P URIFICATION ET CARACTERISATION BIOPHYSIQUE DE LA

REGION

C-

M

1

Les domaines C-terminaux des protéines sauvages Mlh1 de levure (notée Mlh1(CTD) par la suite) et MLH1 humaine (notée MLH1(CTD) par la suite) ainsi que les variants E682A et R547A de la protéine de levure sont produits et purifiés suivant un protocole identique3_.

Le domaine C-terminal de Mlh1 est surexprimé en fusion avec en position N- terminale la Glutathion-S-Transférase (GST) étiquettée 6×His. La protéine de fusion possède un site de clivage à la protéase TEV entre l'étiquette 6×His-GST et Mlh1(CTD) (485 à 769). Les extraits bruts, avant et après induction des cultures du domaine C-terminal de Mlh1, sont analysés sur gel SDS-PAGE. Le gel indique une forte surexpression d’une bande à la hauteur de la protéine de fusion GST-Mlh1 (PM 62 kDa) (résultat non montré). Les surnageants après lyse cellulaire et centrifugation de 1L de culture d'E. coli, sont chargés sur une colonne de glutathion (Figure 3 - 3 (A)). Environ 100mg de GST- Mlh1(CTD) natif et 20mg des fusions des mutants de

Mlh1 par litre de culture, sont élués de la colonne d'affinité (les concentrations sont estimées par la méthode de Bradford). Environ 400mg de fusion GST-domaine C- terminal humain MLH1 (486 à 756) sont obtenus par litre de culture.

L'éluat de la colonne d'affinité est ensuite coupé avec 1% (m/m) (pour masse/masse) de protéase TEV à 4°C sur la nuit. Les protéines portant une étiquette 6×His sont éliminées par passage sur une colonne de nickel. Mlh1(CTD) ou MLH1(CTD) ne sont pas retenus (Figure 3 - 3(A)). Les protéines humaines et de

levure ont des rendements différents à cette étape. La moitié environ des protéines de fusion correspond à la GST qui est fixée sur la colonne. Sur l'autre moitié, on récupère en sortie directe environ 60% de Mlh1(CTD) de levure attendu et 30% de MLH1(CTD) humain attendu. Pour MLH1(CTD) humain, ce rendement de purification a été amélioré en coupant directement sur la colonne de glutathion la protéine de fusion GST-MLH1.

La protéine Mlh1(CTD) est ensuite concentrée et purifiée sur colonne par exclusion de taille. Le chromatogramme de Mlh1(CTD) de levure ou humain, présente un premier pic (de 1 à 10% de l’aire totale à 280nm) autour du volume mort de la colonne. Le second pic, pic principal, (environ 80% de l’aire totale à 280nm) sort à un volume d'élution de 132ml. Ce volume d'élution est légèrement supérieur au

volume de sortie de l’Albumine (PM=67kDa). Le chromatogramme du Mlh1(CTD) de levure présente, en général, un 3ème _{pic (environ 10% de l’aire totale à 280nm) vers} 152ml. Ce volume d'élution est légèrement supérieur à celui observé avec l’Ovalbumine (PM=43kDa) (Figure 3 - 3(B)). Ce pic n’est pas présent sur le

chromatogramme de MLH1(CTD) humain (Figure 3 - 3(C)). Cette étape de polissage

élimine de légers contaminants d'après le gel SDS-PAGE et présente un rendement de 90% pour les différents CTD de Mlh1 purifiés.

L’analyse sur gel SDS-PAGE montre que les deux ou trois pics, selon les cas, contiennent essentiellement Mlh1(CTD). Le domaine C-terminal de Mlh1 a un poids moléculaire de 31,2 kDa chez la levure et 31,4 kDa chez l'humain. Le premier pic correspond à une forme agrégée de la protéine. Le second pic, qui contient l'essentiel Mlh1(CTD), possède un rayon de Stokes qui, d'après les calibrations, correspond à un PM apparent de 64 kDa. Le troisième pic correspond également à Mlh1(CTD) sur gel avec un poids moléculaire apparent de 35kDa. Ces résultats suggèrent que le second et le troisième pic de cette étape de purification correspondent respectivement à une forme dimérique et monomèrique de Mlh1(CTD). Les chromatogrammes obtenus pour les variants R547A et E682A lors du passage sur cette même colonne d’exclusion de taille sont similaires, permettant, au final, l’obtention d’un échantillon de qualité satisfaisante (Figure 3 - 3(D)). A l’issue de cette étape de polissage, sont obtenus près

de 20mg de Mlh1(CTD) natif de levure et 5mg des deux variants de levure, R547A et E682A, par litre de culture d'E. coli. On obtient environ 50mg de MLH1(CTD) natif humain.

Figure 3 - 3: Gels SDS-PAGE et chromatogrammes de différentes étapes de purification du domaine C- terminal de Mlh1 de levure et humain (A) Gels SDS-PAGE des trois étapes de purification de Mlh1(CTD) natif (B) Chromatogramme de Mlh1(CTD) de levure natif sur colonne d'exclusion de taille (C) Chromatogramme de MLH1(CTD) humain natif sur colonne d'exclusion de taille et gel SDS-PAGE du pic principal. (D) Gel SDS-PAGE en sortie de chromatographie d'exclusion stérique du pic principal du domaine C-terminal de Mlh1 E682A

Pour s'assurer de la qualité des échantillons obtenus en fin de purification, les protéines purifiées sont analysées par des expériences de dichroïsme circulaire et de diffusion dynamique de la lumière (DLS).

Les spectres de dichroïsme circulaire de Mlh1(CTD) de levure (Figure 3 - 4(A))

et humain (Figure 3 - 4(D)) présentent, tous les deux, les caractéristiques d'un spectre

de protéines repliées. Les spectres obtenus présentent les caractéristiques d'un repliement α/β. On observe en effet un signal caractéristique d’un mélange d'hélices α

(maximum vers 195nm et minima à 208 et 222nm) et de feuillets β (maximum vers 195nm et minimum à 215nm). La dénaturation thermique suivie par dichroïsme circulaire du domaine C-terminal de Mlh1 de levure montre un signal de déstructuration vers 54°C (Figure 3 - 4(B)). La transition intervient à 44°C pour le

domaine humain (Figure 3 - 4(E)). Le variant E682A de levure présente des

caractéristiques identiques à la protéine native4_.

L'analyse par diffusion dynamique de la lumière montre que les échantillons en sortie de purification sont monodisperses, et ce, jusqu'à deux semaines après la production. Au delà, on observe la formation d'agrégats (mis en évidence en DLS par l'apparition d'une population de taille supérieure à 100nm). Au-delà de deux semaines de conservation à 4°C, on observe également une légère dégradation de la protéine (bandes situées sous la bande principale sur gel SDS-Page). Les CTD de Mlh1 et MLH1 ont un rayon de Stokes apparent de 6.97 et 6.56nm respectivement, ce qui correspond à des protéines globulaires d'environ 64 et 54kDa (Figure 3 - 4(C)&(F)). Ce résultat est en accord avec les volumes d'élution mesurés sur colonne

par exclusion de taille. Ceci suggère qu'à la concentration de 0.5mg/ml en Mlh1(CTD) ou MLH1(CTD), les deux protéines se trouvent vraisemblablement dans un état homodimérique.

Figure 3 - 4 : Analyses par dichroïsme circulaire et diffusion de lumière du domaine C-terminal de Mlh1 (A) Spectre de dichroïsme circulaire du domaine C-terminal de Mlh1 ; le spectre est enregistré entre 195 et 250nm à 20°C ; l’échantillon est à une concentration de 7µM (B) Dénaturation thermique du domaine C-terminal de Mlh1 ; la dénaturation est suivie par dichroïsme circulaire à 222nm entre 20 et 90°C (C) Spectre de diffusion dynamique de lumière du domaine C-terminal de Mlh1 pondéré en volume ; l’échantillon est à une concentration de 0.5mg/ml (D) Spectre de dichroïsme circulaire du domaine C- terminal de MLH1 ; le spectre est enregistré entre 195 et 250nm à 20°C ; l’échantillon est à une concentration de 10µM (E) Dénaturation thermique du domaine C-terminal de Mlh1 ; la dénaturation est suivie par dichroïsme circulaire à 222nm entre 20 et 90°C (F) Spectre de diffusion dynamique de lumière du domaine C-terminal de MLH1 pondéré en volume ; l’échantillon est à une concentration de 0.5mg/ml

A l'issue de la purification, ces résultats indiquent que les protéines ainsi purifiées, sont correctement repliées et présentent une bonne homogénéité de taille et forme.

3.1.3

C