Optimisation des paramètres de séparation par chromatographie liquide

Ensuite, les paramètres de séparation de la chromatographie liquide sont optimisés, en visant une séparation des composants d’un mélange, en particulier les molécules isobariques qui ne seraient pas différenciables uniquement par le détecteur MS. Cette étape a pour but de séparer les acides biliaires avant leur entrée sur la colonne, permettant de simplifier la détection et assurer des mesures plus précises. En effet, il serait plus difficile pour le détecteur de quantifier les 15 espèces en même temps, surtout pour les isomères ayant des paramètres de détection semblables. En les séparant, on décomplexifie le mélange lors de son entrée dans le détecteur. Les paramètres sont testés avec la solution de travail composée des 15 acides biliaires. Le principe général de la chromatographie liquide est que la solution contenant les

molécules d’intérêt est injectée et va traverser une colonne. Les analytes seront entraînés par une phase mobile liquide qui va traverser la colonne. La colonne, quant à elle, comporte une phase stationnaire solide. Les acides biliaires étant amphipatiques, tant une colonne à phase stationnaire polaire ou apolaire peut être utilisées (102-104). Par contre, par leur structure différente, il est préférable d’exploiter les propriétés hydrophobes car celles-ci diffèrent plus d’espèce en espèces, ce qui facilite la séparation. Les différentes espèces d’acides biliaires auront donc une affinité plus ou moins prononcée avec la colonne, ce qui va ralentir leur progression sur la colonne. Plusieurs colonnes, de différentes longueurs et comportant différentes phases stationnaires de polarités différentes ont été testées. On vise l’obtention d’un spectre démontrant une bonne séparation des 15 espèces d’acides biliaires, ainsi qu’un temps d’analyse raisonnable et des pics assez bien répartis sur l’intervalle de temps d’analyse.

À la figure 17, on compare différentes colonnes tout en gardant les phases mobiles ainsi que les gradients constants afin de voir laquelle permet d’obtenir une meilleure séparation. Les colonnes Kinetex C18 (4,6x50 mm; 2,6 µ), Synergi Hydro-RP (4,6x150 mm; 4 µ) et Kinetex XB-C18 (4,6x100 mm; 2,6 µ) sont utilisées avec des phases mobiles d’acide formique 2% et méthanol 100%. La composition de phase mobile augmente de façon constante entre 60% et 100% de méthanol sur une période de 16 min pour être certain que toutes les espèces sont éluées. En A (Kinetex C18 (4,6x50 mm; 2,6 µ)), on voit que certaines espèces ne sont pas bien séparées. C’est notamment le cas pour le dernier pic (9 min) qui regroupe 3 espèces. On voit également que 2 espèces au temps 7 min ne sont pas tout à fait séparées. On distingue 9 signaux sur le spectre, regroupant uniquement 17 espèces d’acides biliaires. En effet, lors d’une analyse approfondie des résultats, on note l’absence totale d’une espèce (LCA). Cela signifie que celle-ci a trop d’affinité pour la colonne et la phase mobile ne permet pas son élution. En B (Synergi Hydro-RP (4,6x150 mm; 4 µ)), on voit 11 signaux, ce qui témoigne déjà d’une meilleure séparation. On voit que les 2 espèces n’ayant pas été tout à fait séparées en A au temps 7 min sont maintenant plus distinctes. On voit également à 12 min l’apparition du pic LCA, qui était manquant en A. Suite à ces observations, on conclut que la 2e _{colonne testée permet une meilleure séparation. Le chromatogramme obtenu en C} (Kinetex XB-C18 (4,6x100 mm; 2,6 µ)) démontre également 11 signaux et est semblable avec

le chromatogramme B. Cependant, on voit un décalage vers la droite de tous les pics, ce qui signifie une meilleure interaction entre les analytes et la colonne. Cela signifie qu’en modifiant les phases mobiles et les gradients, une séparation mieux contrôlée pourra être effectuée. La colonne Kinetex XB-C18 (4,6x100 mm; 2,6 µ) sera donc celle qui permettra la meilleure séparation et sera celle utilisée pour les étapes subséquentes d’optimisation de la méthode de séparation par chromatographie liquide.

À la figure 18, on compare l’efficacité de 2 différentes phases mobiles alors que la colonne et le gradient sont les mêmes. En A, les phases mobiles sont: Phase A: Acide formique 2%, Phase B: Acétonitrile 100%B et en B, les phases mobiles sont : Phase A: Acide formique 2%, Phase B: Méthanol 100%. La colonne Kinetex XB-C18 (4,6x100 mm; 2,6 µ) est utilisée et encore une fois, la composition de phase mobile augmente de façon constante entre 60% et 100% de méthanol sur une période de 16 min pour être certain que toutes les espèces sont éluées. Bien que 11 signaux soient présents sur les 2 chromatogrammes, on voit que les pics sur chromatogramme A sont moins étalés que ceux sur le chromatogramme B. En effet, sur le chromatogramme A, ils sont compris dans entre 2 et 9,5 min environ, alors qu’ils sont compris entre 5 et 13,5 min en B. Cela permet donc une meilleure séparation en général. De plus, le premier pic élue après 5 min plutôt que 2 en B, ce qui signifie que les acides biliaires ont une plus grande affinité pour la colonne au début de l’élution mais, lorsque la proportion de méthanol augmente, ils sont élués. On en conclut que les acides biliaires ont une affinité supérieure à l’acétonitrile par rapport au méthanol. L’utilisation du méthanol 100% permet donc un contrôle supérieur pour la séparation. En modifiant le gradient, il sera possible de faire une séparation encore plus efficace.

À la figure 19, on compare différents gradients tout en conservant la colonne et les phases mobiles sélectionnées plus tôt. Les chromatogrammes A à E sont des exemples de spectres obtenus lors de l’essai de différents gradients, afin d’optimiser la séparation, le temps d’analyse et la dispersion des pics sur l’intervalle. Le temps d’analyse doit être suffisamment court afin de permettre une analyse rapide qui permet plusieurs analyses dans une journée sans

compromettre la disponibilité de l’appareil pour d’autres tests, mais suffisamment long afin d’assurer une bonne séparation des analytes. On voit tout de suite que les gradients D et E ne permettent pas une meilleure séparation alors que les pics ne sont pas plus étalés sur l’intervalle de temps. En B, on voit qu’on perd la bonne séparation des espèces au temps 6,5 min. Ce gradient n’est donc pas adéquat non plus. Parmi ces essais, il est évident que le chromatogramme A présente les meilleurs résultats de séparation alors que les pics s’étalent sur un intervalle beaucoup plus grand, soit entre 3,5 et 15 min environ. Ce gradient également bon car il permet une bonne séparation des molécules isobariques ne pouvant être distinguées par le détecteur MS.

La figure 20 démontre le chromatogramme obtenu suite à l’injection de la solution standard afin la colonne, les phases mobiles et les gradients ayant démontré les meilleurs résultats. On y voit que le temps d’analyse requis est de 17 min incluant le lavage, ce qui est très raisonnable compte tenu du fait que cette méthode n’est utilisée que pour les patientes enceintes présentant des symptômes de cholestases de grossesse. On attend donc un nombre d’analyse relativement peu élevé par jour. De plus, réduire le temps d’analyse ne permettait pas une bonne séparation des 15 espèces d’acides biliaires utilisés, c’était donc inévitable d’allonger le temps pour un total de 17 min incluant le lavage. On voit que les 15 espèces sont bien séparées et réparties sur l’intervalle d’analyse. On voit aux alentours de la min 6 et 7 que plusieurs acides biliaires éluent sensiblement en même temps et sont difficilement séparables. Ceci est dû à leur faible différence structurelle, ce qui fait en sortent qu’ils ont des temps de rétention similaires puisqu’ils ont des polarités très similaires. Par contre, il est possible de les distinguer par leurs différentes masses. Le tableau III montre les temps de rétention pour les 15 acides biliaires étudiés ainsi que les 3 étalons internes.

Évidemment, cette méthode est beaucoup plus avantageuse que les méthodes enzymatiques et colorimétriques généralement utilisées actuellement. Bien que ces méthodes puissent être automatisées et que les lectures soient faites en moins d’une min (103, 105, 106),

elles ne permettent pas un profilage des acides biliaires libres et conjugués comme le permet la méthode LC-MS/MS.

Ces résultats sont similaires et comparables à ceux actuellement présents dans la littérature. En effet, la majorité des protocoles développés utilisent des colonnes C18. Le temps d’analyse est légèrement supérieur en comparaison avec d’autres méthodes qui permettent l’identification de moins d’espèces d’acides biliaires. Cependant, pour des études étudiant environ les mêmes espèces, le temps est similaire ou inférieur (96, 104). Les phases mobiles et gradients utilisées dans ces articles sont en général plus complexes (utilisation de 4 phases mobiles au lieu de 2, par exemple). Finalement, le détecteur MS permet une identification beaucoup plus spécifique et sensible que d’autres détecteurs utilisés dans la littérature, un détecteur UV par exemple (75, 96, 101, 102).