Un système Quorum Sensing de type AHL

Les inducteurs des systèmes de Quorum Sensing les plus fréquemment rencontrés, chez les bactéries à Gram négatif comme Legionella, sont des AHL. Afin de déterminer si l’inducteur produit par les légionelles PA appartient à cette famille de molécules, une bactérie a été utilisée comme biosenseur. Ce type d'organismes, aussi appelés biorévélateurs,

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répondent à la présence d'un effecteur moléculaire par l'émission d'un signal quantifiable. Parmi les biosenseurs existants, nous avons choisi Chromobacterium violaceum CV026 (McClean et al., 1997; Fletcher et al., 2007; Steindler and Venturi, 2007; Kawaguchi et al., 2008).

C. violaceum CV026 est un coccobacille à Gram négatif. Cette bactérie fait partie de la

flore naturelle de l’eau et des sols des régions tropicales et sub-tropicales. Chromobacterium produit un grand nombre d’antibiotique tels que l’aérocyanidine, l’aérocavine, l’aztréoname et le plus étudié, la violacéine (R. J. Andersen, 1974; Parker et al., 1988; Duran and Menck, 2001). La violacéine présente des activités biologiques antiparasitaires et antitumorales qui pourraient lui conférer un intérêt thérapeutique (Dessaux et al., 2004). La production de ce pigment, également utilisé par certains artistes pour leurs peintures, est liée au mécanisme de Quorum Sensing.

Ce mécanisme de communication utilise des AI-1, les AHL. Chromobacterium synthétise de la N-Hexanoyl-Homosèrine Lactone (HHL) via un système homologue à LuxI/LuxR, le système CviI/CviR. CviI est l’enzyme responsable de la synthèse de l’auto- inducteur. A forte densité cellulaire, CviR, la protéine régulatrice, va former un complexe avec l’AHL qui va se fixer sur une séquence consensus, appelée cvi box, et induire l’expression de l’opéron composé des gènes vioABCDE (McClean et al., 1997; August et al., 2000; Antonio and Creczynski-Pasa, 2004; Chen et al., 2011). La présence des 5 gènes est nécessaire à la synthèse de la violacéine (Hoshino, 2011). Le mutant CV026 est délété du gène de la synthase de la HHL et donc ne peut pas auto-induire la production du pigment. Cependant, la production de violacéine peut être restaurée par apport extérieur de HHL.

Cette production de violacéine permet d’effectuer un test rapide de détection des AHL. Ainsi, les travaux de McClean et al ont démontré que ce mutant est sensible à une large gamme d’AHL et permet de plus de discriminer les AHL à longues chaines et à courtes chaines (McClean et al., 1997). En effet, la production de violacéine peut être induite par des AHL possédant des chaines latérales de 4 à 8 carbones avec des seuils de sensibilité variables (Tableau 5). A l’inverse, les AHL à longues chaines, de 10 à 14 carbones, sont incapables d’induire l’expression de la violacéine. Cependant, ces AHL à longue chaine carbonée ont la capacité d’inhiber l’induction de production de violacéine chez le mutant CV026 (Tableau 5). Cette inhibition est un mécanisme peu décrit mais les travaux de l’équipe de Morohoshi suggèrent l’existence d’un autre régulateur capable de fixer les AHL non inducteurs pour former un complexe qui serait capable de se lier à la séquence promotrice de l’opéron

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vioABCDE (Morohoshi et al., 2010). Ce complexe entrerait alors en compétition avec le

complexe CviR/AHL pour la fixation sur cette séquence. Selon le complexe majoritairement lié, il y aurait soit induction, soit inhibition de la synthèse de violacéine.

Tableau 5 : Structures et activités relatives des homosérines lactones acylées et homocystèines thiolactones acylées sur la production de violacéine par C. violaceum CV026 en milieu gélosé.

D’après McClean et al, 1997.

Afin de déterminer si des AHL sont présentes dans le surnageant de légionelles PA et donc potentiellement à l’origine du phénotype« biofilm », C. violaceum CV026 a été inoculé dans une gélose nutritive sur laquelle ont été testés différents composés, un contrôle positif d’induction de la violacéine, N-3-oxohexanoyl-L-Homosèrine Lactone (OHHL), un contrôle positif d’inhibition, N-3-oxododecanoyl_L-Homosèrine Lactone (OdDHL) et le surnageant de légionelles PA. Les résultats obtenus sont présentés dans la figure 45.

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Figure 43 : Test d’induction (A) et d’inhibition (B) de production de la violacéine par C. violaceum CV026 traitée avec du surnageant de L. pneumophila PA en suspension dans de l’eau minérale depuis 24 heures.

Dans le puits 1, une solution d’OHHL a été déposée, de l’OdDHL dans le puits 2, 10 µL de surnageant de PA dans le puits 3, 30 µL de surnageant de PA dans le puits 4, 50 µL de surnageant de PA dans le puits 5. Cette expérience a été répétée 4 fois avec 3 répétitions lors de chaque essai.

Le test d’induction (Figure 46A) démontre que le surnageant des légionelles PA n’induit pas l’expression de la violacéine contrairement au témoin positif, l’OHHL. Ceci montre que les légionelles ne produisent pas de molécules de type AHL à courtes chaines carbonées. Au contraire, dans le test d’inhibition (Figure 46B), un halo d'inhibition est visible autour des puits dans lesquels un volume de 30 µL et de 50 µL de surnageant de légionelles PA a été ajouté. Un halo d’inhibition est obtenu également avec le dépôt d’OdDHL. Ces résultats démontrent l’inhibition de la production de la violacéine par le surnageant de L.

pneumophila PA, ce qui suggère la présence d’une molécule de type AHL à chaine longue. Le

surnageant utilisé provient de légionelles PA qui ont été lavées plusieurs fois à la sortie d’amibes avant d’être mises en suspension dans de l’eau minérale, ce qui indique que les molécules de type AHL détectées sont bien produites par les légionelles PA. Le même test a été réalisé avec le surnageant de légionelles PC, mais aucun halo n’a été observé (résultat non montré), ce qui confirme que la synthèse de ce facteur est propre aux légionelles PA.

Ces résultats permettent d’émettre l’hypothèse que la molécule responsable de l’induction du phénotype biofilm chez Legionella pourrait être une AHL à longue chaine carbonée. Or, LAI-1 ; la molécule signal produite par L. pneumophila n’est pas une AHL mais une hydroxycétone essentiellement constituée d’une longue chaine carbonée (15 carbones)

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(Figure 19) (Spirig et al., 2008). Elle pourrait éventuellement être à l’origine de l’inhibition de la production de la violacéine mise en évidence.