Utilisation de vecteurs glucuronylés dendritiques

L'augmentation du nombre de molécules actives libérées après une seule activation enzymatique est une alternative extrêmement intéressante afin de pallier la faible quantité ainsi que la faible activité de la β-glucuronidase présente dans le microenvironnement tumoral. Ce concept a été développé dès 2003 par les groupes de Shabat61et De Groot62. Ces deux équipes ont montré qu'il était possible de libérer plusieurs agents actifs après l'activation chimique d'un dendrimère auto-immolable. Ces dendrimères sont généralement constitués d'une gâchette connectée à une arborescence d'espaceurs auto-immolables au bout desquels se trouvent des agents actifs. Ainsi, après activation de la gâchette par un stimulus associé à la tumeur, les espaceurs vont se décomposer pour aboutir à la libération de l'ensemble des molécules d'intérêts (Figure 24).

Figure 24 - Architecture d'un dendrimère auto-immolable et processus de libération des drogues.

Notre groupe a développé des vecteurs dendritiques ciblant la β-glucuronidase surexprimée naturellement dans le microenvironnement des tumeurs solides. A ce titre, le vecteur glucuronylé 28 a été conçu afin de libérer deux molécules de doxorubicine après une seule hydrolyse enzymatique (Figure 25).63Ce vecteur est composé d’un espaceur identique à celui utilisé pour HMR 1826 assurant une bonne reconnaîssance enzymatique du glucuronide et d’un amplificateur de type 2,4-bis-(hydroxyméthyl)aniline servant de point d'ancrage aux deux molécules de doxorubicine.

61 (a) Amir, R. J.; Pessah, N.; Shamis, M., Shabat, D. Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 4494-4499. (b) Haba, K.; Popkov, M.; Shamis, M.; Lerner, R. A.; Barbas, C. F., III; Shabat, D. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 716-720. (c) Erez, R.; Segal, E.; Miller, K.; Satchi-Fainaro, R.: Shabat, D. Bioorg. Med. Chem. 2009, 17, 4327-4335. (d) Shamis, M.; Lode, H. N.; Shabat, D. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 1726-1731.

62 de Groot, F. M. H.; Albrecht, C.; Koekkoek, R.; Beusker, P. H.; Scheeren, H. W. Ang. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 4490-4494.

63 Grinda, M.; Clarhaut, J.; Renoux, B.; Tranoy-Opalinski, I.; Papot, S. MedChemComm 2012, 3, 68-70.

Gâchette Espaceur Espaceur Espaceur Drogue Drogue Drogue Drogue 1) Activation de la gâchette 2) Décompostion des espaceurs

Gâchette

Espaceur Drogue

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Ainsi, l'activation sélective de la gâchette dans le microenvironnement tumoral déclenche la décomposition spontanée du premier espaceur via une élimination 1,6 pour libérer l'aniline 29. Cet intermédiaire va alors subir une nouvelle élimination 1,6 (ou 1,4) afin de libérer une première molécule de doxorubicine. L'aniline 31 est régénérée dans les conditions physiologique à partir de la méthylène azaquinone 30 et subit une élimination 1,4 (ou 1,6) pour aboutir à la libération de la deuxième molécule de doxorubicine.

doxorubicine doxorubicine doxorubicine doxorubicine doxorubicine doxorubicine H2O doxorubicine + H₂O doxorubicine + ! " "

Figure 25 - Structure du dimère 28 et mécanisme de libération de la doxorubicine

Le vecteur 28 est stable sur une période de 10 jours lorsque celui-ci est incubé dans du tampon phosphate à 37°C. Aucune dégradation n'a été observée lorsque le vecteur est placé dans du sérum de boeuf pendant 24h. De plus, l'hydrolyse enzymatique du vecteur 28 en présence de β-glucuronidase conduit à la libération des deux molécules de doxorubicine en moins de 6 heures.

La cytotoxicité du vecteur glucuronylé 28 a été testée sur des cellules cancéreuses du poumon de type H661 en comparaison avec le vecteur monomérique de la doxorubicine HMR-1826. En absence de β-glucuronidase, 28 ne présente pas de toxicité à la plus forte dose

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testée de 1 µM. Cependant, en présence de l'enzyme, le vecteur dimérique 28 présente une cytotoxicité deux fois supérieure à celles enregistrées pour HMR 1826 et la doxorubicine utilisée seule (IC5028 : 110 nM ; IC50HMR 1826 : 280 nM ; IC50doxorubicine : 250 nM).

Comme nous l’avons vu, ce système permet de libérer de manière efficace deux molécules de doxorubicine après une seule activation enzymatique. L’évaluation in-vitro de l’activité antiproliférative du vecteur 28 a montré, que celui-ci était deux fois plus toxique que HMR 1826 en présence de la même quantité de β-glucuronidase.

Notre groupe a ensuite entrepris la synthèse de vecteurs glucuronylés hétérodimériques afin de véhiculer simultanément deux agents actifs présentant des modes d'actions différents. Ainsi, le vecteur 32 permet de libérer, après une seule hydrolyse enzymatique, une molécule de doxorubicine et une molécule de MS-275 (Figure 26).64

Figure 26 - Structure et décomposition de l'hétérodimère 32

64 Grinda, M.; Clarhaut, J.; Tranoy-Opalinski, I.; Renoux, B.; Monvoisin, A.; Cronier, L.; Papot, S. ChemMedChem 2011, 6, 2137-2141.

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Tout d'abord, la stabilité du vecteur 32 a été évaluée dans le tampon phosphate ainsi que dans du sérum de boeuf. Dans les deux cas, aucune décomposition n'a été observée après 24 heures d'incubation à 37°C. L'hydrolyse enzymatique du composé 32 a ensuite été étudiée en présence de β-glucuronidase. Lorsque le vecteur 32 est incubé en présence de l'enzyme, une hydrolyse rapide de la liaison O-glycosidique est observée aboutissant à la libération totale de la doxorubicine et MS-275 en 5 et 18 heures respectivement. Ce résultat est en désaccord avec les travaux de Shabat qui montrent que la réaction d’élimination 1,4 est toujours précédée de la réaction d’élimination 1,6.(ref Shabat 61) La nature des espèces libérées semble donc influer sur la cinétique de libération, bien qu’aucune hypothèse n’ait à ce jour était avancée pour expliquer ce résultat.

L'activité cytotoxique du vecteur 32 a été testée sur des cellules mésothéliales cancéreuses de type H290. Incubé seul, le vecteur hétérodimérique ne présente pas de signe de cytotoxicité jusqu'à la plus forte dose testée de 1 µM. Cependant, en présence de β- glucuronidase, le vecteur 32 présente une IC50 cinq fois supérieure à celle enregistrée pour un

mélange équimolaire de doxorubicine et de MS-275 (IC50 32 : 50 nM ; IC50 dox + MS-275 : 250

nM) et huit fois supérieure à celle de HMR 1826 seul avec la même quantité d’enzyme. Cette différence importante de cytotoxicité semble être le résultat de la libération de la méthylène azaquinone 33 pouvant agir comme agent cytotoxique.

Les évaluations biologiques des vecteurs glucuronylés dimériques 28 et 32 ont montré des activités supérieures à celle des monomères correspondants, démontrant ainsi le bénéfice de cette approche. La libération multiple de drogues après une seule hydrolyse enzymatique est donc une stratégie prometteuse pour pallier la faible activité de la β-glucuronidase présente dans les tissus cancéreux.