Vieillissement microbiologique

L'intérêt d'une étude microbiologique spécifique sur ces matériaux composites s'est développé du fait de leur sensibilité à l'action des micro-organismes telle que présenté dans l'étude bibliographique (chapitre 1). En effet, si l’on tient compte de l’ensemble des facteurs liés à l’hygrométrie, la température et la présence de nutriment, ceci suppose que ces composites pourraient être sujets à une dégradation d'origine biologique.

Le premier objectif de cette étude est de pouvoir identifier le ou les paramètres favorisant le développement des micro-organismes sur ces composites. La deuxième finalité consiste à déterminer les éventuelles conséquences de ce développement microbien sur les propriétés mécaniques des composites et les caractéristiques chimiques des fibres courtes de lin et des composites.

II.2.1. Conditions de vieillissement microbiologique

Le vieillissement microbiologique a été fait à 30°C et 96%±3 H.R. ce qui correspond à titre d'exemple aux conditions optimales de croissance des moisissures mésophiles (Fu et al., 2001). L'utilisation d'une enceinte climatique CTS-132001 a permis la vérification des réglages de conditions de température et d'humidité relative.

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De plus, des traitements spécifiques ont été réalisés sur les matériaux étudiés. Ainsi, trois conditions de vieillissement ont été étudiées:

(i) En conditions stériles pour découpler les évolutions dues à l'effet des micro-organismes de celles dues aux conditions physico-chimiques (température et humidité).

(ii) En conditions naturelles pour estimer la capacité de développement microbien sur les composites.

(iii) En conditions ensemencées afin d'accélérer la croissance microbienne.

Ces conditions de vieillissement microbiologique sont détaillées dans le Tableau 9, avec la précision des matériaux étudiés, de la nature du traitement subi au préalable ainsi que de la durée du vieillissement.

Tableau 9 - Conditionnement des matériaux pour chaque vieillissement

Condition de vieillissement

Matériaux Nature du traitement Durée du vieillissement

Stériles

Composites. - Nettoyage à l’éthanol

- Radiation UV pendant 30min.

1, 3 et 6 mois. 10 g de

Fibres courtes de lin.

Fibres stérilisée à l’autoclave: 15min à 125°C.

3 mois

Naturelles ^Composites. Nettoyage rapide à l’éthanol. 1, 3 et 6 mois.

Ensemencées

Composites. -Nettoyage rapide à l’éthanol.

- Inoculation avec une suspension mère de concentration 1,4.10⁴ UFC^*.ml^-1, soit 1,3.10³ UFC^*.cm^-2 de composites. * Unité Formatrice de Colonie

1, 3 et 6 mois.

14 g de Fibres courtes de lin.

Fibres inoculées avec 4ml de milieu de culture constituée de 3 souches

microbiennes.

14 mois.

Les échéances de prélèvement sont différentes selon les matériaux. Pour les matériaux composites, les prélèvements sont effectués au bout de 1 mois, 3 mois et 6 mois de vieillissement en conditions stériles, naturelles et ensemencées. Les composites étudiés sont renforcés par 11, 29, 38 et 54% en masse de fibres de lin. Concernant les fibres, elles sont caractérisées après 3 mois de vieillissement en conditions stériles et après 14 mois dans le cas du vieillissement en conditions ensemencées.

Concernant le vieillissement en conditions ensemencées, un protocole de vieillissement fongique de matériaux biosourcés a été appliqué. Ce protocole est basé sur les normes MIL-STD-810F et NF EN 60068-2-10. Ces normes ne sont pas spécifiques aux

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matériaux biosourcés pour l'habitat, mais elles permettent d’évaluer l’action directe ou indirecte de microchampignons sur la durabilité des matériaux biosourcés.

La première étape de ce protocole consiste à récupérer des souches qui se sont naturellement développées dans la solution de vieillissement physico-chimique. La récupération de ces souches se fait après séchage de la solution de vieillissement physico-chimique à 30°C, les souches fongiques déposées au fond du récipient sont ensuite prélevées et introduites dans un bouillon dénommé "Potatoes Dextrose". A partir de cette culture liquide, les souches ont été isolées sur un milieu de culture solide "Potatoes Dextrose Agar", PDA, puis incubée à 30°C pendant 48h.

Trois espèces de morphologie différentes ont réussi à se développer comme le montre la Figure 78. Les trois boites A, B et C (Figure 78) présentent des colonies avec un centre de couleur foncée. Les micro-organismes qui se développement dans les boites A et C possèdent une forme ovale et poussent en surface. La souche présente dans la boite B présente plus de filaments, avec un centre de colonie brunâtre et, contrairement aux boites A et C, les colonies poussent beaucoup plus en hauteur. Ces espèces ont été repiquées en milieu liquide et cultivées (Figure 79).

Figure 78 -Trois souches de micro-organismes, A, B et C ayant pu se développer

Figure 79 - Repiquage en milieu liquide des trois souches de micro-organismes

Les composites ont été ensuite inoculés par immersion rapide (30 secondes environ) dans une suspension microbienne composée de 200 ml de milieu minéral, dont la composition est présentée dans le Tableau 10, et de 2 ml de chaque espèce (une suspension mère de 1,4.10⁴ UFC.ml^-1). L'utilisation de ce milieu minéral dépourvu de carbone a pour but d'inciter les micro-organismes à utiliser une source de carbone en provenance du matériau.

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Tableau 10 - Préparation de 1L de solution de milieu minéral de culture

Composant chimique En masse

(g) KH2PO4 0,7g K₂HPO₄ 0,7g MgSO₄.7H₂O 0,7g NH4NO3 1,0g NaCl 0,005g FeSO₄.7H₂O 0,002g ZnSO₄.7H₂O 0,002g MnSO4.7H2O 0,002g

Afin de vérifier la capacité des micro-organismes à se développer, un témoin positif en coton est imbibé de la suspension microbienne et est examiné 7 jours après incubation. Au bout de cette période, un développement microbien sur le témoin positif a pu être observé (Figure 80), ce qui prouve que les micro-organismes ont réussi à se développer dans ces conditions d'étude.

Figure 80 -Vérification du témoin positif après 7 jours d’incubation à 30°C et 96% H.R.

II.2.2. Matériaux étudiés

Comme présenté dans le Tableau 9, les matériaux étudiés sont des fibres courtes de lin et des composites. Les fibres courtes de lin ont été séchées à 30°C pendant une semaine avant vieillissement. Les composites étudiés sont des plaques (n=2) et éprouvettes (n=3) contenant différents taux massiques de fibres de lin soit : PE seul, PE avec 11% en masse de lin, PE avec 29% en masse de lin, PE avec 38% en masse de lin et PE avec 54% en masse de lin.

II.2.3. Mesure de la croissance microbienne

La croissance microbienne a été examinée d'abord par observation au microscope optique des plaques et éprouvettes de composites vieillis. Le nombre de colonies de micro-organismes ayant pu se développer au temps de prélèvement (1, 3 et 6 mois) a été dénombré sur gélose après dilutions successives. Pour cela, les micro-organismes sont prélevés avec un coton tige sur toute la surface de chaque éprouvette vieillie. Des séries de dilutions sont

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réalisées à partir de l'échantillon initial afin de réduire la charge microbienne et pouvoir ainsi dénombrer le nombre de cellules présentes.

La formule appliquée est la suivante :

N = ∑ c

V (n 1 + 0.1n2)d

(15) Avec :

∑c : somme des colonies comptées sur toutes les boites retenues de deux dilutions successives et dont au moins une contient au moins 10 colonies.

V : volume d’inoculum en ml ou cm³

n₁ ; n₂ : le nombre de boites retenues respectivement à la première et la deuxième dilution d : première dilution retenue

Ce nombre est exprimé en Unités Formant Colonie (UFC.ml^-1) qui correspond au nombre de micro-organismes pouvant former des colonies, lorsqu’ils sont étalés en surface ou en profondeur dans des boites de milieux gélosés. Il peut être également exprimé par unité de surface (cm²), indiquant ainsi la quantité de micro-organismes viables à la surface d'un échantillon.

Après avoir présenté les études de vieillissements réalisées, les techniques de caractérisation multi-échelle des matériaux initiaux et vieillis sont détaillées dans le prochain paragraphe.