Discussions

Toutes ces expériences convergent vers une très faible réactivité des billes uti- lisées. Il s’avère que ces billes sont très poreuses. Leur surface comporte de nom- breuses aspérités ce qui diminue l’accessibilité des BSAb une fois liée à la surface de la bille. Le taux effectif de BSAb est donc très faible. La même analogie peut être faite avec les streptavidines greffées sur ces billes. Lorsque deux billes sont en regard, peu de streptavidines se trouvent dans une bonne configuration d’adhésion. De plus, le polymère utilisé pour encapsuler les billes diffère de celui des billes de 200 nm ce qui peut également gêner la reconnaissance spécifique via des répulsions stériques, électrostatiques, hydrophobes....

tecter la picomole. En choisissant un matériau mieux adapter, ayant une réactivité de quelques dizaines de pourcents, il est légitime de penser que la sensibilité en serait également augmentée. La dizaine de femtomoles pourrait être atteinte.

3.3 Conclusion

L’étude approfondie des paramètres colloïdaux n’a pu aboutir à l’amélioration de la sensibilité du test d’agglutination précédemment développé au laboratoire. La quantité de billes et leur design étaient en fait optimaux. L’unique possibilité d’évolution se situe au niveau de l’augmentation de la taille des billes qui per- mettrait d’augmenter le signal et de diminuer le bruit. Malheureusement, la taille optimale prédit par la théorie n’est pas disponible dans le commerce.

A la vue des simulations numériques des paramètres alpha et de la section efficace de diffusion d’un singulet en fonction du rayon des billes, nous nous aper- cevons que le signal chute uniquement à cause du paramètre alpha. Autrement dit, plus les billes sont grosses, plus l’intensité diffusée par un doublet égale celle de deux singulets. Une détection individuelle des billes nous permettrait de nous affranchir de ce paramètre. Ceci est possible grâce à la cytométrie en flux. Cette nouvelle méthode de détection, basée sur l’intensité diffusée par les billes, est théo- riquement plus sensible que la turbidimétrie car elle caractérise individuellement les objets et recueille simultanément deux signaux (en FSC et SSC). Malheureuse- ment, le gain en sensibilité n’a pu être clairement démontré car les billes utilisées se sont avérées peu réactives, du fait d’une porosité importante. Afin de continuer dans cette voie, les efforts doivent portés sur la recherche d’un matériau réactif. Une chose est certaine, l’utilisation de grosses billes est bénéfique car elles ampli- fient la lumière diffusée, repoussent les limites thermodynamiques liées aux faibles concentrations en analyte tout en travaillant avec de faibles quantités de billes et sans augmenter la cinétique de réaction.

Le prochain chapitre va porter sur ce dernier point, la cinétique de réaction car la recherche de sensibilité ne doit pas être au détriment du temps d’un test. Or, nous nous sommes aperçus que le temps de capture (temps de la 1ere _étape)

de notre test d’agglutination devenait très longs aux faibles concentrations en an- tigènes (figure 3.30). Cette première étape est en effet, soumise à la diffusion des antigènes contrairement à la deuxième où le champ magnétique permet de s’en af- franchir. Une solution serait d’amener directement l’antigène au contact des billes. Cette manipulation est possible avec les microsystèmes. A travers la collaboration européenne DetectHIV, un système microfluidique permettant la rétention de billes magnétiques à travers un canal microfluidique, tout en faisant passer un échan- tillon, a été mis au point par l’équipe de M. Gijs [59]. Les résultats obtenus sur ce système dans le cadre de ce réseau européen font l’objet du prochain chapitre, les autres résultats sont regroupés et présentés dans le dernier chapitre.

Un nouveau format fluidique pour

de meilleures performances

4.1 Introduction

Dans les années 90, le format microfluidique s’est avéré très prometteur pour atteindre des seuils de détection sensible notamment via des mesures d’absorbance et répondre au marché du point of care (test rapide, transportable et peu coûteux). Dans le cadre du projet européen DetecHIV, nous avons décidé d’utiliser ce format en vue de franchir les barrières cinétique et thermodynamique imposées par notre test d’agglutination magnétique. L’objectif est la détection du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) via la protéine p24, protéine de la capside, à un stade très précoce de l’infection. Une grande sensibilité de l’ordre de la fem- tomole (10−15_{M) est donc visée. La clef de voute de ce projet est un système de}

préconcentration inspiré de celui existant en chromatographie. En analytique, des supports spécifiques, constitués d’anticorps ou de cellules sous forme de cartouches, de colonnes ou de disques, sont élaborés en vue de retenir spécifiquement l’analyte cible lors du passage de l’échantillon. Ainsi, le composé d’intérêt est sélectionné parmi tous les interférants et concentré au fur et à mesure du volume percolé. Dans notre cas, ce système sélectif se compose de billes magnétiques sur lesquelles des anticorps sont greffés. Ces billes sont retenues très localement dans le canal

microfluidique sous forme de "tas" (figure 4.1) perméable à l’échantillon, appelé plug, rendant l’extraction de l’antigène et sa préconcentration possibles.

Figure 4.1 – Représentation schématique du principe de préconcentration en micro- fluidique

Un premier dimensionnement permet d’établir ce réel gain en concentration.