V ALIDATION DES HYPOTHESES

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O equilíbrio mutação-seleção corresponde à fase avançada da infecção viral, quando a população viral conseguiu se reestabelecer no ambiente do novo indivíduo, recuperando tamanho, diversidade genotípica e fenotípica afetados pelo evento de bottleneck. Essa fase inicia-se ao término do tempo de recuperação, e durante ela, a população viral apresenta carga viral estável (set point) [2, 41, 177, 178]. Nos gráficos da progênie por ciclo replicativo, diversidade fenotípica por ciclo replicativo, e taxa replicativa média por ciclo replicativo, o equilíbrio mutação-seleção compreende o intervalo representado pelo platô da curva.

Nos resultados da simulação computacional, o equilíbrio mutação-seleção caracteriza- se pela estabilidade da frequência relativa de partículas virais em cada classe replicativa (figura 33), e consequentemente, pela estabilidade do tamanho da progênie (figura 40), da diversidade fenotípica (figura 17), e da taxa replicativa média (figura 24).

Essa estabilidade é mantida por meio de um constante fluxo de partículas de uma classe replicativa para as classes replicativas vizinhas, devido à atuação das probabilidades mutacionais deletéria e benéfica. Embora determinada classe replicativa perca constantemente, pela atuação da probabilidade mutacional deletéria, uma porcentagem do seu total de partículas para a classe replicativa imediatamente inferior, essa porcentagem perdida é reposta pela atuação da mesma probabilidade mutacional deletéria sobre a classe replicativa imediatamente superior. Semelhantemente, quando a probabilidade mutacional benéfica é maior que zero, determinada classe replicativa perde constantemente partículas para a classe replicativa imediatamente superior, porém essa quantidade perdida é reposta pela atuação da mesma probabilidade mutacional benéfica sobre a classe replicativa imediatamente inferior. A probabilidade mutacional neutra, por sua vez, contribui para determinada classe replicativa manter uma porcentagem do seu total de partículas, produzindo progênie com a mesma capacidade replicativa. Tal fluxo contínuo mantém a frequência relativa de partículas em cada classe replicativa estável durante o equilíbrio mutação-seleção.

Comparando-se o modelo com a evolução viral, o fluxo contínuo de partículas entre as classes replicativas poderia refletir o incremento ou decremento, devido às taxas mutacionais e pressões do ambiente, da capacidade replicativa expressa pela progênie viral em relação à

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capacidade replicativa expressa pelo genoma viral molde. Poderia refletir também a vinculação, ou rede funcional de variantes, entre variantes virais na paisagem adaptativa, característica prevista pela teoria de quasispecies virais. Segundo a teoria de quasispecies virais, a frequência de determinado genótipo na população viral é influenciada não somente pela sua capacidade replicativa, mas também pela probabilidade de ele ser gerado de novo na população devido a mutações de genótipos vizinhos dele na paisagem adaptativa [3].

O tamanho da progênie, a diversidade fenotípica, e a taxa replicativa média alcançam maior ou menor valor durante o equilíbrio mutação-seleção, e apresentam diferente padrão de desenvolvimento durante o tempo de recuperação, dependendo das probabilidades mutacionais deletéria e benéfica, da capacidade replicativa máxima instantânea e do tamanho da populacional inicial. A capacidade replicativa máxima instantânea e o tamanho da populacional inicial são características predominantemente endógenas da população viral, pois são definidas, respectivamente, pela composição e quantidade das partículas virais transmitidas no evento de bottleneck. As probabilidades mutacionais deletéria e benéfica, além de representarem características endógenas da população viral, também representam fatores do ambiente intracelular e extracelular do hospedeiro. Sendo assim, características apresentadas pela população viral no equilíbrio mutação-seleção, e o padrão de desenvolvimento dela durante o tempo de recuperação, poderiam variar dependendo da resposta do hospedeiro à infecção.

Por exemplo, em um processo infeccioso marcado por forte resposta imunológica do hospedeiro, a população viral poderia se deslocar, via seleção, para regiões da paisagem adaptativa com diversidade fenotípica, tamanho da progênie e taxa replicativa média maiores. Esse deslocamento, além de possibilitar o escape ao sistema imunológico, poderia afetar atributos da progressão da infecção, como características clínicas de agudização ou cronificação.

Considerando que os vírus desenvolveram diversas estratégias para usar a maquinaria macromolecular e a energia do organismo hospedeiro para entrar na célula alvo, transcrever seus mRNAs, replicar seu genoma, transportar seu genoma até o núcleo celular, inibir a transcrição celular, empacotar suas proteínas, entre outras necessidades de seu ciclo

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replicativo [155], torna-se pertinente a hipótese de os vírus valerem-se, semelhantemente, das respostas do hospedeiro à infecção para alcançarem o patamar de diversidade, tamanho da progênie, e taxa replicativa média que melhor contribuiria para sua estabilização e transmissão.

Com probabilidade mutacional benéfica maior que zero, a população modelada se estabiliza preenchendo aproximadamente as mesmas classes replicativas, e apresentando o mesmo tamanho da progênie, diversidade fenotípica, e taxa replicativa média, independente da variação na capacidade replicativa máxima da população inicial (figuras 38, 44, 47). Estabelecendo paralelo com a evolução viral, tal resultado sugere que as taxas mutacionais da população viral, juntamente com a resposta do hospedeiro à infecção, poderiam constituir uma assinatura importante para determinar as características da população viral durante o equilíbrio mutação-seleção.

Com a probabilidade mutacional deletéria fixa, aumento na probabilidade mutacional benéfica em diferentes execuções da simulação ocasiona os seguintes efeitos sobre o equilíbrio mutação-seleção:

 O tamanho da progênie e a taxa replicativa média aumentam (figura 41, 46);

 A diversidade fenotípica aumenta até atingir um valor máximo, então diminui (figura 35);

 A classe replicativa com maior quantidade de partículas é a representada pela capacidade replicativa máxima instantânea Rmax (figura 49).

Com a probabilidade mutacional benéfica fixa, aumento na probabilidade mutacional deletéria ocasiona os seguintes efeitos sobre o equilíbrio mutação-seleção no modelo:

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 A diversidade fenotípica aumenta até atingir um valor máximo, então diminui (figura 37);

 Com probabilidade mutacional benéfica fixa em valor suficientemente baixo, a classe replicativa com maior quantidade de partículas é uma classe replicativa de valor intermediário em relação às classes replicativas ocupadas pela população, e não a classe representada pela capacidade replicativa máxima instantânea Rmax (figura 33).

Conforme a probabilidade mutacional benéfica aumenta, observa-se uma seleção das partículas da população viral favorecendo aquelas partículas com maior capacidade replicativa, ou seja, há a sobrevivência do mutante de maior fitness. Por outro lado, com a probabilidade mutacional benéfica suficientemente baixa, e conforme a probabilidade mutacional deletéria aumenta, observa-se um incremento das partículas da população viral com capacidade replicativa média, em detrimento do mutante de maior fitness. Juntamente com a sobrevivência do mutante de maior fitness observam-se características que poderiam ser associadas a um pior prognóstico, como aumento do tamanho da progênie, da diversidade fenotípica, e da taxa replicativa média [183, 184].

4.2.3 LIMIAR DA EXTINÇÃO

O limiar da extinção refere-se à fase da infecção viral em que a taxa mutacional é alta suficientemente para desestabilizar a população viral, evitando que ela alcance o equilíbrio mutação-seleção; e insuficientemente alta para induzir a extinção da população com absoluta certeza. Durante o limiar da extinção, incremento na taxa mutacional conduziria a população à extinção, enquanto decremento na mesma taxa permitiria a população alcançar o equilíbrio mutação-seleção.

No modelo, o limiar da extinção caracteriza-se pela variação da frequência relativa de partículas nas classes replicativas, do tamanho da progênie (figura 50), da diversidade

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fenotípica (figura 51), e da taxa replicativa média (figura 52); e pela possibilidade de eventual extinção da população ou sobrevivência dela por tempo indeterminado (figura 50, 53, 54).

Em paralelo com a evolução biológica viral, a variação observada no modelo corresponderia à impossibilidade da população viral de preservar, devido às altíssimas taxas mutacionais, capacidades replicativas maiores em relação às já expressas por ela. Capacidade replicativa maior que as já expressas pela população seriam geradas devido às mutações benéficas (quando presentes), porém a preservação delas seria impossibilitada, pois as partículas expressando as novas capacidades replicativas teriam dificuldade de gerar cópias fidedignas delas mesmas.

Observa-se no modelo, durante o limiar da extinção, uma correlação entre as frequências relativas de partículas nas classes replicativas, marcada pelo aumento da coerência da população, e pela propagação da mudança ocorrida na frequência relativa de uma classe replicativa para as demais classes replicativas. Comparando o resultado à evolução viral, essa forte correlação entre as classes replicativas ocorreria porque as altas taxas mutacionais tornariam a população sensível à flutuação na quantidade de partículas e capacidades replicativas durante o limiar da extinção. Assim, além do incremento das taxas mutacionais e pressões seletivas, flutuações estocásticas na quantidade de partículas da população ou nas capacidades replicativas podem ser decisivas para induzir a população à extinção durante o limiar da extinção.

Quando a extinção ocorre durante o limiar da extinção, geralmente o declínio no tamanho da população e no tamanho da progênie até atingir valor zero é súbito, isto é, demanda poucos ciclos replicativos para ocorrer em comparação à quantidade total de ciclos replicativos que a população permaneceu evoluindo (figuras 53, 54). A extinção ocorreria subitamente durante o limiar da extinção devido à forte correlação existente entre as classes replicativas, com o declínio na quantidade de partículas sofrido por uma classe replicativa sendo rapidamente propagado para as demais classes replicativas.

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A mutagênese letal corresponde à fase da infecção viral em que o processo de extinção da população viral é induzido pelas altas taxas mutacionais. A mutagênese letal é tanto uma proposta de estratégia terapêutica antiviral, quanto um mecanismo de defesa natural da célula [13, 96, 106, 111, 116].

No modelo, o processo de mutagênese letal caracteriza-se pela variação das classes replicativas da população, com preenchimento paulatino das classes replicativas inferiores, e perda das classes replicativas superiores (figura 55); aumento do tamanho da progênie e da diversidade fenotípica nos primeiros ciclos replicativos, com declínio nos demais ciclos replicativos (figuras 56, 58); e declínio da taxa replicativa média (figura 57).

Mesmo em processo de extinção, o tamanho da progênie e a diversidade fenotípica aumentam nos primeiros ciclos replicativos porque a população inicial se replica, aumentando de tamanho e ocupando maior quantidade de classes replicativas, antes de a população começar a gerar partículas com capacidade replicativa zero. Conforme maior quantidade de partículas com capacidade replicativa zero é gerada e as capacidades replicativas superiores são perdidas, o tamanho da progênie e a diversidade fenotípica da população diminuem até atingir valor zero. A taxa replicativa média apresenta declínio durante o processo de extinção porque, devido à alta probabilidade mutacional deletéria, as capacidades replicativas geradas pela população são inferiores em relação à expressa pela população inicial.

Aumento na probabilidade mutacional deletéria diminui a quantidade de ciclos replicativos necessários para a extinção ocorrer, enquanto aumento na probabilidade mutacional benéfica pode evitar a extinção da população. E quanto maior a capacidade replicativa máxima instantânea da população viral, maior a probabilidade mutacional deletéria mínima para extinção da população (figura 59). Aplicando à evolução viral, aumento na taxa mutacional deletéria, ou no conjunto de pressões do organismo hospedeiro, reduziria o tempo necessário para extinção da população porque diminuiria a quantidade de partículas virais viáveis, e diminuiria consequentemente a possibilidade de a população gerar capacidades replicativas maiores que as já expressas por ela. Aumento na taxa mutacional benéfica, ou

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diminuição de pressões do organismo hospedeiro, pode evitar a extinção da população ao possibilitar a produção de capacidades replicativas maiores.

No modelo, variação na quantidade de partículas da população inicial não evita a extinção, apenas aumenta ou diminui a quantidade de ciclos replicativos necessários para a extinção ocorrer (figura 60). Na evolução da população viral, aumento na quantidade de partículas da população inicial pode diminuir a chance de extinção porque essa população conteria maior variação genotípica, o que favoreceria o surgimento de novos fenótipos conforme a população se replicar. Pela fórmula de extinção proposta por Bull e colaboradores [31], na ausência de mutações benéficas, a população se torna extinta quando a taxa de mutação deletéria for suficientemente alta para que a relação (1 – p) Rmax < 1 seja satisfeita.

Na presença de mutações benéficas, desde que a probabilidade q seja suficientemente baixa, uma relação análoga à de Bull e colaboradores também existe, estabelecendo uma condição de mutagênese letal mesmo na presença de efeitos adaptativos sobre a população viral [190].

Com a probabilidade mutacional benéfica igual a zero, a população não consegue, evidentemente, alcançar capacidade replicativa máxima instantânea maior que a capacidade replicativa máxima da população inicial. Sendo assim, para a sobrevivência de uma população viral, as partículas virais transmitidas para o novo organismo hospedeiro via evento de bottleneck precisariam conter capacidade replicativa máxima instantânea compatível com as taxas mutacionais e demais pressões que a população viral será exposta. Por outro lado, como no início da infecção viral há menor resposta específica do organismo hospedeiro, as partículas virais transmitidas no evento de bottleneck poderiam ser favorecidas ao encontrar um ambiente com maior disponibilidade relativa de recursos e menor pressão seletiva.

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5. CONCLUSÕES

5.1 Novas Contribuições

Entre as novas contribuições do presente trabalho, destacam-se:

1. Desenvolvimento de um modelo fenotípico de evolução viral para estudar aspectos da dinâmica evolutiva de vírus RNA no ambiente do hospedeiro;

2. Desenvolvimento de um software de simulação computacional personalizado para o modelo;

3. Compilação dos dados obtidos com a simulação computacional do modelo;

4. Descrição do modelo como um processo de ramificação de Galton-Watson;

5. Apresentação de um critério analítico para o estudo do tempo de recuperação.

5.2 Perspectivas Futuras

O presente trabalho representa, para os membros envolvidos com a concepção e implantação do mesmo, o início de uma linha de pesquisa que visa estudar a evolução dos vírus RNA utilizando como instrumental metodológico a modelagem computacional e matemática. Trata-se de uma linha de pesquisa consolidada em algumas instituições de pesquisa da Europa e Estados Unidos, com importantes resultados publicados, e em constante debate e colaboração internacionalmente [3-6, 27, 28, 31, 174].

Pretende-se submeter o conteúdo desenvolvido pelo presente trabalho a periódicos especializados em forma de três artigos: um artigo abordando a descrição matemática do

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modelo, um artigo abordando as possíveis implicações biológicas dos resultados, e um terceiro descrevendo o software de simulação. Pretende-se também descrever matematicamente o modelo fenotípico completo assim como foi descrito matematicamente o modelo fenotípico simplificado (tópico 4.1), e submeter para publicação os resultados relevantes obtidos.

O prosseguimento do trabalho far-se-á desenvolvendo um modelo genotípico para estudo da evolução dos vírus RNA. Esse modelo conterá representação dos genomas de cada partícula da população viral, os quais poderão ser definidos, por exemplo, usando sequências de nucleotídeo ou aminoácido disponíveis em banco de dados públicos, ou sequências de nucleotídeo ou aminoácido artificiais, criadas pelo usuário especificamente para os propósitos da simulação. As mutações corresponderão às substituições de base que eventualmente ocorrerão nas sequências durante a replicação. O ambiente no qual a população evoluirá poderá, conforme propósito e desenho da simulação, representar aspectos estruturais, funcionais e dinâmicos de componente celular, molecular e espacial que sugiram correspondência a componente biológico do organismo hospedeiro. A capacidade replicativa, e outras características fenotípicas da população viral que sejam apropriadas a modelagem, serão expressão da informação contida nos genomas de cada partícula, e da interação entre os fenótipos de cada partícula e os componentes do ambiente.

Com esse modelo implantado em um software de simulação computacional personalizado, tornar-se-á possível projetar uma variedade de experimentos de modelagem, e extrair para análise uma ampla quantidade de dados, como, por exemplo, as sequências de nucleotídeo ou aminoácido de toda a população em determinado ciclo replicativo, as quais podem ser analisadas em ferramentas de análise filogenética. O acompanhamento detalhado da evolução dos componentes modelados computacionalmente poderá, assim como ocorreu com o estudo do modelo fenotípico realizado pelo presente trabalho, fornecer subsídio para a modelagem matemática dos componentes.

A finalidade de tais estudos, tanto o relacionado ao modelo fenotípico, quanto os relacionados ao modelo genotípico, não é descrever detalhadamente como a evolução dos vírus RNA ocorre, mas sim compreender os motivos pelos quais certas regularidades são observadas. Espera-se que as predições teóricas propostas por eles possam, sobretudo,

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contribuir para a interpretação de resultados experimentais obtidos e sugerir novos experimentos, os quais podem ser usados para refinar os estudos teóricos.

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