ASSOCIATION OF ARGUMENTS

A Adsorção em Leito Expandido (ALE) tende a simplificar de forma significativa o

downstream processing, pois nessa técnica o caldo bruto proveniente da fermentação pode ser

utilizado sem que haja uma clarificação prévia, com o material particulado passando através do leito sem ser retido. Esta técnica cromatográfica elimina as etapas de filtração, centrifugação e concentração, integrando em uma única operação as etapas de clarificação, concentração e purificação (Chase & Draeger, 1992; Hjorth, 1997). Essa característica de integrar essas etapas em uma única operação unitária é a principal vantagem da utilização da adsorção em leito expandido, sobre a técnica cromatográfica convencional em leito fixo.

Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017

A Figura 3 ilustra a comparação entre o funcionamento de um processo de adsorção em leito fixo (3a) e expandido (3b), podendo-se observar que no leito fixo o material particulado bloqueia a coluna. No entanto, ao ser operada de forma expandida a alimentação contendo o material particulado passa pela coluna sem a obstrução do leito (Figura 3b) (Santos, 2001).

Figura 3 - Princípio de funcionamento de um processo de adsorção em leito fixo e expandido. Fonte: adaptado de Crase & Draeger, 1992.

A ALE baseia-se na fluidização do leito de adsorventes cromatográficos (Padilha, 2013). Esse processo de fluidização do leito promove uma maior interação entre as matrizes adsorventes e as moléculas alvo (Curvelo-Santana et al., 2008).

As propriedades das partículas adsorventes são de fundamental importância para formar uma fluidização perfeita, nesse caso, faz-se necessário o uso de partículas com alta massa específica, que permite o estabelecimento de elevadas velocidades de fluxo de líquido através do leito expandido. Quando a fase móvel é bombeada em sentido ascendente através da coluna, as partículas com tamanhos e densidades diferentes distribuem-se de forma não uniforme ao longo da altura do leito (Lin et al, 2013). As partículas adsorventes maiores ou mais densas

Fluido com partículas

Partículas

adsorventes

Material particulado que

passa pelo leito

Torta de Células

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localizam-se na parte inferior do leito expandido e as menores ou menos densas na parte superior, como pode ser visto na Figura 2b ilustrada acima (Hjorth, 1997).

O fluxo ascendente através do adsorvente fornece uma maior fração de vazios no interior do leito, o que permite a utilização de material particulado, que passa através da fase sólida enquanto a biomolécula alvo é adsorvida (Tong & Sun, 2002).

As matrizes adsorventes mais utilizadas para purificação de proteínas são as de celulose, agarose, dextrana e poliacrilamida (Sousa Junior, 2015). Os ligantes clássicos (SP – sulfapropil, DEAE – dietil aminoetil e IDA – ácido iminodiacético) são acoplados ao suporte das partículas adsorventes (agarose-quartzo ou agarose-metal) elevando sua densidade e viabilizando a expansão do leito. Estes adsorventes são identificados comercialmente como Streamline, comercializados pela GE Healthcare e são compostos de 6% de agarose contendo um núcleo de quartzo cristalino, que atua aumentando a densidade do adsorvente, com um tamanho de partícula que varia de 100-300 µm, com tamanho médio de 200 µm e densidade em torno de 1,2 g/mL (Amersham Pharmacia Biotech, 1997; Kilikian & Santos, 2005).

O processo de cromatografia em leito expandido corresponde a uma sequência de operações, que inclui o equilíbrio da resina, aplicação da amostra, a lavagem das proteínas não adsorvidas, a eluição do composto e a regeneração da resina (Moraes, 2009). A ilustração dessa sequência é representada na Figura 4. Primeiramente, o adsorvente do leito expandido é equilibrado com o tampão de equilíbrio, aplicado em fluxo ascendente, causando a expansão do leito em 2 ou 3 vezes, dependendo da velocidade. Após essa etapa, a amostra contendo as células e partículas em suspensão é alimentada, no sentido ascendente, no leito estabilizado. Dessa forma, a biomolécula alvo adsorve na resina, enquanto as células, restos celulares e contaminantes saem pela parte superior da coluna. Nessa etapa, é importante manter o mesmo grau de expansão do leito estabelecido e para isso deve-se controlar a velocidade. Em seguida, efetua-se a lavagem de modo ascendente usando-se o tampão, para remoção de partículas e proteínas fracamente adsorvidas. Depois da lavagem, a eluição da biomolécula de interesse é conduzida após sedimentação do leito, ou seja, com o leito empacotado, podendo-se utilizar o fluxo na forma ascendente ou descendente. Finalmente, a resina é limpa e regenerada para ser novamente utilizada (Amersham Pharmacia Biotech, 1997).

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Figura 4 - Etapas do processo de adsorção em leito expandido. Fonte: Amersham Pharmacia Biotech, 1997.

3.6.1.1 Caracterização do leito expandido

Para as operações usando a ALE é de fundamental importância conhecer o comportamento do leito em função das propriedades físicas das partículas e do fluido (Moraes, 2009). Uma das formas de conhecer esse comportamento é por meio da correlação de Richardson & Zaki (1954), eles estudaram a sedimentação e fluidização de vidro, divinil benzeno e balas de chumbo usando soluções como cloreto de sódio, M-cresol, bromofórmio e glicerol e obtiveram uma expressão que relaciona a velocidade do fluido e a velocidade terminal da partícula, com a porosidade do leito, conforme a Equação (1) (Santos, 2001):

U Ut

=ε

n

₍₁₎

Em que U é a velocidade do fluido, 𝑈_𝑡 é a velocidade terminal da partícula, 𝜀 a porosidade do leito e n é o índice de expansão (ou índice de Richardson-Zaki), sendo este uma função do número de Reynolds terminal (Ret).

Re

_t

=

dPρLUt μ (2) Leito sedimentado Equilíbrio (expansão do leito) Aplicação da amostra Lavagem Eluição da proteína Regeneração

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No regime de Stokes, em que o 𝑅𝑒_𝑝 < 0,1, a velocidade terminal de uma partícula isolada 𝑈𝑡 é dada por:

U

_t

=

gdP

2_(ρ p-ρL)

18μ

(3)

Sendo g a aceleração da gravidade, dp é o diâmetro da partícula, μ é a viscosidade do fluido, e ρp e ρL são as densidades da partícula e do fluído, respectivamente.

Outro parâmetro importante na caracterização do leito expandido é o grau de expansão (GE), que é um número adimensional e representa a razão entre a altura do leito expandido (H) e a altura do leito fixo do adsorvente (𝐻0), para uma dada velocidade aplicada, como segue na

Equação (4). Para sistemas operando em leito expandido, os valores de GE giram em torno de 2,0 a 3,0 (Kilikian & Santos, 2005).

GE=

H

H0 (4)

A Equação (5) representa a relação entre a porosidade do leito e o grau de expansão:

H H0

=

(1-ε0)

(1-ε)

(5)

Em que ε é a porosidade do leito e 𝜀₀ a porosidade inicial do leito (assumindo valor de 0,4) (Cavalcanti, 2010).

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