Transfert atmosphère-plante

Outre l’assimilation des métaux dans les végétaux via les racines, la contamination des végétaux par les métaux peut s’effectuer, de manière directe, suite à des dépôts atmosphériques de particules métalliques sur les feuilles.

2.2.1.

Accumulation et devenir des métaux dans les feuilles des

végétaux supérieurs

a. Voies potentielles d’accumulation et d’entrée des métaux dans les

feuilles des végétaux supérieurs

Les feuilles des végétaux sont constituées de différents organes qui vont servir de réceptacles pour les particules riches en métaux. Ainsi, le piégeage des métaux dans le compartiment foliaire (Figure 6) peut s’effectuer via la cuticule, membrane organique recouvrant l’épiderme des feuilles et/ou via les stomates, orifices permettant les échanges gazeux entre la plante et l’air ambiant, et met

en jeu différents mécanismes. L’insertion des polluants dans les feuilles va dépendre d’une part des caractéristiques morphologiques de la plante étudiée, telles que l’épaisseur de la cuticule et la présence ou non de stomates en surface externe ainsi que leur nombre, et d’autre part des propriétés physico-chimiques des particules (taille, solubilité, spéciation…).

Figure 6. Voies d'entrée possibles des polluants dans les feuilles des végétaux supérieurs (Rzepka, 2008).

a.1. L’absorption par les stomates

Les stomates sont des orifices de petite taille (dizaine de microns) situés au niveau de l’épiderme foliaire (Figure 7). Un stomate est constitué de deux cellules épidermiques (cellules de garde) en forme de croissants, qui délimitent l’orifice stomatique. Ils sont généralement présents sur la face inférieure des feuilles (face abaxiale), mais chez certaines espèces végétales, comme par exemple le chou commun (Brassica oleracea) ou la laitue (Lactuca sativa L.), ils sont également présents sur la surface supérieure des feuilles (face adaxiale). Ils peuvent alors constituer une voie d’entrée potentielle des polluants métalliques dans les tissus de la feuille. Dans la littérature, les stomates sont décrits comme étant une voie préférentielle d’entrée des polluants hydrosolubles à faible poids moléculaire, soit les polluants gazeux et notamment les composés organiques volatiles ou COV (Rzepka, 2008 ; Ugrekhelidze et al., 1997 ). Le phénomène de turgescence des cellules provoque l’ouverture du stomate pour permettre les échanges gazeux impliqués dans la physiologie de la plante (entrée du CO2 pour la photosynthèse, évapotranspiration). Sous certaines conditions environnementales (stress hydrique), les stomates se ferment pour permettre à la plante de limiter les pertes en eau. Plusieurs facteurs externes tels que la lumière, le CO2 ou encore l’humidité présente dans l’air vont conditionner le degré d’ouverture des stomates.

Figure 7. Observation d'un stomate présent sur les feuilles adaxiales de l'espèce Brassica oleracea après métallisation de l’échantillon (Au/Pd), barre d'échelle = 10 µm.

La quantité de polluants métalliques susceptibles de pénétrer la feuille via les stomates va alors dépendre (i) du nombre de stomates présents sur la face adaxiale de la feuille (ii) du degré d’ouverture des stomates (iii) de la taille des polluants pour laquelle l’entrée va être limitée par la taille de l’orifice stomatique. Une fois entrés dans les tomates, les polluants vont pouvoir atteindre la chambre sous-stomatique et pénétrer alors dans les cellules de l’épiderme. Ils sont alors susceptibles de causer des dommages structuraux au sein des cellules de la feuille qui vont perturber le fonctionnement de la plante. D’autre part, les particules dont la taille est plus importante que celle des orifices stomatiques sont susceptibles de les recouvrir, entravant ainsi les échanges gazeux avec le milieu extérieur. Ce dernier phénomène reste tout de même limité au vu du nombre de stomates pouvant être présents.

Afin de limiter ces effets, les stomates peuvent réguler l’entrée des polluants suivant deux mécanismes différents mis en avant par Kimmerer et Kozlowski (1981). Le mécanisme d’évitement actif consiste en la fermeture de l’ensemble des stomates, ce qui permet alors de bloquer les échanges avec le milieu extérieur et donc l’entrée potentielle des polluants dans les tissus de la feuille. Cependant, la fermeture des stomates empêche également l’entrée de CO2 nécessaire à la photosynthèse, et peut donc, à terme, causer des dommages à la plante. Le mécanisme d’évitement passif repose sur une fermeture partielle des stomates, permettant alors de réduire les échanges avec le milieu extérieur. Les dommages causés par l’entrée des polluants sont donc limités mais, par cette action, le métabolisme de la plante est ralenti en permanence.

a.2. La voie cuticulaire

La cuticule est une couche de protection caractéristique des surfaces végétales exposées à l’air, qui recouvre les parois externes des cellules épidermiques des feuilles. Elle joue notamment un rôle protecteur contre le dessèchement, en limitant les pertes d’eau par le végétal (Feakins et Sessions, 2010 ; Rieder et Schreiber, 2001), et le stress lié à l’environnement extérieur tel que les dommages mécaniques, la présence de microbes ou de polluants (Riederer, 2006). Elle a également un rôle à jouer contre les radiations UV (Kunst et Samuels, 2003). La cuticule des feuilles est composée de deux constituants majeurs : la cutine et les cires cuticulaires. La cutine est un liquide insoluble servant de matrice à des dépôts de composés lipidiques solubles à longues chaînes, appelés cires cuticulaires. La cuticule peut comporter une ou plusieurs couches de cires cuticulaires enrobées dans la cutine, formant des assises hydrophobes qui limitent les pertes d’eau par la plante (Bouzoubaâ et al., 2011 ; Yeats et Rose, 2013).

Les cires cuticulaires peuvent alors être déposées à l’intérieur de la matrice formée par la cutine et sont alors appelées cires intracuticulaires ; ou, au contraire, s’accumuler en surface de la cutine sous formes de cristaux ou de films de cires épicuticulaires. Ainsi, de l’intérieur des feuilles vers la surface, on peut distinguer (Figure 8):

 Les parois cellulaires, constituées de polysaccharides

 La cuticule secondaire, qui correspond à un mélange de cutine, de cires cuticulaires et des constituants de la paroi tels que la pectine et la cellulose (Lopez- Casado et al., 2007)

 La cuticule primaire, composées de la cutine et des cires intracuticulaires  Les cires épicuticulaires de surface, recouvrant la cuticule primaire

La structure et la composition chimique de la cuticule varient en fonction des plantes (même pour des espèces apparentées), des organes et des stades de développement (Dominguez et al., 2011 ; Heredia, 2003 ; Jenks and Ashworth, 1999). Ainsi, l’âge de la feuille influe fortement sur la composition de la cuticule. La synthèse de la cutine s’arrête juste après le développement complet de la feuille, alors que la quantité de cires cuticulaires continue d’augmenter (Schönherr et Bukovac, 1978).

Figure 8. Représentation structurale des différentes couches composant la cuticule (Yeats et Rose, 2013).

De même, selon l’espèce considérée, la quantité de cutine (et des cires) peut varier de quelque µg.cm-2 _{à plus de 1000 µg.cm}-2_{, son épaisseur allant de l’échelle submicronique à la dizaine} de microns (Heredia, 2003 ; Walton, 1990).

Aussi, la quantité et la composition des cires peuvent être fortement influencées par les facteurs environnementaux tels que la température, l’humidité ou encore le rayonnement UV (Bouzoubaâ et

al., 2011 ; Kosma et al., 2009 ; Paoletti, 2005 ; Yeats and Rose, 2013). La Figure 9 montre les

différences de quantités cireuses dans les feuilles selon l’espèce végétale considérée et met en avant l’influence de l’humidité relative sur ces quantités. La modification de ces paramètres (quantité de cires, composition chimique, structure…) va alors dépendre des fonctions ou mécanismes que la plante va mettre en jeu afin d’assurer sa protection.

Figure 9. Différences de quantités cireuses dans les feuilles selon l'espèce végétale considérée et influence de l'humidité relative sur les quantités déterminées (Koch et al., 2006).

Le caractère lipophile de la cuticule va permettre l’accumulation et le piégeage des polluants hydrophobes de haut poids moléculaire. Les quantités de polluants accumulées vont dépendre de la rugosité des cires ainsi que de la présence d’eau en surface des feuilles. Mais, en réduisant les capacités de rétention d’eau en surface des feuilles, la cuticule permet de limiter les dépôts foliaires de poussières. Une fois accumulés en surface, les polluants sont alors susceptibles de pénétrer dans

les tissus foliaires en diffusant à travers la cuticule où ils vont être métabolisés, stockés ou bien éliminés par la plante. Cependant, le passage des polluants dans les tissus va potentiellement entraîner des dommages chez la plante.

Dans le paragraphe suivant, la composition, la structure ainsi que la morphologie des cires épicuticulaires, auxquelles nous nous sommes intéressés dans nos travaux, font l’objet d’une étude plus approfondie.

b. Cires épicuticulaires : composition, structure et typologie

La cuticule primaire (cutine et cires intracuticulaires) est recouverte par une couche externe de cires appelées cires épicuticulaires, dont l’épaisseur, la proportion et la morphologie sont variables d’une espèce végétale à une autre. Ainsi, les cires épicuticulaires peuvent se présenter sous la forme d’un film fin ou sous forme de cristaux dont la structure est tridimensionnelle (Jetter et Riederer, 1994 ; Koch et al., 2006 et 2008) dont la plage s’étend généralement de la centaine de nanomètres à la centaine de micromètres (0,2 µm à 100 microns) chez la plupart des espèces végétales.

Les cires épicuticulaires sont constituées d’un mélange complexe d’alcanes, d’alcools, de cétones, d’aldéhydes, d’acides gras à longues chaînes et d‘esters. La longueur des chaînes carbonées est généralement comprise entre 21 et 37 atomes de carbones, avec une prédominance des chaînes paires ou impaires selon le type de composés. Ainsi, les acides gras (carboxyliques, dicarboxyliques, hydroxylés), les alcools primaires et les diols vont présenter majoritairement des chaînes paires. En revanche, une prédominance des chaînes impaires est à noter pour les alcanes, les alcools secondaires et les mono- et dicétones. Chez Brassica oleracea, la prédominance des alcanes en C29 (nonacosane) et de leurs dérivés oxygénés a été reportée, ces espèces représentant 60% de la composition des cires de surface. La présence d’acides gras libres en C20 et d’alcools primaires en C26 est également mentionnée. Par ailleurs, les dicétones et les diols ne semblent pas entrer dans la composition des cires épicuticulaires chez cette espèce (Eglinton et Hamilton, 1967 ; Purdy et Truter, 1963). Récemment, trois terpénoïdes majeurs (lupéol, amyrines  et ) ont été identifiés au sein des cires de surface chez Brassica oleracea.

La proportion des espèces au sein des cires ainsi que leurs propriétés intrinsèques (groupes fonctionnels, degré de ramification des chaînes et d’insaturation) vont jouer un rôle dans la structuration des cires mais également dans leur diversité morphologique.

La morphologie des cires épicuticulaires ainsi que leur proportion ont largement été étudiées suite à l’apparition de la microscopie électronique à balayage (Barthlott et al., 1998 ; Jeffree et al.,

2006 ; Juniper et Bradley, 1958 ; Koch et al., 2006 et 2008). Des différences notables sont observées selon l’espèce végétale considérée. Ainsi, Brassica oleracea fait partie des végétaux qui possèdent une forte densité de cristaux de cires épicuticulaires en surface des feuilles (Barthlott et al., 1998) comme le montre la Figure 10.

Les observations microscopiques réalisées à la surface des feuilles montrent l’omniprésence d’une fine pellicule de cires épicuticulaires à laquelle peuvent se superposer des structures cireuses sous forme de couches (lisses ou rugueuses) ou de cristaux dont les morphologies sont nombreuses.

Figure 10. Image des cristaux de cires épicuticulaires présents sur les feuilles chez l’espèce végétale Brassica

oleracea obtenue par microscopie électronique à balayage après métallisation (Au/Pd) de l’échantillon.

La présence de cristaux tridimensionnels composants les cires épicuticulaires rendent la surface des feuilles plus hydrophobe et entraine donc leur faible mouillabilité (Wagner et al., 2003 ; Koch et al., 2008). D’autre part, la forte hydrophobicité induite par les cristaux au niveau des surfaces foliaires permet de limiter les pertes d’eau chez la plante (Riederer et Schreiber, 2001 ; Schreiber et

al., 2001). Ces cristaux leur confèrent également des propriétés autonettoyantes permettant une

élimination plus aisée des substances pathogènes (insectes, champignons, bactéries…) et des particules pouvant se déposer en surface des feuilles et assurent d’autre part la protection des feuilles en évitant l’abrasion mécanique des cellules épidermiques par le vent (Eglinton et Hamilton, 1967).

Six familles morphologiques principales de cristaux de cires épicuticulaires ont été mises en avant lors de travaux antérieurs (Barthlott et al., 1998 ; Jeffree et al., 2006). Ainsi, sur le film fin de cires épicuticulaires constamment présent en surface des feuilles peuvent s’ajouter des cristaux sous

forme de croûtes plus ou moins massives, de granules, de plaques et plaquettes, de filaments, de bâtonnets, et de tubules creuses en leur centre. La typologie des cires épicuticulaires est présente Figure 11.

Figure 11. Typologie des différentes familles de cires épicuticulaires présentes en surface des feuilles des végétaux (d'après Barthlott et al., 1998 et Koch et al., 2006).

En plus de la typologie variée que présentent les cires épicuticulaires, s’ajoutent différentes possibilités d’arrangement des cristaux entre eux. Ainsi, l’orientation des plaquettes peut se faire en rosette, en parallèle ou en groupe de plaquettes parallèles. De même, les cristaux de baguettes et les tubules peuvent s’agréger entre eux. Il existe aussi des arrangements localisés au sien de l’épiderme tels que les cercles de plaquettes observés autour des stomates chez certaines espèces comme l’Héliconie suspendue (Heliconia collinsiana) comme le montre la Figure 12.

Figure 12. Cercles de cires en forme de plaquettes observés autour des stomates chez l'espèce Heliconia

collinsiana par microscopie électronique à balayage, barre d’échelle = 10 µm (Koch et al., 2008).

Chez Brassica oleracea, plusieurs morphologies cristallines des cires épicuticulaires ont été observées en surface des feuilles. On retrouve alors des cires sous forme de tubules, de plaques et de baguettes dans un même environnement cellulaire. La coexistence de plusieurs formes cristalloïdes à la surface d’une même cellule ou de cellules voisines est appelé syntopisme (Koch et

al., 2008). Dans certains cas, la morphologie des cristaux peut être reliée à leur composition chimique

(Tableau 2). Mais des cristaux de composition chimique identique peuvent également se présenter sous différentes formes cristallines : on parle alors de polymorphisme. Ce phénomène s’explique notamment par un changement des conditions environnementales durant la cristallisation des cires (Jetter et Riederer, 1994). Ainsi, la température et l’humidité relative sont des paramètres qui vont influencer la morphologie des cires (taille et configuration) et leur enrichissement en surface des feuilles (Koch et al., 2006). Le phénomène de polymorphisme a notamment été observé chez

Tableau 2. Relation entre la morphologie et la composition chimique des cires épicuticulaires (D'après les données fournies par Barthlott et al., 1998 ; Koch et al., 2008 ; Shepherd et Griffiths, 2006).

Structure des cires épicuticulaires Typologie et arrangements des cires épicuticulaires

Composés chimiques Références associées

Couches et croûtes

Films lisses Mélanges d’alcanes, d’alcools et d’esters

Riederer et Schneider, 1990 Jetter et al., 2000

Cameron et al., 2006

Croûtes Non déterminé Non déterminé

Couches

fissurées Non déterminé Non déterminé

Cristalloïdes

Baguettes polygonales

Triterpénoïdes spéciaux tels

que -amyrine Gülz et al., 1988

Baguettes cylindriques

Esters, alcanes, alcools primaires, triterpénoïdes, aldéhydes Kreger, 1948 Hegenauer, 1963 Vandenburg et Wilder, 1970 Baker, 1982 Freeman et Turner, 1985 Meusel et al.,1994 Bâtonnets enroulés  -dicétones Dierickx, 1973 Haas, 1989 Baguettes à crêtes transversales

Cétones telles que hentriacontan-16-one Hall et al., 1965 Hunt et al., 1976 Baker, 1982 Meusel et al., 1999 Tubules Alcools secondaires (nonacosan-10-ol) et leurs dérivés,  -dicétones (hentriacontan-14,16-dione), diols Holloway et al, 1977 Wettstein-Knowles,1974 Jeffree, 1986 Jetter et Riederer, 1995 Barthlott et al., 1998 Meusel et al., 2000 Koch et al., 2006 Wen et al., 2007

Plaquettes Alcools primaires, aldéhydes

Jeffree et al., 1975 Baker, 1982 Koch et al., 2006 Haas e tal., 2001

Riedel et al., 2003 et 2007

Filaments Flavonoïdes Barthlott et al., 1998

c. Méthodologie employée pour l’étude de l’accumulation et du

transfert des métaux dans les feuilles des végétaux supérieurs

De même que dans le cas du transfert racinaire, les études ne doivent pas se baser uniquement sur les concentrations élémentaires car ces données ne sont pas réellement représentatives de la disponibilité et de la toxicité des métaux (Lombi et al., 2011). En revanche, la spéciation va jouer un rôle primordial dans l’accumulation et le transfert des métaux dans le compartiment foliaire et va conditionner in fine leur caractère toxique (Nolan et al., 2003 ; Scheckel et

al., 2009). La granulométrie des particules est également à prendre en considération afin d’établir les

voies possibles d’entrée des métaux dans les tissus foliaires. Ainsi, pour étudier l’impact environnemental et toxicologique des métaux, il est indispensable au préalable de les caractériser. Pour cela, plusieurs techniques physico-chimiques complémentaires doivent être utilisées afin de (i) déterminer leur spéciation ainsi que leur morphologie et composition et de (ii) les localiser au sein de la feuille. Cette complémentarité va permettre d’obtenir des informations à diverses échelles de taille (morphologique, physiologique, tissulaire, moléculaire et cellulaire) tout en surmontant les limites de détection et de résolution imposées par chacune des techniques employées.

Une revue concernant l’analyse in situ des métaux et métalloïdes dans les plantes a été récemment publiée et résume l’état de l’art et les artéfacts liés à leur analyse dans les matériaux biologiques (Lombi et al., 2011). Les techniques de caractérisation des métaux dans les végétaux présentées dans cette revue sont résumées ci-dessous :

 Les techniques de spectrométrie par torche plasma permettent de quantifier, de manière rapide (seulement quelques minutes), l’ensemble des métaux présents dans les feuilles, à des concentrations de l’ordre du ppb. Les analyses sont généralement effectuées par spectrométrie d’émission optique (ICP-OES/IPC-AES) ou spectrométrie de masse (ICP- MS) et nécessitent au préalable la minéralisation des échantillons (Chang et al., 2014 ; Larue

et al., 2014a et b ; Schreck et al., 2012a, 2012b, 2013 et 2014 ; Uzu et al., 2010 et 2014 ;

Xiong et al., 2014).

 L’ablation laser (LA-ICP-MS) peut également être utilisée. Cette technique, dont la résolution spatiale est de l’ordre de quelques microns à quelques centaines de microns (dépendamment de la taille du spot laser utilisé), permet de quantifier les métaux ainsi que leur ratio isotopique et d’imager leur distribution en surface et dans les tissus des feuilles (Becker et al., 2008 ; Kaiser et al., 2007 ; Polatajko et al., 2007 ; Punshon et al., 2004 ; Schreck et al., 2014).

 La Microscopie Electronique à Balayage (MEB) associée à la microanalyse par Energie Dispersive de rayons X (EDX) est une technique appropriée pour la caractérisation morphologique et chimique d’un grand nombre de particules ainsi que pour la localisation des zones riches en métaux, avec une résolution spatiale à l’échelle du nanomètre. Les analyses des feuilles se faisant sous haute pression, il est nécessaire de cryo-fixer les échantillons au préalable et de les maintenir dans de telles conditions pendant l’analyse afin de préserver les structures morphologiques des feuilles (Richter et al., 2007 ; Walther et Muller, 1999 à titre d’exemples) tout en ne déplaçant pas les métaux (Sarret et al., 2009). Il est également possible d’avoir recours à un MEB environnemental (Larue et al., 2014a et b ; Uzu et al., 2010 ; Schreck et al., 2014 ; Xiong et al., 2014) qui permet de travailler dans des conditions plus douces en pression. Cependant, la résolution spatiale est moindre (échelle du micron) et la quantification précise des éléments n’est alors plus possible. Cette technique requiert cependant le séchage de l’échantillon avant analyse afin d’éviter sa déformation sous le faisceau d’électrons. La métallisation des échantillons permet d’améliorer la topographique de surface des feuilles mais l’analyse postérieure par d’autres techniques n’est alors plus permise.

 La PIXE (Proton/Particle Induced X-ray Emission) s’applique également très bien à l’étude des métaux dans les végétaux. Cette technique permet, au même titre que la microscopie analytique (MEB-EDX), de quantifier les métaux (ordre du ppm) et de cartographier les distributions élémentaires dans les feuilles (Siegele et al., 2008) avec une résolution spatiale de l’ordre quelques microns. L’analyse nécessite cependant la cryo- fixation des échantillons afin d’éviter leur endommagement.

 La Spectrométrie ToF-SIMS (Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry) est une technique utilisée pour la détection et l’imagerie des matériaux inorganiques dans des matrices organiques, et ce avec une très grande résolution et sans dégradation de l’échantillon. Elle permet d’imager la distribution des éléments et des fragments moléculaires en surface et de déterminer leur distribution en profondeur, avec une résolution latérale inférieure à 1 μm et une résolution en profondeur de quelques nm (Metzner et al., 2008) et permet donc d’observer la pénétration des métaux à l’intérieur des couches de la feuille (Larue et al., 2014a et b ; Perkins, 2008 ; Uzu et al., 2010). L’analyse en profondeur s’effectue grâce à 2 faisceaux d’ions : le premier sert à former un cratère, le second permet l’analyse de l’intérieur du cratère. Une préparation complexe d’échantillon n’est pas nécessaire mais l’analyse peut entrainer une détérioration importante des tissus de la plante (Grignon et al., 1996). Une approche cryogénique peut donc être nécessaire pour obtenir des résultats concluants. Cette technique ne permet cependant pas une quantification des

éléments. La ToF-SIMS permet l’analyse de surface des régions identifiées comme