Systèmes reconstitués avec des protéines purifiées

Pour finir sur les méthodes permettant d’étudier la réparation, nous allons voir comment un système de réparation peut être reconstitué in vitro à partir de protéines purifiées. Dans ce cas, les protéines sont connues, la réaction est totalement maîtrisée. Ce type de méthode permet une mesure qualitative de la réparation, et non quantitative comme avec un lysat cellulaire.

Les systèmes reconstitués réunissent généralement un plasmide, contenant un type de lésion et un mélange de protéines purifiées. Lorsque les facteurs hHR23B/XPC, TFIIH, RPA, XPA, XPG, ERCC1/XPF sont présents dans le mélange, la double incision du brin endommagé a lieu (Aboussekhra et al., 1995; Araujo et al., 2000; Tapias et al., 2004). Dès qu’un des facteurs est absent, la réaction n’a plus lieu. Grâce à ces expériences utilisant un système reconstitué de protéines purifiées, les 6 facteurs essentiels à la voie NER ont donc pu être identifiés. Ces expériences avec des protéines purifiées ont permis de mettre en évidence le rôle annexe de DDB2 dans la NER puisque la voie de réparation peut être reconstituée sans cette protéine (Aboussekhra et al., 1995). Les systèmes reconstitués ont été testés sur plusieurs types de dommages : des plasmides irradiés (Aboussekhra et al., 1995), des plasmides traités par du psoralène créant des pontages inter-brins (Bessho et al., 1997) ou des plasmides traité par du cisplatine créant des pontages intra-brins (Araujo et al., 2000; Tapias

et al., 2004).

Le principal avantage de cette méthode est la facilité de la mise en œuvre des expériences. La réaction peut être très bien contrôlée puisque tous les composants sont connus et purifiés. Cependant, l’utilisation d’un système purifié est quelque peu simpliste par rapport à ce qui se passe réellement dans la cellule. Comme nous l’avons vu précédemment, les réactions mises en jeu lors de la NER font intervenir une multitude de facteurs dans un contexte particulier qui est l’organisation chromatinienne de l’ADN. La reconstitution du système NER avec des protéines purifiées à été réalisée par Araki et al. en utilisant comme support un mini-chromosome à la place d’un plasmide bactérien. La double incision a également lieu en présence des six facteurs décrits précédemment mais il semblerait que la structure chromatinienne influerait sur le déroulement de la réaction (Araki et al., 2000). De nombreuses interactions ont également lieu entre les différents facteurs ; celles-ci n’ont vraisemblablement pas lieu lors d’expériences d’excision avec un système purifié. En étudiant la réparation d’un brin transcrit, Laine et Egly obtiennent seulement 1% d’excision du dommage (Laine et al., 2006b). Cette très faible activité obtenue peut être expliquée en partie par l’absence de facteurs essentiels dans le mélange de protéines purifiées.

Le diagnostic du Xeroderma pigmentosum, maladie génétique de la réparation de l’ADN, fait appel classiquement à la méthode UDS, décrite dans le chapitre I. Cette méthode mesure l’incorporation de nucléotides radiomarqués dans l’ADN de fibroblastes exposés aux UV. Les fibroblastes sont d’abord mis en culture à partir d’une biopsie de peau, réalisée chez le patient. Cette première étape nécessite plusieurs semaines avant d’avoir suffisamment de cellules pour réaliser le test. Le test UDS, lui-même, requiert plus d’une semaine avant d’avoir le résultat. Ainsi, le diagnostic de cette maladie est long et les résultats sont quelques fois difficilement interprétables. En effet, il arrive que la mesure UDS donne un niveau de réparation intermédiaire c’est-à-dire inférieur à ce qui est mesuré dans des cellules normales mais supérieur à ce qui est observé dans des cellules XP, utilisées comme référence. Il est alors difficile de conclure quant au diagnostic de la maladie.

La réparation de l’ADN regroupe un ensemble de mécanismes faisant intervenir un grand nombre de protéines et où de nombreuses interactions entre les différentes voies de réparation ont été mises en évidence. Ainsi, de nombreuses implications de protéines de la NER dans la réparation des lésions prises en charge par la BER (CF Chapitre I) ont notamment été décrites. Cependant, malgré cette complexité, la réparation est, généralement appréhendée dans les tests in vitro et in vivo de manière assez simpliste. En effet, la réparation d’un seul type de lésion est la plupart du temps analysée. Par exemple, le test UDS mesure globalement la réparation des lésions (photoproduits et dommages oxydatifs) générées par l’irradiation ultraviolette.

Nous sommes donc partis de deux constats. D’un côté, le diagnostic de la maladie XP est long et dans certains cas, peu concluant, et d’un autre côté il n’existe pas de test, permettant d’appréhender la complexité de la réparation à savoir les spécificités des différentes voies, leurs relations ou interactions, les co-régulations pouvant exister entre les différentes voies. Le but initial du projet, bâti à partir des données de la littérature, consistait donc à mettre au point les conditions expérimentales pour développer un outil rapide et fiable pour le diagnostic de la maladie XP.

Pour cela, nous utilisons les tests in vitro développés au laboratoire. Ces tests permettent la quantification précise des activités d’excision des ADN N-glycosylases (puce oligo) ou d’excision-resynthèse (puce plasmide) à partir de lysats cellulaires. Le principal avantage de nos tests, par rapport à l’UDS et au test in vitro de référence décrit dans la littérature (Wood et

al., 1988), est la mesure simultanée d’activités de réparation de plusieurs lésions à partir du

réparation pour des lésions prises en charge par deux voies de réparation différentes : la BER (Base Excision Repair) et la NER (Nucleotide Excision Repair) et nous permet donc d’avoir une vision à la fois globale et spécifique de la réparation.

Nous avons mesuré de façon conjointe des activités de réparation de plusieurs lésions, fixées sur un support, afin d’obtenir une cartographie de la réparation de l’ADN propre à chaque groupe de complémentation XP. L’objectif était d’arriver à proposer des phénotypes de réparation de l’ADN à partir de peu de cellules afin de pouvoir rendre une réponse au patient plus rapidement qu’avec la méthode UDS.

Notre défi consistait donc à être capable de quantifier des activités de réparation à partir d’un nombre réduit de cellules (quelques millions) et donc de quantités de protéines relativement limitées par rapport à ce qui est décrit dans la littérature. C’est pourquoi nous avons débuté l’étude avec des concentrations protéiques réalistes, c'est-à-dire obtenues facilement à partir d’un nombre gérable de boites de culture. Nous avons choisi de débuter le projet en utilisant des cellules HeLa siRNA modélisant la maladie XP. Les premiers résultats obtenus à partir de ce modèle cellulaire nous ont amenés à revoir notre stratégie.

Nous nous sommes, en effet, rendus compte de la difficulté à caractériser des phénotypes de réparation de l’ADN pour les différents XP. Contrairement à ce qui était décrit dans la littérature, nous n’obtenions pas des signatures en termes d’activités de réparation bien distinctes entre un lysat témoin et un lysat XP.

Ainsi, nous avons cherché à identifier ce qui pouvait être à l’origine des ces résultats surprenants. Il s’agissait avant tout de comprendre quels étaient les mécanismes réactionnels mis en jeu lors de nos tests sur support.

Nous avons ainsi testé l’effet de plusieurs paramètres pour tenter d’expliquer les résultats des caractérisations phénotypiques de la réparation dans le but d’aboutir à des phénotypes spécifiques de chaque groupe XP. Nous avons, donc, analysé l’effet de la concentration protéique lors de l’excision-resynthèse ainsi que la réponse cellulaire à des traitements génotoxiques de différente nature, en termes d’activités de réparation et ce pour les différentes lignées cellulaires (XP et témoin).

Les résultats présentés dans ce manuscrit s’articulent en trois parties. La première partie introductive, permet de définir certains termes employés et de clarifier le principe de nos tests par rapport au test in vitro de référence, décrit dans la littérature (Wood et al.,

1988). La deuxième partie traite de l’étude préliminaire réalisée à partir du modèle siRNA. Enfin, la troisième partie, plus conséquente, montre l’ensemble des résultats obtenus avec des lignées de fibroblastes. Nous analyserons alors, comment les variations de certains paramètres ont des conséquences marquées sur les activités de réparation mesurées avec la puce plasmide (concentration protéique, temps de la réaction, lysat total vs nucléaire, réponse à un traitement génotoxique). Cette étude nous renseignera quant aux rôles de XPA et XPC sur la régulation dynamique des activités d’excision/resynthèse.