Travail moléculaire

Le travail moléculaire repose sur des échantillons de tissus accumulés au fil des ans lors de campagnes de collecte ou donnés par des collègues. Les échantillons sont la plupart stockés dans l’alcool à 70˚, souvent au frais, parfois congelés. L’ADN génomique est extrait des tissus,

puis utilisé pour l’amplification par PCR (MULLISet FALOONA, 1987) des marqueurs d’intéret.

Les amplifiats jugés convenables sont ensuite séquencés. Les séquences sont enfin traitées informatiquement pour produire les matrices de caractères à analyser.

6.3.1. Extraction

Une bonne partie des extraits d’ADN étaient déjà disponibles, suite aux travaux de Wei-Jen

CHENet d’Agnès DETTAÏ. Quelques uns sont issus d’échanges avec Leo SMITHou Wei-Jen

CHEN. Les nouveaux extraits ont été obtenus selon deux méthodes ; extraction classique au

CTAB ou à la machine (ABI PRISM 6100). Dans les deux cas, le principe général est le même et commence toujours par une fragmentation au scalpel d’un petit morceau de tissu. Le tissu est ensuite digéré à 60˚C. La suite a pour but de séparer l’ADN des autres constituants du tissu et de le récupérer dans une solution ne nuisant pas au bon déroulement de l’amplification par PCR. L’ADN génomique est éventuellement visualisé aux ultra-Violets après migration par

électrophorèse sur gel d’agarose en présence de BET7. Les extraits sont conservés à −20˚C.

6.3.2. Amplification par PCR

Cette opération consiste à obtenir un très grand nombre de copies d’un fragment d’ADN compris entre les sites d’hybridation de deux oligonucléotides bien choisis ; les amorces (aussi appelées sondes, voir tableau 6.2).

Ces amorces, une fois hybridées sur l’ADN, permettent l’initialisation de la réplication de l’ADN par une polymérase en présence de désoxyribonucléotides tri-phosphate et de divers additifs, et chacun des réplicats ainsi obtenus peut à son tour être répliqué puisqu’il comprend les sites d’hybridation des amorces. Il faut que les fragments nouvellement synthétisés se séparent de

7Le BET, ou bromure d’éthidium est un agent intercalant ; c’est-à-dire qu’il s’intercale entre les bases azotées de l’ADN, ce qui rend ce dernier fluorescent. Une conséquence de cette propriété intercalante est que le BET est également un agent mutagène ; sa manipulation se fait sous haute protection (blouse, décapsuleur pour le tube, gants en nitrile, lunettes de protection, poubelle spéciale).

Partie II Chapitre 6

Tableau 6.2. Sondes utilisées.

Nom Gène Séquence Source

C17F3111 RNF213 GCTGACTGGATTYAAAACCTT nouveau C17F3128 RNF213 CCTTTGTGGTGGAYTTYATGAT nouveau C17F3150 RNF213 WCTGATGGCNAARGACTTTGC nouveau C17R4036 RNF213 GGRATRGANCCNAGCTTTTCAT nouveau C17R4096 RNF213 CCANACCAGAGGGATCATRCT nouveau C17R4111 RNF213 AACTGTCCAAARTCCCACAC nouveau

IRBPL1338 IRBP GTGRAAGGAGAYTTTGATCAGCTC DETTAÏet LECOINTRE(2008) IRBPL922 IRBP TGATNNCRGTKGCRAGGGCATC DETTAÏet LECOINTRE(2008) IRBPL936 IRBP CACGGAGGYTGAYNATCTTGAT DETTAÏet LECOINTRE(2008) IRBPL953 IRBP CNGGAAYYTGARCACGGAGG DETTAÏet LECOINTRE(2008) IRBPU104 IRBP ATAGTYNTGGACAANTACTGCTC DETTAÏet LECOINTRE(2008) IRBPU110 IRBP TGGACAAYTACTGCTCRCCAGA DETTAÏet LECOINTRE(2008) MllL2080 MLL4 GTGAACTCMAYCAGTCCTCC nouveau

MllL2105 MLL4 ACCYTGCGTTGGGARGTGG nouveau

MllL2158 MLL4 ARAGTAGTGGGATCYAGRTACAT DETTAÏet LECOINTRE(2005) MllU1477 MLL4 AGYCCAGCRGTCATCAAACC DETTAÏet LECOINTRE(2005) MllU1499 MLL4 GTCAATCAGCAGTTCCAGC DETTAÏet LECOINTRE(2005) MllU1570 MLL4 CCCYCAAAAKATCARTGCCAC nouveau

MllU1590 MLL4 CRGGRGTGATNGACACCAGC nouveau

Rh1039r Rhodopsine TGCTTGTTCATGCAGATGTAGA CHENet al.(2003) Rh1073r Rhodopsine CCRCAGCACARCGTGGTGATCATG CHENet al.(2003) Rh193 Rhodopsine CNTATGAATAYCCTCAGTACTACC CHENet al.(2003) Rh667r Rhodopsine AYGAGCACTGCATGCCCT CHENet al.(2003)

leur matrice pour qu’une nouvelle phase d’hybridation des amorces et de réplication de l’ADN puisse avoir lieu. La PCR est donc une succession de cycles (entre 25 et 65) à trois étapes :

1. dénaturation de l’ADN par chauffage (aux alentours de 94˚C), afin que les brins d’ADN se séparent pour laisser les sites d’hybridation des amorces accessibles ;

2. hybridation des amorces, à plus basse température (entre 40˚C et 65˚C) ;

3. élongation par la polymérase, à une température comprise entre la température d’hybri-dation et celle de dénaturation (en général vers 72˚C, mais avec certaines polymérases, pour de longues PCR, cette étape peut se faire à 68˚C, ce qui évite une trop importante dégradation de l’enzyme).

Ces cycles sont précédés par une étape de dénaturation initiale plus longue, afin de bien séparer les brins de l’ADN génomique, et sont suivis d’une étape d’élongation finale, qui a pour but d’éviter que certains fragments amplifiés soient incomplets, ce qui perturberait le séquençage. La qualité de l’amplifiat est jugée par migration sur gel (voir page 76) accompagnée d’un marqueur de taille. On suppose la réaction de PCR réussie quand le fragment d’ADN obtenu a la

taille attendue d’après la position des sites d’hybridation des amorces8 et n’est pas accompagné

d’amplifiats non désirés qui pourraient perturber le séquençage.

La qualité de l’amplification dépend d’un certain nombre de facteurs, comme la qualité de l’extrait d’ADN utilisé, l’adéquation des amorces à la séquence de leurs sites d’hybridation chez l’individu séquencé, la température d’hybridation, les proportions des réactifs, la cinétique

du thermocycleur9 . . . Ceci peut nécessiter de longs tâtonnements avant l’obtention d’un bel

amplifiat pour chaque espèce10.

6.3.3. Séquençage

Le séquençage selon la méthode de SANGER et al.(1977) repose sur le même principe que

la PCR, en utilisant comme matrice de départ l’amplifiat purifié, et en ajoutant au milieu de réaction des didésoxyribonucléotides. Ces derniers n’ont pas de terminaison 3’-OH, ce qui bloque l’élongation du brin d’ADN en train d’être synthétisé. Il en résulte un mélange de brins d’ADN de diverses longueurs qui seront séparés par électrophorèse. Dans le cas du séquençage par séquenceur automatique, les quatre types des didésoxyribonucléotides sont liés chacun à un fluorochrome différent. Les amplifiats de la réaction de séquençage sont soumis à une électrophorèse. Les brins de différentes tailles passent alors successivement devant un détecteur

8Sauf cas particuliers, la taille des marqueurs est sensiblement la même entre taxons.

9L’appareil qui chauffe et refroidit les tubes où se déroule la PCR est plus ou moins rapide ou lent à porter le mélange réactionnel à la température voulue au moment voulu, ce qui influe par exemple sur la qualité de l’hybridation des sondes et fait qu’un programme de PCR ne donne pas forcément les mêmes résultats d’un thermocycleur à l’autre. Même l’épaisseur des tubes semble avoir une influence.

10Un certain nombre d’échecs à la PCR ont été une motivation supplémentaire pour tenter de rendre l’indice de répétition tolérant aux taxons manquants

Partie II Chapitre 6 qui enregistre l’intensité et la couleur du signal correspondant au nucléotide terminant le brin. Ainsi, on obtient un chromatogramme qui, après traitement informatique, permet la lecture de la succession des bases de l’ADN séquencé.

Les premières séquences de la thèse ont été obtenues sur le séquenceur du SSM, qui était relativement vieux et peu précis ; les séquences étaient souvent de mauvaise qualité. Au cours de la thèse, un partenariat avec le Génoscope a permis de confier le séquençage à cet organisme, qui dispose de matériel performant.