Préparation des échantillons pour quantification du niveau d’oxydation des sondes par western blot rédo

Le niveau d’oxydation des sondes peptidiques codées génétiquement peut être quantifié de façon discrète par western blot rédox. Nous avons adapté le protocole décrit dans (Banach-latapy et al., 2013), dont le principe est résumé par la Figure 30.

Les expériences sont réalisées sur des cellules en phase de croissance : des puits de P6 sont ensemencés avec 200 000 cellules la veille des traitements. Pour étudier l’influence de la production endogène par les cellules d’A1-40 ou de PrP, la synthèse du polypeptide

est induite par l’ajout de 1 µg.mL-1 _{de doxycycline au milieu de culture pendant 1 à 24 h.}

Pour étudier la réponse cellulaire à un oxydant exogène, les cellules sont traitées avec 100 ou 500 µM d’H2O2 pendant 5 à 60 minutes. Pour éviter une dégradation de H2O2 par une

trop grande concentration en sérum, on remplace le milieu par de l’Opti-MEM, 2% SVF, PS deux heures avant ces traitements. Les traitements d’une même plaque sont arrêtés simul- tanément par un rapide rinçage au PBS suivi, pour fixer l’état d’oxydoréduction des pro- téines, par l’ajout dans chaque puits de 1 mL d’acide trichloroacétique (TCA) froid à 20% V/V et une incubation sur la glace pendant 45 à 90 min.

Les échantillons sont centrifugés 20 minutes à 19000 g à 4°C. Les culots sont ensuite lavés trois fois avec de l’acétone à -20°C puis incubés 20h à 30°C sous agitation (1400 rpm) et à l’abri de la lumière dans 50 µL de N-éthylmaleimide (NEM) à 50 µM en Tris 50 µM pH 8,8,

104 EDTA 10 mM, dodécylsulfate de sodium (SDS) 10%. Le NEM est un agent alkylant qui va ajouter un groupement alkyl sur les cystéines réduites, ce qui, évitant leur oxydation par la formation de ponts disulfures, maintiendra le ratio forme oxydée

forme réduite des sondes, et permettra leur

séparation par électrophorèse en conditions non réductrices. Les échantillons sont centrifu- gés 5 minutes à 19000 g, puis les culots sont éliminés.

Les formes réduite et oxydée de la sonde sont ensuite séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE), puis révélées par western blot avec un anticorps anti-GFP. Le protocole pour la SDS-PAGE et le western blot est détaillé au paragraphe 2.7 (p. 110).

Figure 30 : Principe du western blot rédox

Des puits de P6 sont ensemencés avec les cellules la veille des traitements. La synthèse de la protéine d’intérêt est induite par la doxycycline le cas échéant, et les cellules sont éven- tuellement traitées par un oxydant ou un réducteur exogène (H2O2 ou DTT) (A). Les traite-

ments d’une même plaque sont tous arrêtés simultanément et les protéines sont extraites (B). Les thiols libres sont bloqués par un alkylant (C). La différence de géométrie des formes oxydée et réduite de la sonde permet de les séparer par western blot (D).

La figure D est adaptée avec l’autorisation d’Elsevier de (Banach-latapy et al., 2013), © 2013, Elsevier Inc.. Il s’agit d’un western blot rédox montrant la différence de migration des formes oxydée et réduite de la rxYFP exprimée dans le cytoplasme, les mitochondries et le noyau de cellules HeLa (Lucey et al., 2009), après traitement par 25 mM DTT (5 min) ou 0,25 mM H2O2 (30 min). Les signes * et ** indiquent les formes réduites et oxydées de la rxYFP localisée

dans le cytosol, dont le signal d’adressage aux mitochondries n’a pas été clivé. 2.4. Suivi des sondes en temps réel par microscopie à fluorescence

Sauf précision contraire, la lamelle d’une boîte à fond en verre de 35 mm de diamètre (MatTek) ou d’une boîte de même type divisée en 4 compartiments (Greiner) est ensemen- cée avec respectivement 1000 ou 250 cellules dans respectivement 500 ou 125 µL d’Opti-

105 MEM,10% SVF, PS, soit une densité de 320 cellules.cm-2 _{dans les deux cas. Après 1 h 30 d’in-}

cubation, le milieu est remplacé par respectivement 2 ou 0,5 mL de FluoroBrite DMEM (Gibco), 10% SVF, PS, 25 mM HEPES pH 7,3, 2 mM L-glutamine, complémenté au dernier moment par 1 µg.mL-1 _{de doxycycline pour induire l’expression des protéines d’intérêt. Le}

FluoroBrite permet de diminuer le bruit de fond dû à l’autofluorescence du milieu et l’HEPES permet de contrôler le pH du milieu au cours de l’acquisition en microscopie, réalisée en- dehors de l’incubateur à CO2. Les cellules sont conservées dans un incubateur à 37°C avec

5% de CO2 jusqu’à l’acquisition, qui est réalisée 48h ± 2h après l’induction sur une platine

thermostatée à 37°C.

Les cellules sont imagées avec un microscope à épifluorescence équipé d’un objectif sec LD Plan-Neofluar 40x/0.6 Korr Ph 2 M27. Une acquisition en time-lapse à deux canaux est réalisée. Le canal 1 correspond à une excitation proche du pic d’excitation de la forme réduite de HyPer1 et de la longueur d’onde isobestique de Grx1-roGFP2, et le canal 2 cor- respond à une excitation proche du pic d’excitation de la forme oxydée de HyPer1 et de la forme réduite de Grx1-roGFP2. Les images sont acquises en 12 bits. Les paramètres pour l’excitation et l’émission sont les mêmes pour toutes les expériences sur les cellules expri- mant HyPer1 d’une part et sur les cellules exprimant Grx1-roGFP2 d’autre part. La Table X récapitule les temps d’exposition, intensités d’excitation et longueurs d’onde pour les deux canaux.

Pour les expériences de suivi de la réponse cellulaire à un traitement exogène (H2O2

ou assemblage protéique), les dilutions sont réalisées de manière standardisée et au dernier moment dans du milieu de culture de façon à ce que le volume ajouté sur les cellules soit le même pour toutes les expériences (1 mL). Le fait de réaliser cet ajout dans un volume im- portant par comparaison au volume de culture permet d’avoir une bonne homogénéisation du traitement avec le milieu de culture. La Table XI présente les temps auxquels ces ajouts sont effectués, ainsi que la fréquence des images et la durée des différentes expériences.

106 Table X : Paramètres d'excitation utilisés pour les cellules exprimant HyPer1 ou Grx1 roGFP2 ex (nm) ém (nm) Intensité DEL Exposition (ms) HyPer1 Grx1- roGFP2 Canal 1 423/44 525/25 8% 400 Canal 2 469/38 525/25 15% 500 300

Table XI : Paramètres cinétiques des acquisitions en time-lapse

Type d’expérience Intervalle Durée totale Tempsajout

Réponse à H2O2 0,5 min 65 min 5 min

Assemblages Réponse précoce 2 min 190 min 10 min

Réponse tardive 0,5 min 35 min /

Suivi de cellules infectées 10 s 35 min /

2.5. Suivi de la concentration en H2O2 avec la sonde chimique Peroxy yellow 1