E TUDE STRUCTURALE DU DOMAINE C TERMINAL DE M LH

i. Cristallogenèse du CTD de Mlh1 (485-769) de S. Cerevisiae

Dans le but de préciser le mode d’interaction entre le site S2 de Mlh1 et des peptides contenant un motif MIP, nous avons entrepris de cristalliser le domaine C- terminal de Mlh1 avec certains des peptides analysés en ITC.

Pour les tests de cristallogenèse, la protéine est préparée dans un tampon 25mM Na2HPO4 pH=7.5, 300mM NaCl, 10mM β-mercaptoéthanol et à une concentration comprise entre 3 et 12mg/ml. Les essais sont réalisés sur la protéine seule à 7.3mg/ml ou en complexe avec le peptide pNtg2(13mère) à deux concentrations différentes en protéine, 3.4mg/ml et 6.9mg/ml. Le mélange entre la protéine et le peptide est effectué pour avoir une stœchiométrie protéine:peptide de 1:3.

Le crible de conditions de cristallisation a été effectué sur la plateforme de cristallogenèse HTX du PSB (Partnership for Structural Biology) à Grenoble. Ce projet a fait l’objet d’une collaboration étroite avec Jose A. Marquez qui dirige la plateforme. Les projets ont été soumis et sélectionnés par la plateforme PCUBE (Protein Production Platform). Le crible effectué porte sur 576 conditions de cristallisation, correspondant aux kits Qiagen 1 à 6. La méthode utilisée est la cristallisation par diffusion de vapeur en goutte assise avec un mélange de 100nl de solution précipitante et 100nl d'échantillon, et ce, pour les trois échantillons précités (Mlh1(CTD) à 7.3mg/ml, Mlh1(CTD)*pNtg2 à 3.4mg/ml et Mlh1(CTD)*pNtg2 à 6.9mg/ml). Les plaques de cristallisation sont réalisées avec un robot Cartesian et sont analysées avec le robot de visualisation Formulatrix RockImager de la plateforme HTX située en chambre froide à 4°C. Des images des essais de cristallisation sont prises à différents temps (24h, 72h, 7 jours, 16 jours, 5 semaines et 10 semaines) et sont accessibles par internet depuis notre laboratoire. De ces 576 conditions, 46 ont été identifiées comme encourageantes, c'est-à-dire formant des microcristaux, des sphérulites ou du précipité hétérogène27_{. Mais parmi ces 46}

conditions, une majorité comporte des cations métalliques. Or, la présence d'anions phosphate dans le tampon de la protéine rend probable la formation de cristaux de sels entre le phosphate et les cations métalliques utilisés dans les cribles. Nous avons sélectionné 9 conditions de cristallisation issues des résultats du robot pour les reproduire au laboratoire. Sur ces 9 conditions, nous avons obtenu des cristaux pour 5 d’entre elles. Des cristaux obtenus en présence de lithium(II), en forme de grains de riz se sont avérés être des cristaux de sels lors de tests de diffraction. De même, des sphérulites obtenues en présence de sulfate d’ammonium sont reproduits au laboratoire même en absence de protéine. A l’issue de ces essais, une seule condition retient l'attention; celle-ci contient du PEG 3.35k, agent précipitant le plus présent dans toutes les conditions retenues et de l'iodure de sodium à la concentration de 0.2M. Les microcristaux identifiés dans cette condition apparaissent seulement en présence du complexe Mlh1-peptide.

Parallèlement au crible effectué en robot, nous avons également testé d'autres cribles manuellement et ce, dans les mêmes conditions, à l'exception de la concentration en NaCl que nous avons choisi de réduire à 100mM. Cette diminution de concentration a pour but de réduire l'impact systématique de la présence de ce sel dans les essais de cristallisation. L'utilisation du crible proposé par E. Stura, appelé Footprint#1 (Molecular Dimensions Ltd) a permis d’identifier une seconde condition contenant 20% PEG 4k et 0.2M Imidazole Malate pH7. Cette dernière condition donne des aiguilles clairement identifiables. Comme pour la première condition, ces cristaux n'apparaissent qu'en présence du complexe Mlh1(CTD)*peptide pNtg2.

Nous avons alors cherché à optimiser, de façon conjointe, les deux conditions (PEG 3.35k/NaI et PEG4k/Imidazole Malate). Les deux conditions ont été identifiées en présence du peptide pNtg2. Nous avons d’abord testé les différents peptides pExo1 et pSgs1 et avons observé la formation de cristaux mais nettement plus petits. Nous avons décidé de tester également un certain nombre de paramètres: concentration en agent précipitant, concentration en complexe, pH, présence d’additifs, présence d’agent réducteur et stœchiométrie du complexe protéine/peptide, méthode de cristallisation (diffusion de vapeur, en batch sous huile), la température de cristallisation (4°C ou 20°C). Le seul paramètre qui a permis une réelle amélioration des cristaux obtenus avec la condition (PEG 3.35k/ NaI) a été la cristallisation en batch sous huile. Les meilleurs cristaux obtenus ont une forme de bâtonnets et une taille inférieure à 5µm dans deux dimensions (Figure 3 - 9(A)). Ces cristaux ont été

congelés et analysés sur les lignes synchrotron ID23-2 (ESRF-Grenoble). Ils ne donnent aucune tâche de diffraction.

La seconde condition (PEG 4k/Imidazole Malate) a subi plusieurs étapes d'optimisation: d'une part, l'ajout de l’agent réducteur Dithiothreitol (DTT) à une concentration comprise entre 20 et 100mM permet d'obtenir des aiguilles plus grandes d'un facteur 2 dans toutes les dimensions; d'autre part, la cristallisation en batch

sous huile de paraffine plutôt qu'en diffusion de vapeur permet d'obtenir des aiguilles de tailles acceptables pour les essais de diffraction à savoir 200×10×5µm3_{. Néanmoins} dans ces conditions, beaucoup de ces cristaux forment un tapis en appui sur le plastique de la boîte de cristallisation. Dans ces conditions, les cristaux sont difficiles à récupérer et à congeler.

Afin d'éviter une très forte nucléation, nous avons réalisé des gouttes en utilisant l'agent précipitant, le PEG 4k, à une concentration plus faible, inférieure à 10%(w/v). A cette concentration de PEG, la nucléation n'est pas spontanée. Une fois la goutte équilibrée, quelques microcristaux préalablement lavés et broyés sont ajoutés à la goutte. Nous avons alors observé que les microcristaux introduits servent de support à la croissance d’aiguilles qui forment des oursins, à la base desquels se trouve le microcristal. Cet ensemencement permet d'obtenir peu de cristaux dans chaque goutte et ceux-ci sont d'une part, plus faciles à congeler et d'autre part, plus épais, avec une épaisseur et une largeur de 10µm (Figure 3 - 9(B)).

Figure 3 - 9: Cristallogenèse du complexe entre le domaine C-terminal de Mlh1 et le peptide Ntg2 (A) (Gauche) Sphérulites obtenues en présence de 20% PEG 3.35k et 0.2M NaI sur la plateforme HTX. (Droite) Meilleurs cristaux obtenus au laboratoire autour de cette condition (28% PEG 3.35k; 0.4M NaI) sous huile de paraffine; Le complexe Mlh1/pNtg2 est à une concentration de 8mg/ml en Mlh1 (B) (Gauche) Aiguilles obtenues au laboratoire à partir du crible Footprint #1 (20% PEG 4k; 0.2M Imidazole Malate pH7). (Centre et droite) Etapes d'optimisation en présence de 22% PEG 4k, 0,4M Imidazole Malate pH7; 20mM DTT sous huile de paraffine; l'échantillon de complexe Mlh1/pNtg2 est à une concentration de 8mg/ml en Mlh1

Ces aiguilles, une fois congelées dans 20% glycérol, ont été analysées sur les lignes synchrotron Proxima1 (Soleil, Gif-sur-Yvette). Ces cristaux possèdent un faible pouvoir de diffraction et se dégradent très rapidement (moins de 50 images de

rotation 1°). Seules quelques images avec des tâches de diffraction à 7Å ont pu être obtenues.

ii. Cristallogenèse du CTD de Mlh1 (503-769) de S. cerevisiae

Devant les premières difficultés rencontrées pour obtenir des cristaux de la région C-terminale de Mlh1 seul ou en complexe avec un peptide de pouvoir diffractant satisfaisant, nous avons entrepris de purifier une forme plus courte du CTD de Mlh1. En effet, les premiers résidus de l'extrémité N-terminale sont prédits comme non structurés. Ces résidus semblent faire partie de la longue région prédite comme non-structurée reliant les domaines N- et C-terminaux de Mlh1 (acides aminés 335 à 507 environ). Afin d’ôter les extrémités non-structurées éventuellement présentes en N-terminal ou C-terminal de la région (485-769) de Mlh1 utilisée dans nos premiers essais de cristallisation, nous avons effectué des tests de protéolyse ménagée à la trypsine. Nous avons incubé pendant différents temps 100µl du CTD de Mlh1 à 1mg/ml avec 0,1% m/m de trypsine (1µl de trypsine à 100µg/ml) dans le tampon Tris à pH8. Nous observons sur gel SDS une forme plus courte de quelques centaines de daltons par rapport à la protéine initiale (poids moléculaire initial environ 33kDa) qui apparaît dès 15min d’incubation. Cette forme tronquée est majoritaire dès 15min d'incubation, à température ambiante ou à 37°C et devient la seule forme observable sur gel SDS au bout de 3h à 37°C (Figure 3 - 10(A)).

Le fragment protéolysé a ensuite été purifié sur colonne d'exclusion de taille (SEC pour Size Exclusion Chromatography en anglais) puis analysé par spectrométrie de masse (MALDI-TOF) et séquençage N-terminal. Le spectre de masse montre quatre pics majoritaires à 30763, 30479, 30235 et 29948Da par rapport à un poids attendu pour le CTD de Mlh1 (485-769) non-protéolysé de 33198Da de la protéine (Figure 3 - 10(B)). Le séquençage N-terminal de l’échantillon protéolysé en solution

montre deux séquences: une majoritaire, 505ERVNVNLTSI et une minoritaire, 507VNVNLTSIKK. Les formes majoritaires et minoritaires correspondantes aux résultats du séquençage N-terminal ont un poids moléculaire théorique de 30727 et 30442Da respectivement dans l'hypothèse où aucune protéolyse n'a eu lieu à l'extrémité C-terminale. Ces masses sont en bon accord avec les valeurs obtenues par spectrométrie de masse.

Figure 3 - 10: Protéolyse ménagée à la trypsine, du domaine C-terminal de Mlh1 (A) Analyses sur gel SDS en conditions dénaturantes de la trypsinolyse du CTD de Mlh1 en fonction de la température: 100µl du CTD de Mlh1 à 1mg/ml est mélangé à 1µl de trypsine à 100µg/ml et 10µl Tris pH8 à 1M (B) Spectre de masse du fragment protéolysé après passage sur colonne d’exclusion stérique

Sur la base de ces résultats, une seconde construction (503-769) de Mlh1(CTD), nommée Mlh1(CTD-v2) a été clonée. Cette construction a été sur-exprimée et purifiée selon le même protocole que Mlh1(CTD-v1) (485-769) précédemment étudiée. Nous avons évalué par calorimétrie l'interaction entre Mlh1(CTD-v2) et le peptide pNtg2 par ITC. Le thermogramme et l'isotherme d'interaction sont en tout point comparable à ceux obtenus avec Mlh1(CTD-v1) (données non montrées). Un second

crible a été réalisé sur la plateforme HTX avec cette nouvelle construction Mlh1 (503- 769). Les 576 conditions de cristallisation ont été testées avec le complexe Mlh1: peptide pNtg2(13-mère) dans un rapport 1:3. Ce crible a été réalisé à trois concentrations différentes en complexe, i.e. 3, 6 et12mg/ml et en utilisant le tampon 20mM HEPES, 150mM NaCl afin d'éviter la formation de cristaux de sels obtenus précédemment avec le tampon Na2HPO4. Des cristaux ont été observés dans 30 conditions parmi les 576 testées et dans 29 autres conditions, nous avons observé des microcristaux, des sphérulites ou du précipité hétérogène28_{. Les conditions de} cristallisation utilisant des cations sont beaucoup moins représentées que dans le crible précédent où le complexe était en tampon phosphate. Parmi les 30 premières conditions, quasiment toutes présentent des aiguilles en présence de PEG, exception faite pour deux conditions ayant comme agent précipitant l'isopropanol. Nous avons sélectionné 10 conditions de cristallisation issues des résultats du robot pour les reproduire au laboratoire. Sur ces 10 conditions, nous avons obtenu des cristaux pour 7 d’entre elles. Comme nous l'avons également constaté pour la construction Mlh1 (485-769), la construction Mlh1(CTD-v2) en complexe avec le peptide pNtg2 cristallise majoritairement en présence de PEG 3.35k ou PEG 4k. Reproduites au laboratoire, ces conditions ont permis d'obtenir des aiguilles en tous points similaires à celles obtenues précédemment. Nous avons notamment observé de façon semblable une amélioration de la cristallisation avec l'ajout de DTT et la réalisation des expériences de cristallisation sous huile de paraffine. Les cristaux obtenus ont été testés sur la ligne Proxima1 du Synchrotron Soleil (Gif-sur-Yvette). Ils ont un pouvoir de diffraction très faible, i.e. vers 8Å.

En conclusion, les essais de cristallisation sur la région C-terminale de Mlh1 seul ou en complexe avec un peptide contenant le motif MIP n’ont pas permis d’obtenir des cristaux de pouvoir diffractant satisfaisant malgré un nombre d’essais de cristallisation important (environ 1200 essais au robot et 2000 essais réalisés manuellement au laboratoire).

A l’issue de ces premiers travaux, nous avons choisi de rediriger nos efforts sur la cristallisation de la région CTD de Mlh1 en complexe avec la région CTD de Pms1 et donc de purifier la région C-terminale de MutLα. La protéine Mlh1 est en effet présente dans la cellule, essentiellement en complexe avec d’autres homologues de MutL, Pms1, Mlh2 et Mlh3. Comme cela a été évoqué en introduction, il a été proposé que la région principale d’hétérodimérisation de Mlh1 soit la région C- terminale. Le complexe Mlh1(CTD)*Pms1(CTD) correspond à une conformation de la région C-terminale de Mlh1 plus proche celle observée dans la cellule. Ce complexe est donc susceptible de présenter un comportement plus favorable d’un point de vue

biochimique que la région Mlh1(CTD) seule ou en complexe avec un peptide. La seconde partie de ma thèse a porté sur l’étude ce complexe CTD Mlh1*CTD Pms1.