Les vecteurs viraux les plus utilisés

Les deux vecteurs viraux les plus utilisés en TG sont les lentivirus (LV) et les virus adéno-associés (AAV). Le tableau 4 présente les caractéristiques majeures de ces deux vecteurs (Choudhury et al., 2017). Je décrirai rapidement les lentivirus et leur utilisation en TG puis, les AAV étant les vecteurs utilisés dans mon projet de thèse je décrirai les

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caractéristiques des AAV sauvages et leur cycle d’infection, avant de rentrer plus en détail dans les approches de TG basées sur l’utilisation d’AAV.

1.3.2.1. Les lentivirus

Les LV sont des virus à ARN, dérivé du HIV-1 appartenant à la famille des rétrovirus. Suite à l’infection d’une cellule, le génome à ARN est rétrotranscrit en ADN double brin proviral, transloqué dans le noyau et intégré au génome de la cellule hôte. Après transcription par la machinerie cellulaire, de nouvelles particules virales sont formées à la membrane plasmique. Le génome des LV est composé des gènes gag, pol et env ainsi que de six gènes codant des protéines accessoires. Gag code pour les éléments structuraux du virus (protéines de la capside, de la matrice et de la nucléocapside) et pol code pour les enzymes virales (la protéase, la transcriptase inverse et l’intégrase) nécessaires à la réplication. Env code pour les glycoprotéines de l’enveloppe, responsables de la médiation de l’entrée du virus dans les cellules. Le génome viral est flanqué de 2 LTR (Long Terminal Repeats), nécessaires à la rétrotranscription, à la transcription et à l’intégration du génome viral dans le génome de la cellule hôte. Les LV sont des virus pathogènes capables de transduire des cellules mitotiques et post-mitotiques.

Ainsi, pour les approches de TG, grâce à l’intégration du génome du lentivirus, le transgène est transmis aux cellules filles lors de la division cellulaire permettant son expression à long terme. Ces vecteurs viraux peuvent être utilisés pour des transductions in

vivo (cerveau, œil, foie, muscles) mais ils sont surtout utilisés dans des approches ex vivo

consistant à corriger des cellules extraites de patients, particulièrement des cellules souches hématopoïétiques, et à les réimplanter. Les cellules sont stablement transduites par les lentivirus et le gène thérapeutique est intégré au génome de la cellule hôte, permettant une expression persistante malgré les divisions cellulaires répétées. Ces approches ex vivo ont été utilisées pour des maladies hématologiques (hémophilie, β-Thalassémie), des immunodéficiences primaires (ADA-SCID) ou encore des maladies neurodégénératives. Par exemple dans le cas de l’adrénoleucodystrophie liée à l’X (ALD), une maladie démyélinisante du SNC, des cellules souches hématopoïétiques de patients ont été traitées avec un lentivirus codant pour le gène défectueux (ABCD1) et transplantées dans la moelle osseuse des patients (Cartier et al., 2009). A noter que la caractéristique intégrative du vecteur est aussi liée à un risque mutagène dans le cas d’intégration dans un oncogène (essai clinique SCID-X1 par exemple). Le pseudotypage de l’enveloppe de ces vecteurs

Figure 30 : Les AAV sauvages et l’organisation de leur génome.

(A) Première observation de particules AAV (flèches blanches) dans une préparation d’adénovirus simien (SV15). Grossissement x132000. (Issu de Mayor et al., 1965). (B) Organisation du génome de 4,7 kb de l’AAV2 (AAV le plus étudié). Le gène rep code pour quatre protéines à partir des promoteurs, p5 et p19. Le gène cap code pour les trois protéines de la capside et pour la protéine AAP, à partir du promoteur p40. (Flèches : promoteurs, traits horizontaux : transcrits, angles gris : introns, rectangles pleins : exons). (Adapté de Grieger and Samulski, 2012).

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avec l’enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire G (VSVG) permet d’élargir leur tropisme en particulier pour les neurones et les cellules gliales.

1.3.2.2. Les virus adéno-associés (AAV)

1.3.2.2.1. Caractéristiques des AAV sauvages

Les AAV, de la famille des Parvoviridae, sont des petits virus à capside icosaédrique de 20 à 25nm (Tableau 4). Ces virions non enveloppés à ADN simple brin (sb) sont non pathogènes pour l’Homme. Appartenant au genre des Dependoparvovirus, les AAV nécessitent des fonctions apportées par d’autres virus, appelés virus « helper », pour infecter efficacement une cellule mammifère, tel que des adénovirus ou des herpesvirus (Grieger

and Samulski, 2012; Verma and Weitzman, 2005). Les AAV ont été identifié pour la première

fois en 1965 dans des préparations adénovirales et tirent leur nom de cette première observation, (Figure 30A) (Mayor et al., 1965). Depuis plus de 100 variants d’AAV, se répartissant en 6 clades (A à F), ont été isolés chez l’Homme et les certains primates (babouins, chimpanzés, macaques rhésus, macaques crabiers et macaques à queue de cochon) (Castle et al., 2016; Cearley et al., 2008). Ces variants présentent une taille et une organisation du génome similaires mais des différences au niveau de la structure primaire des protéines composant la capside. La majorité des travaux ont été faits avec l’AAV2, c’est pourquoi nous allons nous focaliser d’avantage sur la biologie de ce sérotype.

Le génome de 4,7 kb des AAV est composés de deux gènes, rep et cap entourés de séquences ITR (inverted terminal repeats) en forme de T (Figure 30B) (Grieger and

Samulski, 2012). Le gène rep code pour quatre transcrits nécessaires à la réplication et à

l’encapsidation, à partir de deux promoteurs p5 et p19 (Rep 78, 68, 52 et 40). Les protéines Rep 78 et 68, sont synthétisées à partir de 2 transcrits initiés au niveau du promoteur p5. Ces deux protéines sont multifonctionnelles et impliquées dans de nombreuses étapes du cycle viral (transcription, réplication et intégration spécifique). Les protéines Rep 52 et 40 sont synthétisées à partir de 2 transcrits initiés au niveau du promoteur p19 et jouent un rôle dans l’encapsidation de l’ADN viral dans les capsides nouvellement formées dans le noyau de la cellule hôte. Le gène cap code pour les trois protéines structurales de la capside dont les transcrits sont initiés à partir du promoteur p40. Ces trois protéines, VP1, VP2 et VP3 composent la structure de la capside avec un ratio 1 :1 :10 respectivement (5VP1, 5 VP2 et 50 VP3). Un transcrit alternatif du gène cap code pour la protéine APP (assembly activating

Figure 31 :Mécanisme d’infection d’une cellule mammifère par un AAV. (Adapté de Choudhury et al., 2017).

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(Penaud-Budloo et al., 2018). Les différents sérotypes d’AAV (paragraphe 2.2.1) reposent

sur des différences d’acides aminés au niveau des protéines VP. La structure de la capside a été élucidée pour un nombre restreint de sérotypes (AAV1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9). Les ITR longues de 145pb, localisées en 5’ et 3’ du génome, correspondent aux origines de réplication.

1.3.2.2.2. Cycle d’infection des AAV

Comme pour l’ensemble des virus, l’infection efficace d’une cellule par un AAV nécessite plusieurs étapes (Figure 31) (Choudhury et al., 2017; Grieger and Samulski, 2012). Le virion entre en contact avec la cellule à infecter via des récepteurs de surface spécifiques. Dans certains cas des corécepteurs sont présents pour faciliter l’internalisation du virus. En fonction du sérotype viral les récepteurs et corécepteurs diffèrent, conférant différents tropismes cellulaires (paragraphe 2.2.2.1). Les récepteurs pour les différents AAV ne sont pas tous identifiés mais l’AAV2 a pour récepteur cellulaire un protéoglycane héparane sulfate (HSPG) et pour corécepteurs le facteur de croissance des fibroblastes 1 (FGFR1) ainsi que l’intégrine αVβ5 ) (Grieger and Samulski, 2012). Suite à la liaison à son récepteur de surface, l’AAV est internalisé dans la cellule par endocytose impliquant des clathrines dans la majorité des cas. Les microtubules régulent le transport de l’endosome dans le cytoplasme. Une acidification de l’endosome conduit à l’activation du domaine phospholipase de la protéine VP1. Ceci induit des changements dans l’intégrité de la capside permettant au virus de s’échapper de l’endosome. Grâce à la présence de signaux de localisation nucléaire dans les protéines VP1 et VP2, le virion est importé dans le noyau. Suite à la décapsidation, le génome viral est libéré dans le noyau de la cellule. Les AAV étant des virus à ADN sb, la synthèse du brin complémentaire par les protéines Rep virales et la machinerie de la cellule hôte est nécessaire pour permettre l’expression des gènes viraux. Il a été montré en in vitro, le complexe minimal, provenant de la cellule hôte, requis pour la réplication de l’ADN viral est composé de quatre protéines : l’ADN polymérase δ et les enzymes RCF (replication factor C), PCNA (proliferating cell nuclear antigen) et le MCM (minichromosome maintenance complex) (Nash et al., 2008). Suite à la synthèse du double brin le génome viral est instable. En absence d’une co-infection avec un virus helper, le génome de l’AAV s’établit en épisome ou plus rarement il peut s’intégrer au génome nucléaire au niveau d’un site unique dans le chromosome 19 (q13.4) appelé AAVS1. Cette intégration par homologie de séquence requiert les protéines Rep 78 et 68 codées par l’AAV. Le virus peut sortir de la phase de latence en présence d’un virus helper, qui apporte les

Figure 32 : Réplication du génome simple brin de l’AAV.

La réplication du génome viral nécessite un environnement permissif dans la cellule. La polymérase δ de la cellule hôte, accompagnée des protéines RFC, PCNA et MCM, synthétise le brin complémentaire à partir de l’extrémité 3’ du génome viral. L’étape d’isomérisation permet la formation des ITR en 3’ et en 5’ de l’ADN double brin (db) créant de nouvelles amorces. L’endonucléase Rep clive ensuite le brin parental faisant apparaitre une extrémité 3’ et initiant la synthèse du brin complémentaire de l’ITR. Enfin, La nouvelle élongation du brin complémentaire permet de déplacer le brin monomère initial et reformer un ADN viral db. Les monomères sont ensuite encapsidés. (Adapté de Grieger and Samulski, 2012).

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protéines nécessaires à la réplication du génome viral, à la synthèse de la capside et à l’encapsidation de l’ADN, permettant à l’AAV de compléter son cycle viral. Les étapes de réplication du génome viral sb sont présentées dans la figure 32. Les brins plus et les brins moins nouvellement formés sont empaquetés dans la capside icosaèdrale sans préférence. L’infection latente, non pathogène, est particulièrement commune dans la population humaine avec 90% des adultes séropositifs pour l’AAV2 (Lykken et al., 2018).

L’ensemble des étapes du cycle d’infection du virus (liaison au récepteur, entrée par endocytose, sortie de l’endosome, entrée dans le noyau, décapsidation, libération du génome, synthèse du brin complémentaire et transcription du génome viral) peuvent chacune être limitantes dans des approches de thérapie génique utilisant des AAV recombinants (AAVr) (paragraphe suivant).

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2. Thérapies géniques basées sur l’utilisation d’AAV pour les maladies du système