IV.C Détection du taux de mauvais repliement des protéines (prion) par voie électrochimique
IV.C.1 Introduction
Dans les dernières décennies, de nouveaux agents pathogènes ont émergé, montrant de propriétés biologiques différentes par rapport à celle que nous avions l'habitude de connaître. Ils sont responsables de maladies telles que la maladie de Creutzfeldt Jakob (MCJ), l'encéphalopathie spongiforme transmissible (TSE), la maladie d'Alzheimer (AD) et la maladie de Parkinson [239] qui sont des maladies neurodégénératives fatales pour l'homme et l’animal [240]. Ils partagent les mêmes propriétés pathogènes : la transformation des protéines normales en protéines mal repliées et agrégées donnant des structures amyloïdes : TSE (PrPSC dans la tremblante des moutons, PrPST dans la maladie de Creutzfeldt –Jakob (MCJ), la maladie d'Alzheimer (Aß amyloïde) et la maladie de Parkinson (α -synucléine) [241-243]. Un diagnostic précoce de ces maladies nécessite des technologies qui permettent la détection de très faibles quantités de structures amyloïdes [240]. À ce jour, aucun test de diagnostic capable d'identifier ces troubles protéines de mauvais repliement n’est disponible. Le diagnostic précoce de ces maladies nécessite des technologies très sensibles qui permettent la détection de très petites quantités de protéines circulant pathogènes [247]. Comme il y a une grande abondance de la protéine normale dans le sang, ces agrégats de protéines sont à peine détectés. Récemment, des technologies innovantes ont vu le jour dans le domaine du diagnostic. En particulier les combinaisons de la nanotechnologie et de la technologie des laboratoires sur puce sont prometteuses pour mettre au point un essai rapide et efficace, de grande sensibilité et de faible coût. Dans le domaine des technologies de micro-capteurs, les détections électrochimiques de l’activité de la peroxydase de raifort (HRP) est réalisable [248]. Donc, le but de l'étude est de développer un test de diagnostic sensible simple et rapide permettant la détection précoce dans le sang de ces maladies neurodégénératives. Ce nouveau test est basé précisément, sur la combinaison de deux technologies innovantes : un système de détection Multimer (SDM) développé par une équipe coréenne qui peut différencier la protéine anormale à partir de monomères (protéine normale) à l'aide d’anticorps spécifiques et un système de lecture à base de micro-capteurs BDD. Notre premier objectif est de trouver l'association la plus pertinente entre les deux technologies utilisant du sang de moutons infectés.
Après incubation, les billes magnétiques sont séparées et l'activité de HRP est détectée en présence de son substrat, le tert-butyl catéchol et du peroxyde d'hydrogène.
Figure IV.13: Schéma de la reconnaissance de la protéine anormale de la protéine normale
monomère à l'aide d'anticorps spécifiques Ab1 et Ab2
La détection électrochimique de l'activité de l’HRP est basée sur le principe suivant : le Tert-butyl catéchol sera d'abord oxydé en présence de l’HRP et de l’H2O2 en o-quinone. Le courant cathodique en raison de la réduction de l'o-quinone sur la surface de micro-électrodes est ensuite mesuré (Figure IV.14).
Figure IV.14: Principe de la mesure électrochimique de l'activité HRP
IV.C.3 Détection électrochimique de l'activité HRP
Avant d'utiliser le système de détection multimer, développés par le partenaire coréen, nous avons fait des tests sur la détection de l'activité de HRP avec des billes magnétiques revêtues d’HRP en les piégeant dans un système microfluidique par un aimant. La détection
CHAPITRE IV
BDD ET AUTRES DETECTIONSélectrochimique est effectuée en utilisant une micro-cellule de diamant dopé bore (BDD) (figure III.4) placés en aval des billes piégées.
Après lavage, les solutions de tetrabutyl catéchol avec le peroxyde d'hydrogène peuvent ensuite être injectées (figure IV.15) et le produit de la réaction enzymatique détecté électrochimiquement.
Figure IV.15 : Schéma du système microfluidique pour la détection de l’HRP en immobilisant les billes magnétiques fonctionnalisées dans le micro-canal.
Les avantages de ce microsystème sont l'utilisation d'une très petite quantité de billes magnétiques ainsi que la facilité de recyclage. Après chaque expérience, et retrait de l’aimant, on injecte le PBS du côté de la sortie, les billes magnétiques sont directement rejetées à l'extérieur du système (figure IV.16).
IV.C.4 Résultats et discussions
IV.C.4.1 Effet de la concentration en tétra électrochimique
La concentration du tétra
d'hydrogène, sur l'électrode nu, et en présence de billes magnétiques fonctionnalisées HRP, tel que présenté sur la figure IV.17.
avec un pic de réduction maximum à
Les conditions expérimentales pour la détection de l’O enzymatique sont les suivants
• La fenêtre du potentiel varie entre
à 0,1 V/s, Estep = 0,01 V, et la fréquence = 25 kHz
• La concentration du tétrabutyle catéchol : x mM TBC dilué dans du PBS + 1mM H (solution1).
Les courbes SWV obtenues, en présence de billes magnétiques fonctionnalisées HRP et pour différentes concentrations de tétra
Un pic de réduction à -0,2 V est observé. La hauteur de ce pic est maximum pour 1mM de TBC. -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0 -0,6 -0,8 -1,0 -1,2 -1,4 -1,6 -1,8 -2,0 -2,2 -2,4 -2,6 I (µ A ) E (V)
Figure IV.17 : Influence de la concentration à ondes carrées
On a ensuite fait varier l
billes non fonctionnalisées. Les courbes SWV pour différents rapports sont présenté sur la figure IV.18 (A). On constate que l’intensité du maximum du pic varie linéairement avec le rapport.
A
iscussions
Effet de la concentration en tétra-butylcatechol sur le signal électrochimique
La concentration du tétra-butylcatéchol (TBC) est modifiée en présence du peroxyde d'hydrogène, sur l'électrode nu, et en présence de billes magnétiques fonctionnalisées HRP, tel que présenté sur la figure IV.17. Une courbe SWV (voltamétrie à ondes carrées) est obtenue avec un pic de réduction maximum à-0.2V.
Les conditions expérimentales pour la détection de l’O-quinone, produit de la réaction :
nêtre du potentiel varie entre -0,5 et +0,2 V (SWV) avec une vitesse de balayage la fréquence = 25 kHz
tétrabutyle catéchol : x mM TBC dilué dans du PBS + 1mM H
enues, en présence de billes magnétiques fonctionnalisées HRP et pour différentes concentrations de tétra-butylcathéchol sont présentés sur la figure IV.17.
0,2 V est observé. La hauteur de ce pic est maximum pour 1mM de
0,1 0,2 0,3 0 1mM 5mM 10mM
Influence de la concentration du tétra-butylcatéchol sur signal à ondes carrées en présence des billes fonctionnalisées.
On a ensuite fait varier le rapport des billes fonctionnalisées HRP
billes non fonctionnalisées. Les courbes SWV pour différents rapports sont présenté sur la figure IV.18 (A). On constate que l’intensité du maximum du pic varie linéairement avec le
0 0,25 0,5 0,75 1 0 1 I (µ A ) [TBC] mM B
butylcatechol sur le signal
butylcatéchol (TBC) est modifiée en présence du peroxyde d'hydrogène, sur l'électrode nu, et en présence de billes magnétiques fonctionnalisées HRP, tel
Une courbe SWV (voltamétrie à ondes carrées) est obtenue
quinone, produit de la réaction vitesse de balayage égale tétrabutyle catéchol : x mM TBC dilué dans du PBS + 1mM H2O2
enues, en présence de billes magnétiques fonctionnalisées HRP butylcathéchol sont présentés sur la figure IV.17. 0,2 V est observé. La hauteur de ce pic est maximum pour 1mM de
sur signal de la voltamétrie des billes fonctionnalisées.
HRP injectées sur des billes non fonctionnalisées. Les courbes SWV pour différents rapports sont présenté sur la figure IV.18 (A). On constate que l’intensité du maximum du pic varie linéairement avec le
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