1.1 O BJECTIFS DE L ’ ETUDE ET HYPOTHESE DE TRAVAIL

Il existe une grande variabilité interindividuelle des doses de morphine auto-administrées par le patient pour le contrôle de sa douleur. Nous avons voulu savoir si cette réponse était modulée par des facteurs génétiques en examinant les gènes candidats suivants :

- OPRM1 : des variants nucléotidiques modifiant l’affinité de la morphine pour le récepteur opioïde µ ont été associés dans la littérature à la réponse à la douleur, aux doses requises pour l’antalgie ainsi qu’aux effets secondaires observés sous traitement (Shabalina 2009). Deux approches ont été combinées afin d’explorer ces variants

nucléotidiques: une approche ciblée avec génotypage systématique pour le SNP

c.118A>G d’OPRM1 et une approche plus globale d’étude d’OPRM1 avec criblage de variants nucléotidiques par dHPLC, suivi de séquençage.

- COMT : la COMT en modulant le taux de dopamine central semble également jouer un rôle dans la régulation de la sensibilité à la douleur et dans la détermination des doses antalgiques de morphine (cf. chapitre IV, Facteurs de variabilité de la réponse aux opioïdes). Le polymorphisme p.Val158Met de COMT qui module l’activité de l’enzyme a été étudié

- ABCB1 : la P-gp est une pompe d’efflux limitant le passage intestinal et cérébral de la morphine. Le génotypage systématique du polymorphisme c.3435C>T de ABCB1 a également été conduit en parallèle afin d’explorer la part pharmacocinétique de la variabilité.

I.1.2-P

Il s’agit d’une étude clinique prospective mono-centrique de recueil de variables phénotypiques et génotypiques chez des patients admis pour des chirurgies douloureuses et traités par la morphine pour la douleur en postopératoire.

Tous les patients ont donné leur consentement écrit. Les patients présentant une insuffisance rénale (clairance de la créatinine calculée selon la formule de Cockcroft inférieure à 40 mL/min) et les patients traités par des analgésiques opioïdes, des corticostéroïdes ou des AINS en préopératoire n’ont pas été inclus dans l’étude (pour éviter essentiellement l’effet d’épargne morphinique). Les patients traités par d’autres médicaments n’ont pas été exclus, mais la consommation de benzodiazépines et d’antidépresseurs a été signalée sur la fiche d’inclusion.

Avant l’intervention, des données cliniques ont été recueillies et les prélèvements sanguins ont été réalisés pour analyse génétique. Quarante-quatre patients ont été inclus dans cette première analyse.

L’anxiété a été évaluée au bloc opératoire avant l’opération (suivant une échelle de 0 à 100). Tous les patients ont reçu une anesthésie générale standard, comprenant le N2O, des gaz

halogénés, du fentanyl et des myorelaxants. En salle de réveil, ils ont également reçu de la morphine avant l’extubation (0,05-0,1 mg/kg) ainsi qu’une dose de titration jusqu’à ce que l’EVA soit inférieure ou égale à 3 sur 10. En période postopératoire, les patients ont reçu la morphine par pompe (PCA4) et du paracétamol 1 g par IV toutes les 6 h et un suivi sur 48 h a été réalisé (cf. Annexe 1: protocole de recherche, fiche d’inclusion et fiche de suivi). L’évaluation de la douleur a été réalisée selon l’EVA au repos et au mouvement. La dose administrée était de 2 mg toutes les 8 min si l’EVA était supérieure ou égale à 4. En cas d’inefficacité persistante (EVA supérieure ou égale à 4 sur 10), une dose de 3 mg toutes les 10 min était administrée en deuxième intention.

Différentes échelles ont permis d’évaluer les effets secondaires de la morphine (sédation, nausées et vomissements ; tableau 14). La dépression respiratoire et la bradycardie ont été évaluées suivant le critère qualitatif absence/présence (oui/non : O/N).

Tableau 14: Echelles d’évaluation de la sédation et de l’intensité des nausées sous morphine.

Evaluation de la sédation

0 Réveillé

1 Répond à l’appel

2 Répond à une stimulation tactile

3 Répond à une stimulation douloureuse

4 Ne répond pas

Evaluation de l’intensité des nausées

0 Pas de nausées

1 Nausées légères à modérées

2 Nausées sévères nécessitant la prise d’antiémétiques

4

a- Génotypage (Liban)

L’ADN a été extrait à partir du sang total (leucocytes circulants) recueilli sur EDTA avec le kit QIAamp DNA Mini® Blood (Qiagen) selon les recommandations du fabriquant.

Les génotypages des SNPs c.118A>G d’OPRM1, de p.Val158Met de COMT et de c.3435C>T d’ABCB1 ont été réalisés par PCR en temps réel sur Lightcycler 2.0 (Roche ; Liban). Ces techniques ont été validées durant mon stage de M2 comme mentionné plus haut.

i- Principe

La détermination des génotypes est réalisée par une technique de PCR en temps réel avec hybridation à l’aide de sondes fluorescentes spécifiques (sondes FRET : Fluorescence

Resonance Energy Transfert), suivie d’une analyse des courbes de fusion sur LightCycler.

Elle se déroule en deux temps :

 Amplification de la zone d’intérêt du gène (qui comporte le variant nucléotidique)  Fusion: permettant de détecter la présence ou l’absence du variant nucléotidique par

déshybridation des sondes fluorescentes.

ii- Protocole opératoire

Brièvement, la réaction est réalisée à partir de 25 ng d’ADN (solution à 10ng/μL soit 2,5 μL) dans un volume final de 10 μL (eau pour préparation injectable ou ppi qsp), contenant 1 µL de mélange réactionel (Taq polymerase Fast Start (10x), tampon et dNTP ; Lightcycler Fast Start DNA Master Hybridization Probes® Kit- Roche Diagnosis), 1,2 µL de MgCl2 (10mM), et 0,2

µL de chacunes des amorces (20 mM) et des sondes fluorescentes (20 mM) (TIB® Molbiol) (tableau 15). Les génotypages d’OPRM1 (rs1799971) et ABCB1 (rs1045642) ont été réalisées selon les techniques publiées dans la littérature (Grösch 2001, Nauck 2000). Les amorces utilisées pour le génotypage de p.Val158Met (ou c.472G>A; COMT rs4680) ont été choisies en utilisant le logiciel Primer 3 (http://fokker.wi.mit.edu/primer3/input.htm). La mise au point de la technique est présentée dans l’article suivant (A Hajj, K Peoc’h, F Hajj Moussa, JL Laplanche, L Rabbaa Khabbaz, Rapid detection of p.Val158Met COMT polymorphism

using fluorogenic hybridization probes. Soumis le 9 Février 2012 à Molecular Biology Reports). La liste des amorces est présentée en annexe 2.

iii- Conditions opératoires

Les conditions d’amplification ont été déterminées à partir des protocoles du fabricant, de la séquence des amorces choisies (détermination de la température d’hybridation selon la température de fusion -Tm- théorique). Pour optimiser les résultats de la PCR, différentes températures d’hybridation, différentes courbes de fusion et un nombre variable de cycles ont été testés. L’ensemble de ces conditions est résumé dans le tableau 15.

Tableau 15 : Conditions d’amplification et des courbes de fusion pour le génotypage de OPRM1, ABCB1 et

COMT.