TYPE SPECIFICATION

Na indústria biotecnológica o principal problema relacionado com a produção de proteínas recombinantes em Escherichia coli é a presença de lipopolissacarídeos (LPS), já que o LPS é derivado da membrana celular de bactérias Gram-negativas. Devido ao efeito tóxico sobre seres humanos, é essencial remover LPS de preparações de produtos biológicos e farmacêuticos (Magalhães et al., 2007).

Estudos realizados por Pestch & Anspach (2000), Wilson et al. (2001), Reichelt et al. (2006), Cheng et al. (2008) e Sousa Junior (2015) demonstraram que Triton X-114 pode ser aplicado para remoção de concentrações elevadas de LPS. Nesse contexto, foi avaliado a quantidade mínima de tensoativo, Triton X-114 necessária para remoção do LPS e o tensoativo foi aplicado durante a etapa de lavagem do ensaio de ALE, conforme o item 4.2.6. A determinação de LPS foi realizada segundo o procedimento descrito na seção 4.2.10.

A temperatura e o volume do tampão de lavagem contendo o Triton-X 114, de 4,0 ºC e 50,0 mL, respectivamente, foram determinados de acordo com estudo realizado por Sousa Junior (2015), no qual observou que para a remoção de LPS essas variáveis foram estatisticamente significativas, influenciando de forma negativa no processo. Mostrando que 50,0 mL de tampão com Triton X-114 seguido por lavagem com 100 mL de tampão sem tensoativo foi ligeiramente mais eficaz na remoção de endotoxinas e que executando o procedimemento a 4,0 °C obteve-se uma boa eliminação de LPS.

Segundo Pestch & Anspach (2000) e Reichelt et al. (2006), o ponto de turvação desse tensoativo é 22 °C e abaixo dessa temperatura o Triton X-114 dissocia de maneira eficiente endotoxinas de proteínas.

As concentrações de Triton X-114 avalidas foram estimadas de acordo com estudos relatados na literuratura. Reichelt et al. (2006), Zimmerman et al. (2006) e Sousa Junior (2015), mostraram que a aplicação de apenas 0,1% de Triton X-114 na etapa de lavagem foi bem sucedida para redução de endotoxina, removendo mais de 99 % do LPS inicial. Dessa forma, concentrações de 0,01 %, 0,05% e 0,1 % de Triton X-114 foram aplicadas no tampão de

Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017

lavagem visando avaliar a quantidade mínima necessária para remoção de LPS e para isso foram realizados três ensaios operando em coluna de leito expandido. Os valores obtidos para cada ensaio estão apresentados na Tabela 12.

Tabela 12 - Percentagem de remoção de LPS nos ensaios de ALE.

Carga (UE/mL) Eluição (UE/mL) % Remoção LPS

Ensaio 1 (0,01 %)

5,48 x 10

_1628,55

_99,70

Ensaio 2 (0,05 %)

8,84 x 10

389,39

99,56

Ensaio 3 (0,1 %)

7,02 x 10

1628,55

99,77

De acordo com a Tabela 12, observa-se que para as três condições analisadas o percentual de remoção de LPS foi elevado e que para a concentração mínima utilizada (0,01 %) já foi obtida uma remoção de 99,70 %. Esses resultados confirmam o que já foi obtido em outros estudos citados anteriormente, que a adição de baixas concentrações de Triton X-114 durante a etapa de lavagem de processos cromatográficos é eficiente para remover mais de 99,0 % de LPS. Portanto, o uso do tensoativo utilizado é eficaz na dissociação de endotoxinas fortemente ligadas a proteínas recombinantes.

No entanto, mesmo após uma remoção de 98,0 a 99,0 % do LPS, a concentração residual deste contaminante ainda pode ser elevada. O limite estabelecido para as quantidades de endotoxinas permitidas em produtos farmacológicos injetáveis para humanos é de 5,0 UE por kg de peso corporal por hora (Lopes et al., 2010). Nesse estudo, o terceiro ensaio, por exemplo, apresentou uma maior remoção de endotoxinas (99,77 %), no qual o homogeneizado de E. coli (carga) possuía inicialmente 7,02 x 105 EU/mL, e mesmo após 99,0 % de remoção a eluição ainda apresentou uma concentração de LPS de 1628,55 UE/mL, o que pode representar uma quantidade significativa, uma vez que tem-se como objetivo obter um produto para uso intravenoso, tornando necessária uma etapa adicional para remoção do LPS residual. De qualquer forma, uma estratégia que integra em apenas uma etapa os processos de clarificação, recuperação, purificação e redução significativa de LPS a partir de um extrato não clarificado, como a utilizada neste trabalho, parece ser muito vantajosa.

Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017

5.5 Purificação do antígeno 503 e remoção de LPS utilizando ALE

Para a purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado de E. coli não clarificado utilizando uma coluna operando em leito expandido foi realizado o procedimento descrito na seção 4.2.6. No primeiro ensaio a etapa de eluição foi realizada de forma isocrática, com a concentração de imidazol de 0,6 M, conforme otimizado por Sousa Junior et al. (2015)

Realizou-se o ensaio com a concentração de Triton X-114 de 0,01 % no tampão de lavagem, de acordo com o que foi apresentado anteriormente. A Figura 19 ilustra o cromatograma obtido para esse ensaio de purificação e a Tabela 13 apresenta o balanço de massa.

Figura 19 - Cromatograma do perfil de purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado de E. coli não clarificado utilizando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de

lavagem e a eluição isocrática.

Tabela 13 - Dados da purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado de E. coli não clarificado para o ensaio com a eluição isocrática.

Etapas Volume (mL) Proteína total (mg) Antígeno 503 (mg) Pureza do antígeno 503 Rendimento (%) Fator de Purificação Homogeneizado Celular 100 180,0 14,0 0,080 100,0 1,0 Passante 100 95,14 6,14 - - - Lavagem 150 67,37 2,89 - - - Eluição 100 19,65 0,42 0,021 3,0 0,26

Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017

Analisando a Tabela 13, observa-se que na etapa de carga foi perdido 95,14 mg de proteína total e 6,14 mg de antígeno 503, isso implica dizer que, em relação ao que foi aplicado teve-se uma perda de 52,85% e 43,85%, referente a massa de proteína total e antígeno 503, respectivamente. Com os dados obtidos nessa tabela foi possível calcular a capacidade de adsorção dinâmica do Cu2+ e foram obtidos valores de 4,37 mg proteína total/g de adsorvente e 0,82 mg antígeno 503/g de adsorvente. Comparando a capacidade de adsorção dinâmica obtida nesse estudo com a obtida por Sousa Junior et al. (2015), que foram de 7,66 mg/g de adsorvente e 1,14 mg/g de adsorvente, para proteína total e antígeno 503, respectivamente, usando o Ni2+, conclui-se que o Cu2+ é um pouco mais seletivo que o Ni2+, mas a capacidade dinâmica desse último confere ao mesmo melhor vantagem. Estudos realizados por Camprubí et al. (2006), avaliaram também a purificação de uma proteína recombinante em E. coli, nesse caso a estreptolisina O (SLO), utilizando para os ensaios de ALE uma coluna preenchida com a resina

Streamline chelating – Ni2+. Foi possível analisar que a perda de proteína total foi correspondente a 77,86%, mostrando que grande parte dos contaminantes não foram adsorvidos na resina, e que apenas 26,05% foi equivalente à perda da proteína de interesse, podendo-se concluir que para essa proteína o Ni2+ _{mostrou-se seletivo.}

Durante a etapa de lavagem, espera-se que ocorra a remoção de partículas, células, detritos celulares e proteínas que ficaram fracamente adsorvidas no adsorvente (Anspach et al. 1999). De acordo com a Figura 19, é notório que a concentração de proteína total e, consequentemente, a de antígeno 503 vai decrescendo à medida que aumenta o volume do tampão de lavagem, até que estas concentrações se tornam constantes. Esse perfil na etapa de lavagem confirma a remoção das proteínas que apresentaram uma interação fraca com a resina em estudo.

Seguida da etapa de lavagem tem-se a eluição, assim como descrito na metodologia, essa etapa foi realizada com o leito empacotado. Segundo Chase (1994), essa forma é mais eficiente, uma vez que, reduz-se o volume de eluente utilizado e resulta em uma concentração mais elevada do produto eluído. A eluição pode ser alcançada pela introdução de um agente competidor que age deslocando a proteína, no presente estudo foi utilizado o imidazol. De acordo com a Tabela 11, observa-se que a eluição com o tampão contendo 0,6 mol/L de imidazol recuperou apenas 3,0% do antígeno 503, com um fator de purificação de 0,26, e esses resultados obtidos não foram satisfatórios quando comparados, por exemplo, aos resultados obtidos por Sousa Junior et al. (2015) para a eluição do mesmo antígeno 503 para mesma resina

Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017

com o metal Ni2+_{. Esses autores obtiveram uma recuperação e um fator de purificação de 59,2%}

e 6,0, respectivamente.

A Figura 20 mostra o comportamento do antígeno 503 no ensaio de ALE analisado em SDS-PAGE 12%. Dessa forma, é possível observar que nas condições usadas no ensaio de ALE o protocolo de purificação não apresentou bons resultados, como pode ser observado pelo perfil eletroforético de proteínas.

Figura 20 - Gel de eletroforese (SDS-PAGE) do antígeno 503 recuperado a partir do homogeneizado de E. Coli usando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de lavagem da ALE. Coluna 1: Padrão de massa molecular; Coluna 2: Homogeneizado de E. coli; Coluna 3: Carga;

Coluna 4: Lavagem; Coluna 5: Eluição.

Destaca-se que, como se trata de outro metal pode existir interações secundárias adicionais envolvendo forças iônicas ou hidrofóbicas, sendo necessárias novas estratégias de eluição para obtenção de uma pureza aumentada, como variações no pH e na concentração de imidazol. Tampões de pH baixos (< 6) na maioria das vezes são suficiente para eluir a proteína alvo, embora isso possa levar a desnaturação da mesma (Clemmitt & Chase, 2000). No caso de proteínas sensíveis a pH mais baixo, um pH neutro é mais favorável. Em estudos realizados por Yap et al. (2010), o pH variou de 6,0 a 8,0 e a concentração de imidazol de 50,0 a 500,0 mM, observando que a quantidade eluída da proteína de interesse aumentou gradativamente com o aumento na concentração de imidazol e radicalmente com o aumento do pH. A fim de melhorar os resultados aqui obtidos, outra alternativa seria utilizar mais de um passo de eluição, em uma estratégia conhecida como eluição em degrau, na qual utiliza-se primeiramente um tampão com uma concentração mais baixa de imidazol a fim de eluir as proteínas contaminantes fracamente ligadas ao adsorvente, e em seguida, emprega-se um tampão contendo uma concentração mais

kDa 97.0 66.0 45.0 30.0 20.1 1 2 3 4 5

Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017

alta do agente competitivo, com a finalidade de eluir o antígeno 503. Esta estratégia foi estudada por Campubrí et al. (2006), que utilizou 50,0 e 500,0 mM de imidazol, Clemmitt & Chase (2000), onde as etapas de eluição foram realizadas utilizando concentrações de imidazol de 6,0 mM e 60,0 mM, e ainda por Tan et al. (2006) que aplicaram a eluição em duas etapas, usando 50,0 e 350,0 mM do imidazol. Observa-se que para todos esses estudos a estratégia foi eficiente e foram obtidos resultados satisfatórios na eluição da proteína de interesse.

Deste modo, com o objetivo de melhorar a recuperação do antígeno 503, a estratégia de eluição em degrau foi empregada, uma vez que trabalhos encontrados na literatura sugerem que a utilização de uma baixa concentração de imidazol pode ser utilizada para eluir algumas proteínas contaminantes.

Primeiramente, baseado na concentração de imidazol aplicada na eluição isocrática (0,6 mol/L), foram utilizados dois passos de eluição com 0,6 e 1,0 mol/L de imidazol, com a finalidade que a proteína de interesse seja eluída no segundo passo (1,0 mol/L). O cromatograma adquirido para esse ensaio de purificação está ilustrado na Figura 21 e a Tabela 14 apresenta o balanço de massa.

Figura 21 - Cromatograma do perfil de purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado de E. coli não clarificado utilizando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de

Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017

Tabela 14 - Dados da purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado de E. coli não clarificado para o ensaio com a eluição em degrau com dois passos.

Etapas Volume (mL) Proteína total (mg) Antígeno 503 (mg) Pureza do antígeno 503 Rendimento (%) Fator de Purificação Homogeneizado Celular 100 168,0 7,30 0,043 100,0 1,0 Passante 100 61,39 3,13 - - - Lavagem 150 54,36 1,28 - - - Eluição 1 50 13,23 0,37 0,028 5,07 0,65 Eluição 2 50 8,34 0,04 0,005 0,55 0,12

Através da Figura 21 perecebe-se que a etapa de eluição, mesmo com dois passos, apresentou perfil semelhante a etapa de eluição do cromatograma realizado com eluição isocrática (Figura 20), podendo-se concluir que essa estratégia não foi eficiente para eluir o antígeno 503.

Por meio da Tabela 14 pode-se observar que o segundo passo de eluição (Eluição 2) utilizando 1,0 mol/L de imidazol resultou em uma recuperação e fator de purificação da proteína de de interesse de apenas 0,55 e 0,12, respectivamente. Quando comparado ao teste anterior realizado com eluição isocrática, observa-se que houve uma diminuição na recuperação e fator de purificação. Logo, esses passos de eluição não foram satisfatórios para eluição do antígeno 503, o que pode ser confirmado através da Figura 22, a qual ilustra o perfil eletroforético das proteínas. Essa Figura mostra que a biomolécula de interesse foi eluída com concentração de imidazol inferior a 1,0 mol/L. Com isso, uma outra estratégia seria utilizar um passo de eluição com a concentração de imidazol abaixo de 0,6 mol/L, com a finalidade de que as proteínas contaminantes sejam eluídas nessa concentração inferior e o antígeno 503 eluído com 0,6 mol/L.

Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017

Figura 22 - Gel de eletroforese (SDS-PAGE) do antígeno 503 recuperado a partir do homogeneizado de E. coli usando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de lavagem da ALE. Coluna 1: Padrão de massa molecular; Coluna 2: Homogeneizado de E. coli; Coluna 3: Carga;

Coluna 4: Lavagem; Coluna 5: Eluição 0,6 mol/L; Coluna 6: Eluição 1,0 mol/L.

Portanto, essa nova estratégia foi empregada e o ensaio foi realizado novamente com dois passos de eluição, nesse caso sendo utilizados 0,3 mol/L e 0,6 mol/L de imidazol. O cromatograma obtido para esse ensaio de purificação segue na Figura 23 e a Tabela 15 apresenta o balanço de massa.

Figura 23 - Cromatograma do perfil de purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado de E. coli não clarificado utilizando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de

lavagem e a eluição em degrau com 0,3 e 0,6 mol/L.

1 2 3 4 5 6 kDa 97.0 66.0 45.0 30.0 20.1

Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017

Tabela 15 - Dados da purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado de E. coli não clarificado para o ensaio com a eluição em degrau com dois passos.

Etapas Volume (mL) Proteína total (mg) Antígeno 503 (mg) Pureza do antígeno 503 Rendimento (%) Fator de Purificação Homogeneizado Celular 100 164,0 7,0 0,043 100,0 1,0 Passante 100 79,46 4,04 - - - Lavagem 150 55,54 0,98 - - - Eluição 1 50 13,97 0,46 0,033 6,57 0,77 Eluição 2 50 8,20 1,05 0,128 15,00 2,98

Analisando a Figura 23 e a Tabela 15, observa-se o antígeno 503 foi eluído no segundo passo de eluição (Eluição 2), com 0,6 mol/L de imidazol, apresentando uma recuperação de 15,0% do antígeno 503 e um fator de purificação de, aproximadamente, 3,0.

A Figura 24 ilustra o comportamento do antígeno 503 no ensaio de ALE analisado em SDS-PAGE 12% e demonstra que a proteína de interesse eluída apresenta um peso molecular de, aproximadamente, 56 kDa. Percebe-se ainda que uma pequena quantidade de proteína com peso inferior a 56 kDa foi detectada no eluato. Da mesma forma, Wizemann & von Brunn (1999) e Tan et al. (2006) durante a purificação relataram a presença de proteína com peso molecular abaixo da proteína de interesse no eluato e consideraram que estas impurezas podem ser proteínas contaminantes que não foram removidas durante a etapa de eluição prévia com uma concentraçao de imidazol inferior, ou podem ser ainda produtos de degradação da proteína alvo.

Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017

Figura 24 – Gel de eletroforese (SDS – PAGE) do antígeno 503 recuperado a partir do homogeneizado de E. coli usando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de lavagem da ALE.

Coluna 1: Padrão de massa molecular; Coluna 2: Homogeneizado de E. coli; Coluna 3: Passante; Coluna 4: Lavagem; Coluna 5: Eluição 0,3 mol/L; Coluna 6: Eluição 0,6 mol/L.

Assim como nos estudos realizados por Clemmitt & Chase (2000), Campubrí et al. (2006) e Tan et al. (2006), o tampão de eluição contendo uma concentração mais baixa de imidazol, nesse estudo sendo de 0,3 mol/L (Eluição 1), eluiu a maioria das proteínas contaminantes fracamente ligadas e a proteína de interesse foi eluída a partir da aplicação de um tampão (Eluição 2) contendo uma concentração de imidazol mais elevada (0,6 mol/L).

Os resultados obtidos nesse último ensaio foram satisfatórios quando comparado com os obtidos no ensaio utilizando eluição isocrática, mostrando que a estratégia de utilizar a eluição em degrau foi eficiente para purificar o antígeno 503 a partir do homogeneizado de E.

coli não clarificado.

1 2 3 4 5 6 kDa 97.0 66.0 45.0 30.0 20.1

CAPÍTULO VI

CONCLUSÕES

Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017