2 Méthodologie
2.9 Validation du protocole établi
Suite à la comparaison des différents protocoles testés, le protocole optimal pour la détection, la séparation et l’extraction des analytes est déterminé. Celui-ci est utilisé pour toutes les étapes subséquentes du projet. Les rapports masse/charge des précurseurs, les voltages du fragmenteur, les masse des ions produits ainsi que les énergies de collision optimisées pour chacune des 18 espèces sont consolidés dans le tableau II (voir section résultats) et seront utilisés pour la quantification des acides biliaires pour toutes les étapes subséquentes du projet.
La colonne utilisée pour la séparation est Kinetex XB-C18 (4,6x100 mm; 2,6 µ). La colonne est maintenue à une température de 40°C, la chromatographie est opérée en mode gradient avec une phase A aqueuse composée d’acide formique 0,1% et une phase B organique composée de méthanol 100%. Un gradient de 75% à 100% de phase B est appliqué entre 0 et 12,2 min. Un plateau de 100% de phase B est maintenu jusqu’à 15 min, suivi d’un retour à 75% de phase B. Finalement, la phase est maintenue à 75% B pour un lavage de 2 min. La figure 20 présente le chromatogramme obtenu suite à la séparation utilisant les paramètres retenus et décrits plus-haut (voir section résultats).
Le traitement des échantillons de sérum pour l’extraction des acides biliaires est le suivant pour le reste du projet : 100 µL de sérum sont mélangés avec 200 µL de méthanol ainsi que 10 µL du mélange de standards internes (CDCA-d4, CA-d4 ainsi que DCA-d4). Suite à un vortex, les échantillons sont mélangés mécaniquement pendant 10 minutes puis centrifugés 5 minutes à 16 200g. Le surnageant est récupéré puis 10 µL sont injectés dans le LC-MS/MS. Suite à l’élaboration du protocole optimal pour la détection et la séparation des analytes, la validation de celui-ci confirme sa conformité.
Suppression d’ion
10 échantillons de sérum négatif subissent l’extraction en remplaçant le standard interne par une solution de composition identique : MeOH 50%. 5 échantillons d’eau qui servent de comparateurs subissent également l’extraction. Par la suite, les analytes et les standards internes sont ajoutés afin de fortifier ces échantillons de sérum et d’eau. Les ajouts dosés sont effectués à des concentrations représentatives des analytes et standards internes à 2 niveaux de contrôle de qualité. La suppression d’ions est évaluée en calculant le ratio de la réponse instrumentale des analytes ajoutés dans la matrice biologique extraite par rapport à la réponse instrumentale de la même quantité d’analytes ajouté dans l’eau extraite. Un changement de signal signifie que le résultat de l’analyse est influencé par la matrice.
Limite de détection (LOD)
Les LOD des 15 acides biliaires sont déterminés en faisant une régression linéaire avec des niveaux faiblement concentrés équidistants pour chacun des acides biliaires individuels par dilution en série. La plus faible concentration pouvant être détectée, distinguée de 3 signaux de blanc et quantifiée à la suite des étapes d’extraction correspond à la limite de détection. Les échantillons sont préparés par dilution en série à partir d’une solution de 5 µg/mL jusqu’à une concentration de 0,0005 µg/mL. Les concentrations sont ensuite converties par en µmol/L pour chacun des acides biliaires individuels.
Précisions intra et inter-jour
La précision est mesurée en termes de coefficients de variation du paramètre mesuré. L’imprécision analytique intra-essai (%CV) de la méthode de quantification des acides biliaires par LC-MS/MS est déterminée en effectuant des mesures répétées des 2 niveaux de contrôles de qualité (CQH = 5 µg/mL CQB= 0,8 µg/mL) effectuées dans une même série analytique la même journée (n=9, duplicata). L’imprécision analytique inter-essai (%CV) de la méthode de quantification par LC-MS/MS est déterminée en effectuant des lectures répétées
de chaque niveau de contrôle de qualité qui sont effectuées à raison d’une mesure par série analytique, sur différentes journées (n=15, duplicata).
Linéarité
La linéarité est déterminée par une régression linéaire faite par dilution en série avec 6 niveaux d’acides biliaires répartis adéquatement dans l’intervalle de mesure anticipé (entre 0,2 et 200 µmol/L), dans une matrice identique aux échantillons patients (sérum). Le coefficient de corrélation est obtenu en traçant la droite de régression sur Excel.
Évaluation de la stabilité des échantillons entreposés et
congelés/décongelés
La stabilité est déterminée pour chacune des espèces d’acide biliaire. Pour ce faire, des échantillons de CQH et CQB sont conservés à température pièce, à 4°C ainsi qu’à -28°C et sont dosés en triplicata après 24h et 5 jours. Les CQH et CQB sont également dosés après trois cycles de congélation/décongélation, alors que la glace sèche est utilisée pour le gel. Dans tous les cas, on s’intéresse à la réponse relative de l’échantillon gardé selon la condition étudiée, en comparaison avec la réponse obtenue suite au dosage des contrôles de qualités fraîchement préparés. Les contrôles fraichement préparés sont la référence à 100% de signal.
Corrélation avec la méthode enzymatique traditionnelle
232 spécimens dénominalisés de patients conservés selon des conditions assurant la stabilité des analytes dans le sérum (stockés à 4°C pour un maximum de 3 jours), sont analysés par 2 méthodes sur plusieurs mois : en duplicata par LC-MS/MS ainsi que par une mesure unique du kit de dosage colorimétrique des acides biliaires totaux par GenWay. Une dilution est effectuée pour les échantillons de concentration en acides biliaires totaux dépassant l’intervalle de linéarité de chacun des tests (LC-MS/MS : 200 µmol/L, kit de dosage
colorimétrique des acides biliaires totaux par GenWay : 100µmol/L). Une régression linéaire est ensuite tracée avec le logiciel Analys-It intégré dans excel. Le modèle régression de type Deming pondéré est utilisé.