeurs de p avec et sans correction ont été présentées lorsque cela était informatif.

Les modèles de régression linéaire univariée et multivariée ont été réalisés sur le logiciel R- software (version 2.11.1).

Les données cliniques et biologiques (doses maximales et actuelles et méthadonémies) sont présentées par la médiane et les valeurs aux 25ème et 75ème percentiles, indiquées entre crochets.

6

II.2.4- RESULTATS

A- CARACTERISTIQUES DES PATIENTS

A ce jour, 111 patients traités par la méthadone ont été inclus dans le protocole. Quatre vingt- un sont répondeurs (équilibrés) et trente patients non répondeurs (figure 17).

Les patients sont majoritairement des hommes, d’origine caucasienne, 59% environ sont séropositifs pour le VHC et 12% pour le VIH. Le tableau 24 rassemble les principales caractéristiques cliniques et démographiques des patients.

Les patients non répondeurs sont significativement plus jeunes (MW, p<0,00001), et ont commencé plus précocement la prise de méthadone (MW, p<0,0014).

Parmi les patients, une majorité présente des antécédents de dépendance au cannabis, et les patients non répondeurs présentent plus fréquemment des antécédents de dépendance à l’alcool.

Tableau 24: Données démographiques et cliniques des patients.

PATIENTS REPONDEURS n=81 (73%) PATIENTS NON REPONDEURS n=30 (27%)

Nombre de patient : Hommes

Femmes 59 (72,8) (1) 22 (27,2) 23 (76,7) 7 (23,3) Age Moyen 44 [23-65] (2) _{36 [23-49]}

Nombre de patients Caucasiens 73 25

Statut sérologique : VIH

VHC 10 (12,3) 48 (59,2) 2 (6,7) 9 (30)

1ère prescription de méthadone (en

années) 35 [18-50] 31 [21-41]

Dose actuelle de méthadone (Médiane :

mg/jour) 55 [7-320] 55 [15-150]

Dose maximale de méthadone (Médiane :

mg/jour) 80 [20-320] 80 [20-160]

Age de 1ère consommation d’opiacés 20 [11-32] 21 [15-33] Antécédents de dépendance : Alcool THC Cocaïne 41/81 (50) 60/81 (73,2) 55/81 (67) 20/30 (66,7) 24/30 (80) 21/30 (70) ECG Allongement intervalle QTc (22%) 414 ms [350-575 ms] 11/64 (17,2) 420 ms [367-512 ms] 7/20 (35) (1) _(%) (2) _{[Valeurs extrêmes]}

Au moment de l’inclusion, la dose médiane de méthadone était de 55 mg/j pour tous les patients alors que la dose médiane maximale était de 80 mg/j. Les doses permettant d’atteindre l’équilibre thérapeutique sont très variables (de 7 à 320 mg/j) au sein de la population des patients répondeurs, les doses actuelles des patients non répondeurs sont moins variables (de 15 à 150 mg/j) (figure 19). Les doses maximales et actuelles ne sont pas statistiquement différentes entre les groupes.

Figure 19: Variabilité des doses de méthadone à l’équilibre thérapeutique chez les patients répondeurs (A) et celle des patients non répondeurs (B) inclus dans notre étude.

B- FREQUENCES ALLELIQUES ET GENOTYPIQUES : ASSOCIATION A