Transfections stables des cellules et sous-clonages

2.1.2.1. Stratégie d’expression constitutive des sondes et inductible des protéines d’intérêt

Pour les premiers modèles cellulaires mis en place (Figure 38), des lignées RK13 déjà présentes au laboratoire expriment l’allèle VRQ de la PrP (Vilette et al., 2001) ou A1-40 (Igel

Egalon, 2013) de façon inductible par la doxycycline. Ces cellules sont transfectées avec des vecteurs déjà présents au laboratoire (Table V et Figure 29), codant les sondes HyPer1 et rxYFP adressées au cytoplasme, au noyau et aux mitochondries sous contrôle du promoteur CMV (Banach-latapy et al., 2013).

Ces vecteurs portent un gène de résistance au G418, auquel les cellules sont déjà résistantes suite à leur transfection avec le vecteur pCMV Tet3G (Figure 38A). Une cotrans- fection avec le vecteur pX343, portant un gène de résistance à l’hygromycine est donc réa- lisée, avec un rapport de 20/1 entre les deux plasmides.

La veille des transfections, les cellules vivantes sont comptées sur cellule de Malassez après coloration des cellules mortes au bleu Trypan. Des plaques à 24 puits (P24) sont ense- mencées avec 170 000 cellules par puits dans 1 mL de milieu essentiel minimum (Opti-MEM, Gibco) complémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (SVF) et 100 unités (U).mL-1 _pénicil-

line – 100 µg.mL-1 _{streptomycine (PS). Le jour des transfections, les cellules sont rincées avec}

500 µL Opti-MEM, 10% SVF sans PS puis incubées 1 h dans 500 µL Opti-MEM, 10% SVF sans PS. Pour chaque transfection, on dilue d’une part 500 ng du vecteur pCMV et 25 ng du vecteur pX343 dans qsp 25 µL Opti-MEM et d’autre part 1 µL de lipofectamine 2000 (Thermo Fisher) dans qsp 25 µL Opti-MEM. Après 5 min d’incubation, les 25 µL d’ADN sont ajoutés au tube de lipofectamine. Après 30 min d’incubation, les complexes ADN – lipofectamine sont ajoutés à chaque puits. Après 7 heures d’incubation à 37°C, le milieu contenant les complexes ADN – lipofectamine est remplacé par 1 mL d’Opti-MEM, 10% SVF, PS. Après 48h supplémentaires en culture, les cellules sont passées dans des puits de P6. Le lendemain,

98 50 µg.mL-1 _{d’hygromycine sont ajoutés au milieu pour créer une pression de sélection. Le}

milieu est changé deux fois par semaine en maintenant la pression de sélection. Quand les cellules arrivent à confluence, soit deux à trois semaines après la transfection, elles sont transférées dans des flasques de 25 cm2 _{de surface (F25).}

Figure 29 : Cartes des vecteurs d'expression des sondes HyPer et rxYFP sous contrôle du promoteur CMV

AmpR : gène de résistance à l’ampicilline, CMV : cytomégalovirus, KanR : gène de résistance à la kanamycine, NeoR : gène de résistance à la néomycine, MLS : signal d’adressage aux mitochondries, NES : signal d’exclusion du noyau, NLS : signal d’adressage au noyau.

Des lignées clonales sont ensuite sélectionnées. Les cellules sont dissociées, comp- tées, puis diluées à 8 cellules.mL-1 _{dans du milieu complet afin d’ensemencer chaque puits}

d’une P96 avec en moyenne 0,8 cellule dans 100 µL de milieu : en pratique, chaque puits contient donc normalement 0 ou 1 cellule. Le milieu est changé chaque semaine. Quand les cellules arrivent à confluence, elles sont transférées en P24, puis en P6, puis en F25 pour les clones prometteurs.

99 2.1.2.2. Stratégie de coexpression inductible des sondes avec les protéines d’in-

térêt

Pour construire les deuxièmes modèles cellulaires (Figure 46), 170 000 cellules RK13 dans un puits de P24 sont transfectées avec 500 ng de plasmide pCMV Tet3G (Figure 46A), codant l’activateur de transcription Tet3G, en utilisant 1 µL de lipofectamine 2000 comme décrit dans le paragraphe précédent (2.1.2.1). Les cellules transfectées sont sélectionnées par 500 µg.mL-1 _{de G418.}

Comme les vecteurs pTRE3G ne portent pas de gène de résistance à un antibiotique, les cellules sont ensuite cotransfectées avec (i) les vecteurs pTRE3G codant les constructions sondes P2A A1-40 ou PrP (2.1.1) et (ii) avec le plasmide pSR2, portant un gène de résistance

à la puromycine, avec un rapport de 20/1 entre les deux plasmides.

Pour chaque vecteur de coexpression inductible, on réalise 6 transfections, avec 3 densités cellulaires (65 000, 125 000 ou 185 000 cellules par puits de P24) et 2 volumes de polyethylenimine (PEI) (1 ou 2 µL). Le lendemain de l’ensemencement des puits de P24 avec les cellules RK13 pCMV Tet3G, on prépare, d’une part, 6 tubes contenant chacun 1 µg du vecteur pCMV et 50 ng du vecteur pSR2 dans qsp 25 µL Opti-MEM et, d’autre part, 6 tubes contenant chacun 1 ou 2 µL de PEI dans qsp 25 µL Opti-MEM (chaque volume de PEI est préparé en trois réplicats). Après 5 min d’incubation, les 25 µL d’ADN sont ajoutés au tube de PEI. Après 30 min d’incubation, les complexes ADN – PEI sont ajoutés à chaque puits. Après 48h heures de culture à 37°C, les cellules sont passées dans des puits de P6. Le lende- main, la pression de sélection est ajoutée au milieu : 1 µg.mL-1 _{de puromycine. Le milieu de}

culture est changé deux fois par semaine en maintenant la pression de sélection. Quand les cellules commencent à former des amas, soit environ deux semaines après la transfection, elles sont rincées avec 2 mL PBS, dissociées avec 300 µL de solution de dissociation non enzymatique commerciale (Gibco), reprises dans 3 mL de milieu de culture et maintenues en P6. Après environ une semaine supplémentaire en culture, elles sont transférées en F25. Cer- taines lignées sont sous-clonées par dilution limite en P96 comme décrit dans le paragraphe précédent (2.1.2.1).

L’absence de mycoplasme est vérifiée en utilisant le kit MycoAlert (Lonza) avant con- gélation des cellules à -80°C dès le premier ou le deuxième passage. Des cellules à peine

100 confluentes en F75 sont dissociées, reprises en Opti-MEM, 10% SVF, PS, centrifugées 5 min à 100 g, puis le culot est repris dans 6 mL de 10% diméthylsulfoxide (DMSO), 90% SVF. Cette suspension est répartie dans six cryotubes, soit environ 1,5×105 _{cellules par cryotube. Après}

une incubation de quatre heures dans la glace, les cellules sont placées à -80°C dans une boîte en polystyrène garnie de coton permettant une diminution lente de la température.