Utilisation des cellules souches pluripotentes

2.1. Origine et propriétés des cellules ES et iPS

Cellules ES

Les cellules ES ont d’abord été mises en évidence chez la souris [155, 156] puis chez l’homme [157]. Ces cellules dérivent de la masse cellulaire interne d’un embryon au stade blastocyste et sont caractérisées de pluripotentes. Elles peuvent donc se différencier dans de nombreux types cellulaires constituant l’organisme et notamment en précurseurs hématopoïétiques [158-161]. Ces cellules sont également capables de s’auto-renouveler de façon illimitée.

Cellules iPS

Les cellules iPS, découvertes en 2006 et ne nécessitant pas la destruction d’un embryon, semblent être une source cellulaire inépuisable possédant les mêmes capacités de différenciation que les cellules ES. Il serait donc possible de reprogrammer des cellules adultes pour les rendre proches des cellules ES. Les premiers travaux réalisés sur des fibroblastes de souris ont suggéré comme combinaison optimale à cette reprogrammation les facteurs OCT4, SOX2, KLF4 et c-myc [162]. Cette technique a pu être transposée chez l’homme avec une reprogrammation des fibroblastes visibles en 10 jours [163, 164]. Par

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ailleurs, bien que l’efficacité d’une reprogrammation réalisée sans la surexpression de l’oncogène diminue de 40%, des travaux ont prouvé la capacité de reprogrammer des fibroblastes en n’utilisant que 3 facteurs [165, 166]. Parallèlement à ces données, une équipe a proposé comme combinaison les facteurs OCT4, SOX2, NANOG et LIN28- permettant ainsi de s’affranchir de l’utilisation de l’oncogène c-myc [167]. Plus récemment, une équipe a proposé une nouvelle combinaison de 4 facteurs pour la reprogrammation des iPS: Sall4, Nanog, Esrrb et Lin28. Cette combinaison apparaît également comme favorable à l’obtention d’iPS présentant des caractéristiques biologiques nécessaires à leur redifférenciation [168]. Actuellement, il est possible de générer des lignées d’iPS à partir de nombreux types cellulaires et notamment de cellules humaines CD34+ [169-171].

2.2. Protocoles de génération de mégacaryocytes à partir de

cellules souches pluripotentes

Plusieurs travaux menés chez la souris ont montré la possibilité de différenciation in

vitro des cellules ES ou iPS en MK jusqu’à l’étape ultime de production plaquettaire. Afin

d’obtenir une différenciation mégacaryocytaire et surtout, une production plaquettaire optimale, différentes protocoles ont été proposés [159, 172, 173].

La première étude réalisée chez l’homme a permis de différencier les cellules ES en MK CD41+/CD42b+ mais n’a pas permis de produire des plaquettes [174]. En adaptant ce protocole par combinaison de différents facteurs tels que des cellules nourricières (OP9, CH10T1/2) ou des cytokines (VEGF, TPO, SCF), une équipe a non seulement montré que la formation de sacs ES permettait de concentrer les progéniteurs hématopoïétiques CD34+/CD43+/CD45+ mais également que ces progéniteurs étaient capables de se différencier en MK fonctionnels (expression du CD41, du CD42b, développement du DMS …) générant de nombreuses proplaquettes et plaquettes [175]. Ce protocole a également été utilisé à partir de cellules iPS et de la même manière, a permis de générer un grand nombre de plaquettes in vitro [146]. D’autres travaux ont montré qu’il était possible de générer des progéniteurs hématopoïétiques à partir de cellules pluripotentes sans utilisation de « feeder » (cellules nourricières). D’autres auteurs ont précisé qu’une production

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plaquettaire adéquate n’était pas encore envisageable sans cette couche nourricière ou certains de ces constituants. Notamment, en absence de cette couche nourricière, peu de plaquettes présentent le CD42b à leur surface. Les rendements de production plaquettaire apparaissent également peu favorables à une utilisation de ces plaquettes pour des tests fonctionnels [176]. D’autre part, dans le but de s’affranchir de la formation variable et instable des corps embryoïdes (formation induite en l’absence d’une couche de cellules nourricières), l’équipe de GJ. Murphy a utilisé le protocole du Matrigel® (support de culture composé d’un grand nombre de protéines) pour induire la différenciation des iPS. En combinaison avec de nombreuses cytokines (VEGF, BMP4, TPO, SCF, IL-6, EPO, BMGF), ce protocole permet d’induire une expansion importante des progéniteurs hématopoïétiques et à terme, une différenciation érythrocytaire et mégacaryocytaire [177].

Les plaquettes dérivant de la différenciation des cellules pluripotentes présentent des caractéristiques similaires à celles des plaquettes sanguines (morphologie, expression du CD42b, du CD42a, de GPVI) mais de façon bien plus intéressante, l’intégrine αIIbβ3, essentielle pour l’agrégation plaquettaire, peut être activée en réponse à des agonistes. Ces plaquettes sont également capables d’intervenir dans la formation d’un thrombus in vivo [146, 176]. Ces données suggèrent donc que les plaquettes générées in vitro à partir de cellules iPS présentent les mêmes caractéristiques que les plaquettes sanguines.

En étudiant différentes combinaisons de facteurs de reprogrammation, une équipe a mis en évidence le rôle de c-myc dans la différenciation mégacaryocytaire et la production plaquettaire à partir de cellules iPS. c-myc promeut l’engagement des iPS dans le lignage mégacaryocytaire en favorisant la prolifération mais apparaît comme inhibiteur de la production plaquettaire [146]. Une expression transitoire de c-myc au cours de la différenciation mégacaryocytaire à partir d’iPS serait donc une approche intéressante afin d’améliorer le rendement plaquettaire (Figure 13).

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Figure 13: Schéma d’expression de c-myc pour la production plaquettaire à partir d’iPS

(Adaptée de [153])

Abréviation: HDF, fibroblaste dermique humain.

Récemment, une équipe a montré la possibilité d’établir des MK immortalisés à partir de cellules pluripotentes (ES et iPS). En effet, en respectant une hiérarchie dans l’expression ou l’extinction de 3 facteurs (c-myc pour promouvoir la prolifération, BMI1 et BCL-XL pour supprimer la sénescence et l’apoptose), il est possible de générer une lignée de MK immortalisés pouvant s’auto-renouveler pendant plusieurs mois [178] (Figure 14). L’arrêt de l’expression de ces facteurs conduit à une production de plaquettes fonctionnelles in vitro et

in vivo similairement aux plaquettes sanguines. Cette lignée de MK immortalisés représente

une source potentielle pour la production illimitée de plaquettes.

Figure 14: Implication de c-myc, BM1 et BCL-XL dans l’obtention d’une lignée mégacaryocytaire immortalisée (Adaptée de [178])

L’action parallèle de BMI1 et BCL-XL supprime l’effet pro-apoptotique de c-myc permettant ainsi de maintenir la prolifération cellulaire et d’obtenir une lignée MK immortalisée. Abréviations: BCL- XL, grand lymphome cutané à cellules B; BMI1, région 1 homologue d’insertion du Mo-MLV dans les lymphomes cutanés à cellules B.

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CHAPITRE 2:THROMBOPOÏESE ET PLAQUETTES SANGUINES

La thrombopoïèse constitue l’ensemble des mécanismes permettant au MK mature de produire des plaquettes sanguines nécessaires aux processus d’hémostase et de thrombose. La thrombopoïèse démarre dans la niche vasculaire de la moelle osseuse en contact avec les vaisseaux sinusoïdes et se termine dans la circulation sanguine. Ce chapitre a pour but de définir ce processus de thrombopoïèse et de décrire succinctement les plaquettes sanguines et leurs fonctions.