Hydrolyse enzymatique des rotaxanes 133a et 133b

Cette expérience a ensuite été répétée avec les rotaxanes galactosylés 133a et 133b. Dans ces conditions, ces deux composés ne se sont pas montrés substrats pour l’enzyme et restent parfaitement stables. Aucune trace des fils 136a et 136b n’a été observée et ce malgré plusieurs heures d’incubation. Plusieurs facteurs pourraient expliquer ce résultat décevant. Tout d’abord, la faible hydrosolubilité des rotaxanes 133a et 133b entraîne l’utilisation de DMSO pouvant dénaturer la β-galactosidase. De plus, l’encombrement stérique généré par la présence des motifs paclitaxel pourrait diminuer l’accessibilité de la gâchette pour l’enzyme.

4.Conclusion

Le but de cette étude était de préparer et d’évaluer un nouveau système moléculaire entrelacé conçu pour prolonger la durée de vie plasmatique d’esters de paclitaxel , puis de libérer de manière sélective ces espèces dans la zone tumorale dans le cadre d’une stratégie ADEPT. Dans ce cadre, deux rotaxanes 133a et 133b ont été étudiés. Ces vecteurs sont constitués d’un macrocycle auto-immolable entourant un fil dont les extrémités sont reliées à deux molécules de paclitaxel par des fonctions esters. Le déplacement du macrocycle le long du fil permettra de protéger ces fonctions esters de l’action des estérases plasmatiques. L’activation du macrocycle par la β-galactosidase, devait conduire à l’ouverture de ce dernier puis à la libération sélective du fil reliant les deux molécules anticancéreuses.

La synthèse des composés 133a et 133b a été réalisée selon une stratégie linéaire en huit étapes à partir du galactoside bromé 87 avec des rendements globaux respectifs de 3,8 et 5%. Malheureusement, les tests d’hydrolyse enzymatique du macrocycle 163 mené en présence de β-galactosidase ont montré que, dans des conditions physiologiques, l’activation enzymatique de la gâchette ne conduit pas à l’ouverture du macrocycle. Il en a été de même

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avec l’hydrolyse enzymatique des rotaxanes 133a et 133b puisque la libération du fil 136 n’a pas été observée dans ces conditions. Ces travaux n’ont donc pas permis de montrer la validité de cette nouvelle approche. La synthèse de rotaxanes rendus plus hydrosolubles par l’introduction de groupements PEG est actuellement à l’étude au laboratoire.

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Malgré les progrès réalisés au cours des dernières années en matière de traitement, de détection et de prévention, le cancer est un problème de santé publique majeur en raison du nombre de cas et du nombre de décès qu’il provoque chaque année. Actuellement, plusieurs types de thérapies sont couramment utilisés pour combattre le cancer parmis lesquelles la chirurgie ou la chimiothérapie. Bien que cette dernière reste la méthode de choix pour le traitement d’un grand nombre de tumeurs, le manque de sélectivité des agents anticancéreux utilisés dans ce cadre représente encore à ce jour un problème majeur. En effet, ce traitement provoque généralement de sévères effets secondaires dus à la destruction des tissus sains. Par conséquent, le développement de nouvelles stratégies conçues pour détruire sélectivement les tumeurs sans affecter les organes sains représente un intérêt majeur dans la lutte contre le cancer. Parmi les différents concepts étudiés, l’utilisation de vecteurs capables de reconnaître et d’intéragir avec des spécificités propres à la tumeur constitue l’un des aspects les plus prometteurs du ciblage thérapeutique.

Dans ce cadre, l’utilisation de vecteurs glucuronylés représente une stratégie particulièrement intéressante ayant conduit à des résultats chez l’animal très encourageants. Notre équipe de recherche est impliquée depuis plusieurs années dans la conception de nouveaux vecteurs glucuronylés. L’un des objectifs de ces travaux est de vectoriser de nouveaux agents anticancéreux par ce biais. Ainsi, un nouveau vecteur glucuronylé 34 de l’auristatine monométhyle E (MMAE) a été développé. La MMAE est un agent cytotoxique extrêmement puissant appartenant à la famille des dolastatines. Une évaluation préliminaire de l’efficacité thérapeutique du vecteur 34 a été réalisée sur des xénogreffes de tumeur LLC implantées chez la souris. Durant cette étude, il a été montré que ce composé présentait une efficacité thérapeutique comparable à celle de HMR 1826 à une dose 238 fois plus faible que celle administrée lors de l’utilisation du vecteur glucuronylé de la doxorubicine. Le nouveau vecteur de la cyclopamine 47, un inhibiteur de la voie de signalisation hedgehog actif contre le glioblastome, a lui aussi été synthétisé. L’introduction d’une chaîne latérale hydrophile de type PEG glycosylé sur ce composé a permis d’augmenter d’un facteur 14 la vitesse de libération de l’agent actif en comparaison avec le vecteur de première génération 45. L’évaluation in-vitro du potentiel thérapeutique du vecteur 47 a été réalisée sur des cellules souches initiatrices du glioblastome. Incubé seul, le vecteur ne possède pas d'activité cytotoxique au plus fortes doses testées, alors qu'en présence de β-glucuronidase, l'activité de

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Malgré le potentiel prometteur des vecteurs glucuronylés, le faible temps de demi-vie plasmatique de ces composés et l’activité réduite de la β-glucuronidase dans le microenvironnement tumoral limitent le développement de cette approche. Pour pallier ces problèmes, nous avons conçus le vecteur glucuronylé de la doxorubicine 68b. Ce composé comporte un motif maléimide lui permettant de se coupler in-vivo à la cystéine 34 de l’albumine plasmatique. Le vecteur macromoléculaire 69 ainsi formé ne sera pas éliminé rapidement par les reins et possèdera un temps de demi-vie plasmatique supérieur à celui de son homolgue non conjugué HMR 1826. De plus la rétention accrue de cette macromolécule au niveau de la tumeur par effet EPR permettra de pallier la faible activité de la β- glucuronidase dans le microenvironnement tumoral. L’évaluation in-vivo du vecteur 68b a été réalisée sur un modèle de tumeur LLC chez la souris. 68b présente une activité anticancéreuse supérieure à celle de HMR 1826 à des doses seulement trois fois supérieures à la dose maximale tolérée pour la doxorubicine. De plus, l’utilisation de 68b à cette dose ne provoque aucun effet secondaire, alors qu’à efficacité égale, c’est une dose toxique d’HMR 1826 (> 250 mg/kg) qui aurait du être administrée.

Le ciblage de récepteurs ou d’anticorps surexprimés à la surface des cellules cancéreuses a lui aussi conduit à de très bons résultats lors de l’évalaution de plusieurs composés chez l’homme. Dans ce cadre, nous avons développé un nouveau vecteur galactosylé de la MMAE 85 ciblant les récepteurs de l’acide folique surexprimés dans différents types de tumeurs. Une étude in-vitro a montré que le vecteur 85 était particulièrement efficace sur les cellules KB (FR+) avec une valeur d'IC50 de 240 pM, faisant

de lui le conjugué de l'acide folique le plus puissant conçu à ce jour. De plus, une toxicité nettement moins importante a été observée sur les cellules A549 (FR- ; IC50 : 195 nM). Lors

de cette étude, nous avons aussi mis en évidence que l’activation du vecteur 85 par la β- galactosydase lysosomale est particulièrement efficace. De plus, ce phénomène permet la libération d’une grande quantité d’agent actif, pouvant quitter la cellule et exercer son action cytotoxique sur les cellules cancéreuses avoisinantes. Enfin, le composé 85 présente une excellente activité anticancéreuse sur des xénogreffes de tumeurs KB implantées chez la souris nude sans provoquer d'effets secondaires.

Le dernier chapitre de cette thèse présentait les travaux réalisés dans le cadre de la conception d’un nouveau système moléculaire entrelacé dédié à la vectorisation de drogues

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présentant uniquement des fonctions alcools et acides carboxyliques. Nous avons étudié les deux rotaxanes galactosylés auto-immolables 134a et 134b véhiculant des esters de paclitaxel. La présence du macrocycle assure la protection des fonctions esters sensibles à l’action des estérases plasmatiques, alors qu’en présence de β-galactosidase, l’ouverture du macrocycle permettra la libération sélective des esters de paclitaxel dans le microenvironnement tumoral. Malheureusement, les premiers tests d’hydrolyse enzymatique réalisés sur ces composés n’ont pas été concluants et nous n’avons pas, pour le moment, réussi à montrer la validitié de cette nouvelle approche.

Ces travaux ont permis d’élargir le panel des vecteurs existant en ciblant différentes spécificités tumorales et en vectorisant des agents cytotoxiques possédant différents modes d’actions. En outre, il a été montré qu’à partir d’une même unité centrale, il été possible de moduler aisément les différents éléments du système de ciblage tels que la drogue (MMAE, cyclopamine, doxorubicine), la gâchette (galactoside, glucuronide) et la chaîne latérale (chaîne hydrosoluble, ancre pour macromolécules, ligand de ciblage) (Figure 132). A l’avenir, il pourra être possible d’assembler à la demande des systèmes moléculaires adaptés au ciblage d’une pathologie donnée.

Figure 132 – Modularité de l’unité centrale 51

A terme, l'association de ces différents vecteurs au cours d'un même traitement pourra être envisagée. La composition de cette polychimiothérapie ciblée pourra sera adaptée en fonction des caractéristiques tumorales rencontrées. Il pourrait en découler des traitements plus efficaces et mieux supportés par les patients tirant bénéfice du mode d'action spécifique de chaque vecteur utilisé.

glycosylation

AGENT ANTICANCEREUX

(MMAE, cyclopamine, doxorubicine)

cycloaddition [3+2] CHAINE

LATERALE

(chaîne hydrosoluble, ligand de ciblage, ancre moléculaire)

GACHETTE (galactoside, glucuronide)

Substitution nucléophile

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1.Généralités