Validation des principes

Cette évaluation est faite à partir de solutions fluorescentes de biotines d’iso- cyanate de fluoresceine, notée bFITC. Ces solutions sont injectées, tout comme les solutions de BSAb, à travers le plug avec les mêmes spécifications. Les billes sont ensuite injectées dans le cytomètre pour comptabiliser le nombre de bFITC par bille. Le cytomètre classe les objets suivant leur taille mais également suivant leur intensité de fluorescence. Ainsi, nous pouvons remonter directement aux nombres de bFITC par bille.

La fluoresceine (nom commun de l’isocyanate de fluoresceine) des biotines est excitée à 488 nm et son intensité est recueillie à 520 nm. Les solutions étalons de ce dosage sont des solutions où l’on a mélangé en volume les solutions de billes et de bFITC. La capture étant totale lors de cette expérience (déterminée chapitre III), nous connaissons exactement le nombre de bFITC par bille pour une concentration donnée.

En raison de la sensibilité du cytomètre, le signal fluorescent mesurable est de l’ordre de 1000 bFITC par bille. Le signal obtenu pour ces échantillons étalons est présenté figure 4.8

La concentration de la solution de bFITC injectée à travers le plug est de 10 nanomoles. Afin d’obtenir un signal détectable au cytomètre, le temps de perco- lation est augmenté, il passe à une heure au lieu de 12 min. L’influence du débit

Figure 4.8 – Mesure de référence : billes greffées avec des streptavidines mélangées avec une solution de bFITC. Le graphique à gauche, représente le signal en SSC en fonction de celui en FSC. Il permet de discriminer la population de singulets (R1). A droite est représenté l’histogramme fluorescent de cette population de singulets à 520 nm (gain 900).

sur la capture est également testé avec un débit dix fois plus élevé. Les résultats obtenus sont présentés table 4.3.

Débit Temps de percolation Nombre de Si capture Rendement (nL/s) (min) bFITC/bille TOTALE (%)

1,4 60 7.104 ₁₀5 ₇₀

14 12 7.104 _2.105 ₃₅ Table 4.3 –Table présentant les conditions et les résultats expérimentaux obtenus lors de l’évaluation de l’efficacité de la capture du plug

Compte tenu de la sensibilité de notre mesure de fluorescence, la capture d’an- tigènes à 1 nL/s est quasi totale. Lorsque le débit est augmenté d’un facteur dix, le rendement de cette capture semble diminuer de moitié. Ceci est à relier avec la perte de "quelques billes" pendant la percolation de l’échantillon et une possible saturation des billes en raison de la valeur identique du nombre de bFITC par bille obtenu pour les deux débits testés (7.104 _{bFITC/bille). L’efficacité de capture du}

Au débit classique, ce système microfluidique répond entièrement aux objec- tifs fixés au niveau de la capture de l’antigène. Regardons maintenant s’il peut améliorer la réactivité des billes.

Réactivité

Un point avec deux fois plus de billes est également testé afin d’augmenter la fréquence colloïdale de rencontre ; paramètre favorisant la formation d’agrégats spécifiques. Deux concentrations de BSAb sont injectées 1 et 10 pM. Les résultats sont présentés table 4.4. Le nombre de BSAb/bille est calculé pour une capture supposée totale ainsi que la réactivité.

Rappel :

La Réactivité = Nliensf ormes

NBSAb × 100, ce qui équivaut dans le cas présent à :

R = %billesagregees

2.NBSAb/bille (4.1)

Nombre de billes dans le plug 20000 40000 [BSAb]injectee(pM ) 1 10 1 10

NBSAb/bille 5 50 2,5 25

Billes agrégées (%) 25,7 36,9 30,7 55,9 Réactivité (%) 2,6 0,4 6,1 1,2

Table 4.4 – Table représentant la réactivité des billes, calculée à partir des populations comptabilisées avec le cytomètre, selon la configuration de plug utilisé pour une capture en analyte supposée totale. Le taux de billes agrégées représente l’agrégation spécifique.

La réactivité des billes varie avec le nombre d’antigènes. Plus ce nombre est faible, plus la réactivité est importante (relation quasi linéaire). Si le nombre d’an- tigènes par bille est divisé par 10, la réactivité augmente de ce même facteur peu importe la quantité de billes initiale. Le nombre d’antigène par bille est le facteur déterminant.

Influence du temps de percolation sur la concentration en

analyte

Ce dispositif microfluidique, inspiré des colonnes chromatographiques de pré- concentration, doit permettre de faire passer continuellement des échantillons pour augmenter la concentration en antigène dans le plug. En théorie, la concentration initiale n’est plus limitante. Seul le temps d’attente détermine la concentration mi- nimale détectable. Trois temps de percolation d’échantillon sont testés. Nous nous focalisons sur la quantité de billes agrégées. Les résultats sont présentés figure 4.9.

Figure 4.9 –Evolution du taux de billes agrégées en fonction du temps de percolation d’une solution de BSAb à 10 pM avec un débit de 1 nL/s. Expérience réalisée par D. Lefebvre de Rieux.

Le signal varie linéairement avec le temps de percolation (pente de 0,7). Cette pente (inférieure à 1) montre que la réactivité diminue avec le temps de percola- tion. Ceci est à relier avec l’augmentation du taux d’agglutination non spécifique sans doute dû à l’échauffement au niveau des pointes magnétiques. Ainsi, plus le temps est long, plus le nombre de billes libres baissent, diminuant la réactivité. La diminution de la reproductibilité des mesures (augmentation de l’écart-type) en fonction du temps de percolation est également une conséquence de l’augmentation du bruit.

Le système microfluidique augmente la réactivité des billes, concentre à souhait et capture quasi-totalement l’antigène. Les principaux objectifs établis au com- mencement du projet européen sont remplis. Reste à déterminer la concentration minimale détectable en un temps court.