Utilisation de lysats cellulaires

Le premier test in vitro permettant de mesurer quantitativement des activités de la

NER à partir de lysats cellulaires a été décrit par R. Wood en 1988 (Wood et al., 1988). Cette méthode tire profit, tout comme la méthode UDS, de l’étape de resynthèse d’ADN lors de la NER pour incorporer, dans un plasmide comportant une lésion, un nucléotide marqué radioactivement. Les plasmides sont ensuite précipités et linéarisés par l’action d’enzymes de restriction, puis une électrophorèse sur gel d’agarose permet de séparer les différents fragments d’ADN générés par l’action des enzymes du lysat cellulaire. Enfin, une autoradiographie permet de quantifier la radioactivité incorporée lors de la réparation des plasmides. Afin de visualiser la resynthèse spécifiquement due à la réparation, la même réaction est réalisée avec un plasmide non endommagé. La radioactivité incorporée dans le plasmide exempt de dommage permet d’évaluer la part de la réparation dite « gratuite » dans la réaction de réparation in vitro. Il est important de tenir compte de cette réparation non spécifique pour pouvoir comparer des activités de réparation de plusieurs lysats. Par exemple, il a déjà été montré qu’un lysat préparé à partir de cellules XPA entraîne plus de coupures

Réactif Concentration lors de l'excision-resynthèse Hepes KOH pH 7.8 45 mM MgCl2 7.4 mM DTT 0.9 mM dGTP 20 µM dATP 8 µM dTTP 20 µM dCTP 20 µM glycerol 3.4 % phosphocréatine 40 mM EDTA 0.4 mM créatine phosphoKinase 50 µg/mL BSA 0.36 mg/mL KCl 70 mM ATP 2 mM dATP radiomarqué 74 kBq

Extrait cellulaire (total) de 1,6 à 3 mg/mL

Temps de la réaction 3h

Température de la réaction 30°C

Tableau 6 : Les conditions expérimentales lors du test d’excision- resynthèse in vitro de référence. Adapté de Wood et al., 1988

aspécifiques qu’un lysat préparé à partir de cellules saines (Hansson et al., 1989). De plus, dans les lysats obtenus à partir de cellules XP, le niveau d’incision du plasmide endommagé est fortement réduit par rapport à celui d’un lysat de cellules saines (Masutani et al., 1993). Néanmoins, le niveau n’est pas nul.

Les conditions ioniques lors de la réaction d’excision-resynthèse à partir de lysats cellulaires sont très importantes. Ainsi, la réaction nécessite des ions Mg2+ (Sugasawa et al., 1993; Calsou et al., 1996a). En effet, les ions Mg2+ sont indispensables pour l’activité des polymérases ; les réactions consommant de l’ATP ont besoin de Mg2+. De plus, la concentration en KCl est également très importante pour le bon fonctionnement de la réaction. La concentration en KCl a été testée plusieurs fois dans la littérature et les résultats sont assez semblables : entre 25 mM et 70 mM, il n’y a pas d’effet notoire sur la réparation alors qu’à 100 mM, 50% d’inhibition de la réparation a été observée et celle-ci devient totale à 150 mM (Sugasawa et al., 1993; Calsou et al., 1994). La concentration saline influe sur la processivité des facteurs de la NER. Le caractère processif de l’activité endonucléasique est maximal lorsque la concentration en sel est nulle (Gruskin et al., 1986). Quand la concentration augmente, la processivité diminue pour aller vers un mécanisme distributif. Pour résumer, la réaction d’excision se fait généralement en ajoutant de l’ATP (Calsou et al., 1994) ainsi que des ions Mg2+ et en ajustant la concentration en KCl (Tableau 6).

La lésion portée par le plasmide peut être introduite de différentes manières, soit en incorporant dans le plasmide un oligonucléotide de synthèse comportant une ou plusieurs lésions, soit en traitant les plasmides chimiquement ou avec un rayonnement. Dans le second cas, la position et le nombre de lésions par plasmide sont plus délicats à contrôler.

Enfin, G.L. Dianov a montré que cette méthode est aussi utilisable pour mesurer la réparation par excision de base, en tirant partie, là aussi de l’étape de resynthèse d’ADN (Dianov 2003). En effet, la réparation des lésions oxydatives comme la 8-oxoG a été étudiée à partir de lysats cellulaires. Alors que la réparation de cette lésion semble diminuée dans des lysats XPA et XPB, elle est augmentée dans un lysat XPD et CSA (Jaiswal et al., 1998). Ceci renforce l’idée de l’existence d’interactions entre les systèmes BER et NER.

Ce test in vitro à partir de lysat cellulaire, présente l’avantage d’être particulièrement sensible, mais l’utilisation de la radioactivité peut être aussi considérée comme un inconvénient. La structure de l’ADN utilisé lors de telles expériences semble également jouer

un rôle non négligeable. Ainsi, lorsque l’ADN endommagé est « nu », les lysats XPA et témoin présentent les mêmes niveaux d’excision des dimères de thymine (Mortelmans et al., 1976). Cependant, lorsque que l’ADN est sous une forme plus proche de ce qui est trouvé in

vivo (ie. organisation en nucléosome), la réparation des lysats XPA est cette fois-ci diminuée

par rapport au lysat contrôle.

Des tests in vitro, permettant de mesurer uniquement l’excision, ont également été développés ; ces tests s’intéressent principalement aux activités glycosylases de la BER. Le principe est tout d’abord de marquer radioactivement à une de ses extrémités, un oligonucléotide double brin portant une lésion. L’oligonucléotide est ensuite incubé avec des lysats cellulaires ou des enzymes de réparation purifiées. Si au cours de cette étape une excision a lieu, alors l’oligonucléotide portant la lésion est coupé en deux. Une électrophorèse sur gel d’acrylamide dénaturant suivie d’une autoradiographie du gel permettent de conclure quant à l’incision du dommage. Si une incision a eu lieu, deux bandes distinctes seront observées, une correspondant à l’oligonucléotide portant la lésion non excisée, et l’autre correspondant au fragment d’oligonucléotide formé lors de l’excision. Il est alors possible de calculer des rendements réactionnels en quantifiant la radioactivité présente dans chaque bande (Guerniou et al., 2005). En connaissant la quantité d’oligonucléotide excisé et non excisé, le calcul de constantes enzymatiques est également envisageable.

De façon générale, les tests in vitro à partir de lysats cellulaires présentent l’avantage de pouvoir étudier la réparation dans des tissus très différents : tissus humains (fibroblastes, lymphoblastes, lignées HeLa etc.) (Mortelmans et al., 1976; Hansson et al., 1989; Sibghatullah et al., 1989; Calsou et al., 1994; Barret et al., 1996), tissus murins (Coudore et

al., 1997), mais aussi de tester différents compartiments cellulaires en récupérant les protéines

à différents moments de l’extraction (lysats totaux, cytoplasmiques, nucléaires, mitochondriaux) et enfin de tester un grand nombre de types de lésions. De plus, il est assez facile d’étudier l’effet d’addition de molécules, par exemple inhibitrices, aux lysats cellulaires et de tester ensuite leur activité de réparation.