Il est donc possible de comparer les vitesses de croissance des souches au sein d’un
même groupe de manipulations. Cependant, nous avons vu (partie 3) que les populations à t0
sont différentes pour les bactéries (ce qui n’est pas le cas pour les microalgues). Si l’on veut comparer les souches entre elles, il faudra donc faire en sorte que les différences d’inoculation
n’influent pas les résultats à t0+6 : on retranchera donc le logarithme de la population
bactérienne à t0 du logarithme de cette même population à t0+6 (il est possible de faire cela car
les populations bactériennes à t0, bien que différentes, restent dans le même ordre de
grandeur).
• Groupe 1 : manipulations du 1er et du 2 septembre
Ces deux manipulations correspondent à quatre souches de P. syringae : CC0094, DC 3000, B 728a, 1448A. Pour percevoir s’il y a un effet « souche », un effet « algue » ou une
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interaction entre ces deux effets, nous avons appliqué une ANOVA à deux facteurs (variables
de classement : avec ou sans algues (var1) / souches (var2) ; variables à analyser : log(t0+6j) –
log(t0)). Les résultats de cette ANOVA sont exposés dans le tableau 6.
Somme des carrés des écarts
à la moyenne Degré de liberté F p Var1 : présence ou absence de C. reinhardtii 137 0,1855 1 24,67 0,000000 Var 2 : souches bactériennes 0,1442 3 6,39 0,0130667 Var1xVar2 (interaction) 0,1593 3 7,06 0,009704 Erreur 0,0677 9
Tableau 6 : Résultats de l’ANOVA à deux facteurs pour les souches bactériennes du groupe 1
L’ANOVA montre que l’algue et le type de souche ont un effet significatif avec une marge d’erreur de 5% sur la croissance bactérienne (la valeur de p étant inférieure à 5%). L’interaction entre ces deux facteurs est également significative.
Pour mieux visualiser ces effets, des graphiques ont été tracés. Ils sont exposés en figures 13, 14 et 15. Les lettres sur les graphiques sont les résultats du test de Newman- Keuls : lorsqu’il y a une lettre en commun entre deux valeurs, la différence n’est pas significative avec un risque d’erreur de 5%. Inversement, lorsqu’il n’y a aucune lettre en commun entre deux valeurs : elles sont significativement différentes avec un risque d’erreur de 5%.
On remarque qu’il y a une différence significative entre les bactéries cultivées seules et celles qui étaient au sein d’une co- culture. Il y a donc un effet positif de C. reinhardtii sur l’ensemble des souches du groupe 1.
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En ne prenant pas en compte le fait que les bactéries aient été au sein d’une culture pure ou d’une co-culture, on remarque qu’il y a des différences de vitesses de croissance entre les souches. La souche B 728a croît significativement plus rapidement que les souches DC 3000 et CC0094.
Figure 14 : Taux de croissance des souches bactériennes du groupe 1 à t0+6j, tous traitements confondus
Figure 15 : Taux de croissance des souches bactériennes du groupe 1 en fonction de la présence ou de l’absence de C. reinhardtii 137 dans le milieu de culture. Résultats du test de Newman-Keuls.
Le test de Newman-Keuls vient confirmer le test de Student pour dire qu’il y a une différence significative entre les CC94 cultivées seules et celles cultivées en co-culture.
Par ailleurs, on observe une différence significative en l’absence de C. reinhardtii dans le milieu entre les souches B 728a et 1448A d’un côté et la souche CC94 d’un autre côté. Cette différence n’est plus significative en présence de la microalgue : il y a aurait donc un effet plus important de C. reinhardtii sur la souche CC94 que sur les autres souches du groupe 1.
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• Groupe 2 : manipulations du 2, 3, 8, 9 et 10 septembre
Ces manipulations correspondent aux souches suivantes de P. syringae : DC 3000, B 728a, 1448A, UB246, SZ131, UB184, SZ030, CC1504, UB313, UB295, TA043 et CC655 ainsi qu’à E. coli, Erwinia et P. fluorescens.
Les résultats de l’ANOVA à deux facteurs (variables de classement : avec ou sans
algues (var1) / souches (var2) ; variables à analyser : log(t0+6j) – log(t0)) sont dans le tableau
7.
Somme des carrés des écarts
à la moyenne Degré de liberté F p Var1 : présence ou absence de C. reinhardtii 137 4,1528 1 130,29 0,000000 Var 2 : souches bactériennes 10,5861 14 23,72 0,000000 Var1xVar2 (interaction) 2,8655 14 6,42 0,000013 Erreur 0,9244 29
Tableau 7 : Résultats de l’ANOVA à deux facteurs pour les souches bactériennes du groupe 2
Comme pour le groupe 1, l’ANOVA montre que l’algue et le type de souche ont un effet significatif avec une marge d’erreur de 5% sur la croissance bactérienne (la valeur de p étant inférieure à 5%). L’interaction entre ces deux facteurs est également significative.
Des graphiques permettent là encore de mieux visualiser ces différents effets. Ils sont exposés en figures 16, 17 et 18.
Même remarque que
précédemment : il y a un effet positif des microalgues sur la croissance bactérienne des souches du groupe 2.
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Figure 17 : Taux de croissance des souches bactériennes du groupe 2 à t0+6j., tous traitements confondus
Grâce au test de Newman-Keuls, on remarque que TA043 et UB295 poussent significativement plus vite que les autres souches du groupe. Les souches dont la population croît plus lentement sont Erwinia, CC1504 et UB184.
Figure 18 : Taux de croissance des souches bactériennes du groupe 2 en fonction de la présence ou de l’absence de C. reinhardtii 137 dans le milieu de culture. Résultats du test de Newman-Keuls.
Ce test vient confirmer l’effet global de l’algue sur la croissance bactérienne. Il est significatif pour certaines souches dont celles qui l’étaient déjà pour le test de Student, mais il
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l’est aussi pour d’autres car le test de Newman-Keuls est moins restrictif : il prend en compte l’ensemble des valeurs du groupe et non uniquement quatre tubes. Cependant, il ne permet pas de comparer l’ensemble des valeurs de toutes les manipulations.
On remarque qu’Erwinia et CC1504 croient faiblement en l’absence de C. reinhardtii dans le milieu ce qui n’est plus le cas en présence des microalgues, la différence n’étant plus significative avec la plupart des autres souches. L’effet de l’algue serait donc plus important sur ces deux souches que sur les autres du groupe. Pour finir, les souches du groupe phylogénétique UB313 (UB313, UB295 et TA043) sont celles qui semblent avoir le taux de croissance le plus élevé.
• Groupe 3 : manipulations du 3, 8, 10, 15 et 16 septembre
Ce groupe correspond aux souches et aux bactéries suivantes : E. Coli, Erwinia, P. fluorescens, UB246, SZ131, UB184, UB295, TA043, CC655, Psy508, UB330, Psy642, CC1419, Psy Cit 7, SZ122, UB368, UB407, UB197 et CC1418.
Remarque : un contaminant bactérien mineur était présent dans les expériences du 15 et 16 septembre.
Les résultats de l’ANOVA à deux facteurs (variables de classement : avec ou sans
algues (var1) / souches (var2) ; variables à analyser : log(t0+6j) – log(t0)) sont dans le tableau
8.
Somme des carrés des écarts
à la moyenne Degré de liberté F p Var1 : présence ou absence de C. reinhardtii 137 2,8582 1 175,26 0,000000 Var 2 : souches bactériennes 8,1068 18 27,62 0,000000 Var1xVar2 (interaction) 2,8527 18 9,72 0,000000 Erreur 0,6197 38
Tableau 8 : Résultats de l’ANOVA à deux facteurs pour les souches bactériennes du groupe 3
L’ANOVA montre que l’algue, le type de souche et que l’interaction entre ces deux facteurs ont un effet significatif avec une marge d’erreur de 5% sur la croissance bactérienne (la valeur de p étant inférieure à 5%).
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Il y a un effet positif des microalgues sur les bactéries.
Figure 19 : Effet des C. reinhardtii 137 sur les souches bactériennes du groupe 3, toutes souches confondues
Figure 20 : Taux de croissance des souches bactériennes du groupe 3 à t0+6j., tous traitements confondus.
Dans ce groupe-ci, les bactéries qui croient significativement le moins rapidement sont Erwinia et UB184. Tandis que UB295 et TA043 sont les souches dont la population augmente la plus vite du groupe. On ne voit pas d’effet particulier de la contamination sur les souches testées dans les expériences du 15 et 16 septembre.
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Figure 21 : Taux de croissance des souches bactériennes du groupe 3 en fonction de la présence ou de l’absence de C. reinhardtii 137 dans le milieu de culture. Résultats du test de Newman-Keuls.
L’algue a un effet important sur la vitesse de croissance d’Erwinia puisque c’est pour cette bactérie que l’on observe une différence conséquente entre le taux de croissance en l’absence d’algues et celui en présence de ces dernières. L’algue semble aussi avoir un effet du même type pour E. coli ainsi que pour les souches de P. syringae suivantes : UB295, TA043 et CC0655. Mais il ne semble pas y avoir de corrélations entre ces observations et les caractères bactériens étudiés.
• Groupe 4 : manipulations du 8, 14, 15 et 16 septembre
Il s’agit des P. syringae suivantes : UB246, SZ131, UB184, USA046, SZ046, CC1582, SZ035, CC654, SZ145, Psy508, UB330, Psy642, CC1419, Psy Cit 7, SZ122, UB368, UB407, UB197 et CC1418.
Remarque : un contaminant bactérien mineur était présent dans les expériences du 15 et 16 septembre.
Les résultats de l’ANOVA à deux facteurs (variables de classement : avec ou sans
algues (var1) / souches (var2) ; variables à analyser : log(t0+6j) – log(t0)) sont dans le tableau
34 Somme des
carrés des écarts à la moyenne Degré de liberté F p Var1 : présence ou absence de C. reinhardtii 137 0,869 1 0,869 0,000000 Var 2 : souches bactériennes 3,673 18 0,204 0,000000 Var1xVar2 (interaction) 0,410 18 0,023 0,375917 Erreur 0,776 38 0,020
Tableau 9 : Résultats de l’ANOVA à deux facteurs pour les souches bactériennes du groupe 4
L’ANOVA montre que l’algue et le type de souche ont un effet significatif avec une marge d’erreur de 5% sur la croissance bactérienne (la valeur de p étant inférieure à 5%). Cependant, cette fois l’interaction entre les deux facteurs n’est pas significative.
Les graphiques des figures 22 et 23 permettent de visualiser les résultats.
Il y a un effet positif des microalgues sur les bactéries.
Figure 22 : Effet des C. reinhardtii 137 sur les souches bactériennes du groupe 4, toutes souches confondues.
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La souche UB184 pousse significativement moins rapidement que les autres P. syringae du groupe 4. Pour les autres souches, il y a très peu de différences significatives. A nouveau, on ne voit pas d’effet particulier de la contamination sur les souches testées dans les expériences du 15 et 16 septembre.
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DISCUSSION
Globalement, on observe des tendances générales en co-culture. Tout d’abord, on a une diminution des populations de microalgues en co-culture avec des bactéries par rapport à la culture pure. A l’inverse, on a une augmentation des populations bactériennes en culture avec des C. reinhardtii 137 par rapport aux bactéries cultivées seules.
Ces résultats suggèrent un effet de transfert d’azote au sein des deux types de
populations : l’azote (sous forme de NH4Cl) est utilisé pour la croissance des microalgues
mais les bactéries que nous avons testées sont aussi capables d’utiliser ce dernier à leur profit. Ceci expliquerait qu’il y ait plus de microalgues en culture pure : il n’y aurait pas de compétition vis-à-vis de l’azote alors qu’en co-culture, les bactéries seraient plus compétitives que les microalgues d’où une diminution de la population algale. De plus, les C. reinhardtii permettent d’apporter du carbone dans le milieu par photosynthèse ce que ne sont pas capables de faire les bactéries. Il y aurait donc une partie du carbone fixé par photosynthèse qui serait utilisé par la population bactérienne en co-culture. La forme sous laquelle se fait ce transfert (lipides, sucres, polysaccharides…) ne peut pas être identifiée dans ces expériences mais ce mécanisme semble assez général puisque ces résultats sont observés chez l’ensemble des bactéries et non uniquement chez les P. syringae.
Nous pouvons aussi imaginer un effet de compétition vis-à-vis d’autres éléments nutritifs que l’azote, par exemple : le phosphore, le fer… Les bactéries ayant une vitesse de croissance plus élevée, elles sont plus compétitives que les microalgues pour ces éléments en quantités limitées dans le milieu, ceci expliquerait les résultats globaux obtenus.
De manière plus approfondie, au niveau des deux populations étudiées, on remarque qu’il y a des différences significatives et d’autres pas. Les bactéries semblent plus sensibles au fait d’être au sein d’une co-culture que les microalgues. Cependant, ces différences ne semblent pas être dues aux caractères étudiés, à part, peut-être un rôle du phage. En effet, ce phage détecté sur le génôme bactérien, proche de l’îlot de pathogénicité entraîne dans tous les cas étudiés un effet significatif au moins sur l’une des deux populations microbiennes. Il semble néanmoins difficile de faire un lien entre la présence de ce phage et les effets observés : peut-être conviendrait-il mieux de faire un criblage de plus de souches possédant ce dernier avant de faire des études plus poussées.
Des résultats assez inattendus comme celui-ci se sont aussi manifestés pour les souches témoins, et notamment pour E. coli, qui était la seule bactérie non pathogène des plantes et qui était significativement sensible à la présence de C. reinhardtii. Ceci confirmerait donc le fait que les caractères pathogènes observés ne rentreraient pas en compte dans les effets observés sur les populations de microorganismes.
Les résultats obtenus permettent de conclure que les caractères pathogènes étudiés ne semblent pas jouer de rôle particulier dans les souches testées. Les effets observés sont ceux induits par une co-culture « banale ». Il semblerait qu’il faille cribler un plus grand nombre de souches pour être certain qu’ils n’interviennent pas dans les interactions avec les microalgues, peut-être en association avec d’autres caractères absents dans les souches testées ici. Il est donc possible que d’autres caractères que ceux étudiés rentrent eu jeu : il faudrait donc étudier un plus grand nombre de ces caractères.
D’un point de vue technique, le protocole est améliorable. En effet, on observe des différences entre manipulations qui montrent que ces dernières ne sont pas équivalentes entre- elles. Ceci pose un problème au niveau de l’analyse statistique des résultats puisque nous
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sommes obligés de regrouper les manipulations équivalentes pour pouvoir comparer les souches bactériennes, et nous ne pouvons donc pas comparer toutes les souches entre-elles.
Il serait donc peut-être préférable d’effectuer les manipulations au sein de microplaques de 96 puits permettant de comparer un grand nombre de traitement en une seule expérience. Cependant, nous avions testé cette possibilité au départ et le problème est qu’il y a formation de biofilms de microalgues à la surface des puits, qui gêne le prélèvement et biaise le dénombrement. L’agitation qui permet de disperser ces biofilms dans les tubes en verre n’est pas possible en microplaques ce qui fait que nous avons abandonné ce choix. Cependant, ce problème pourrait être contourné en utilisant des plaques avec des puits plus larges (plaques à 12 puits) permettant de faire passer des barreaux aimantés, ce qui faciliterait l’agitation des suspensions et donc éviterait la formation de biofilms. Ces plaques n’étaient pas disponibles pendant le stage.
Pour pouvoir comparer plus de souches entre-elles, il faudrait cribler plus de souches par manipulations. Cependant, il y a une limite de temps : il est difficile de cribler plus de dix souches par jour, le dénombrement bactérien étant assez long. En effet, dix souches signifient vingt tubes de cultures bactériennes pures, vingt tubes de co-cultures et deux tubes de microalgues pures. Le dénombrement bactérien supposant des dilutions pour chaque tube, il faut effectuer quarante suspensions de dilution et étaler neuf gouttes sur quarante boîtes de Petri soit 360 gouttes, sans compter le dénombrement des microalgues, le dénombrement après deux jours des bactéries sur boîtes de Petri et le traitement des résultats… Il semble donc assez compliqué de cribler plus de dix souches par jour.
Pour finir, comme l’illustre l’exemple précédent, il faudrait mettre en place un nouveau système de dénombrement bactérien. Ceci afin de diminuer le temps de manipulation et afin de cribler plus de souches, mais aussi pour dépenser moins de consommables. Une des techniques possibles pour dénombrer les bactéries rapidement et de manière fiable serait d’utiliser le compteur de cellules avec un tube adapté à la taille des bactéries, avec un orifice de 30 ou 50 microns. Ceci permettrait de compter tous les microorganismes grâce à la même technique, ce qui serait plus cohérent au niveau de l’analyse des résultats.
Enfin, ces co-cultures sont des systèmes très simplifiés qui sont assez éloignés des biofilms naturels. Des expériences avec des microalgues en biofilms sont prévues et permettront d’aborder des interactions plus complexes qui tiennent compte de la structure d’un biofilm.
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