De la transcription de l’ARNpg à la synthèse de l’ADN RC

L’ADNccc sert de matrice à la transcription des cinq ARNs viraux dont l’ARNpg via l’ARN polymérase II cellulaire (Seeger and Mason 2000; Nassal 2008). L’ADNccc est organisé en mini-chromosome grâce à la présence de protéines histones (H3 et H4) et non-histones régissant l’activité transcriptionnelle de la chromatine par des jeux de méthylation/acétylation (Pollicino, Belloni et al. 2006). De nombreux activateurs et répresseurs de la transcription participent ainsi au contrôle épigénétique de l’ADNccc et régulent la réplication virale (Levrero, Pollicino et al. 2009).

Données Bibliographiques Page 39 Des études récentes ont identifié des facteurs de transcription (CREB, ATF et STAT1/2), des histones acetyl-transferases (CBP, P300 et PCAF) ainsi que des histones deacetylases (HDAC1 et hSirt1) capables de se lier à l’ADNccc pour réguler son activité. La protéine X peut également interagir indirectement avec l’ADNccc, et modifier le statut d’acétylation, de méthylation et de phosphorylation des histones qui lui sont associées, pour contrôler son activité au niveau épigénétique et activer la réplication virale (Pollicino, Belloni et al. 2006; Belloni, Pollicino et al. 2009; Luo, Chen et al. 2013). En interagissant avec DDB1, la protéine X pourrait également participer à la transactivation de l’ADNccc (Leupin, Bontron et al. 2005). Par ailleurs, l’AgHBx pourrait inhiber l’enzyme methyl-transférase PRMT1 et la phosphatase PP1, toutes deux régulant négativement l’activité de l’ADNccc, et ainsi rétablir la transcription virale (Cougot, Allemand et al. 2012; Benhenda, Ducroux et al. 2013). La protéine Core est également retrouvée associée à l’ADNccc et permet de modifier la conformation spatiale de la chromatine en réduisant les espaces entre les nucléosomes (Bock, Schwinn et al. 2001). La protéine Core pourrait également activer la transcription de l’ADNccc en interagissant avec le promoteur de l’ARNpg au niveau du deuxième ilot CpG de son promoteur (Guo, Li et al. 2011). Par ailleurs, des cytokines antivirales tels l’IL-6 et l’IFNα pourraient également affecter le statut transcriptionnel de l’ADNccc. Plus particulièrement, l’IL-6 pourrait réguler le taux des facteurs hépatiques HNF4 et HNF1, essentiels à l’activité promotrice des promoteurs du HBV (Hosel, Quasdorff et al. 2009). Dans le cas de l’IFN-α, il pourrait se lier au motif ISRE présent sur l’ « enhancer I », recruter des histones deacetylases (HDAC1 et hSirt1) induisant l’hypo-acétylation des histones, et des histones methylases du complexe PRC2 réprimant la transcription des ARNs viraux (Belloni, Allweiss et al. 2012).

Les ARNs viraux ainsi transcrits à partir de l’ADNccc sont coiffés, polyadénylés au niveau d’un site unique, et exportés dans le cytoplasme où ils seront traduits pour donner les différentes protéines virales. La principale originalité de ce cycle réside dans le fait que ce virus à ADN doit subir une étape de transcription inverse pour répliquer son génome au sein de la capside en cours de formation. L’ARNpg sera ainsi utilisé comme matrice virale pour la rétrotranscription et la synthèse de l’ADN RC. L’ARN polymérase II ignore le site de polyadénylation lors de sa première rencontre. Par conséquence, l’ARNpg comporte une redondance des motifs DR1 (pour « Direct Repeat 1 ») et ε (Cherrington, Russnak et al. 1992). De façon synchrone à l’encapsidation, le complexe ARNpg-polymérase se lie de façon covalente à la boucle située au sommet de la structure secondaire ε (Pollack and Ganem 1993; Pollack and Ganem 1994). Il a été montré que la polymérase virale se liait préférentiellement à la molécule d’ARNpg qui avait été utilisée comme matrice pour sa propre synthèse (Bartenschlager, Junker-Niepmann et al. 1990). Des protéines chaperonnes telles que Hsp90, Hsp70, Hsp40, Hop, Hsp60 et p23 participeront également au maintien de ce complexe ribo-nucléoprotéique (Beck and Nassal 2007). Le contact entre les domaines TP (motif T3) et RT de la polymérase, induisant un changement conformationnel de cette dernière, serait nécessaire pour son activité enzymatique et sa liaison à l’ARNpg (Cao, Badtke et al. 2005; Stahl, Beck et al. 2007). Particulièrement, un résidu tyrosine au niveau du

Données Bibliographiques Page 40 domaine TP permettrait la liaison entre la polymérase virale et l’extrémité 5’ du brin (-), et induirait l’initiation de la rétrotranscription avec la synthèse de l’amorce (Zoulim and Seeger 1994). Le complexe ARNpg-polymérase-amorce serait ensuite transféré en position 3’ de l’ARNpg grâce à sa similarité de séquence avec la région DR1. Ce mécanisme de translocation est encore peu décrit mais il semblerait que des motifs Phi et Omega, complémentaires à ε et proches de la région DR1 en 3’, puissent faciliter la translocation du complexe ARNpg-polymérase-amorce en interagissant ensemble (Tang and McLachlan 2002; Shin, Lee et al. 2004; Abraham and Loeb 2007). L’élongation du brin (-) peut finalement débuter et l’ARNpg est dégradé au fur et à mesure grâce à l’activité RNaseH de la polymérase virale. Seul un oligonucléotide (11 nt) en 5’, contenant la région DR1, est épargné et sert ensuite d’amorce pour la synthèse du brin (+) (Nassal 2008). En effet, celui-ci est tout d’abord transloquer en 5’ du brin d’ADN néoformé au niveau de la région DR2 (pour « Direct Repeat 2 »), et ceci grâce à la forte homologie de séquence entre DR1 et DR2 (Habig and Loeb 2006). Il y ensuite circularisation du brin (-) grâce à la complémentarité entre les deux séquences DR1 et finalement polymérisation du brin (+). Cette synthèse restera inachevée et aboutira à la formation de l’ADN RC retrouvé dans les nucléocapsides matures. Néanmoins, de l’ADN double brin linéaire peut être produit en cas d’échec lors du transfert d’amorce ARN à la séquence DR2, et ceci par extension à partir de sa position d’origine (figure 13) (Yang and Summers 1998; Nassal 2008).

La protéine Core pourrait également jouer un rôle primordial dans la synthèse de l’ADN RC. En effet, la phosphorylation des résidus sérines 155, 162 et 170, par des SRPK kinases et/ou PKC au niveau du domaine CTD de la protéine Core, serait également essentielle à l’étape de rétrotranscription (Liao and Ou 1995; Kann, Sodeik et al. 1999; Daub, Blencke et al. 2002). Des délétions/modifications au sein du domaine CTD inhiberaient ainsi la synthèse de l’ADN RC (Nassal 1992; Kock, Nassal et al. 2004; Le Pogam, Chua et al. 2005). La phosphorylation en position 162 serait également nécessaire et suffisante pour l’encapsidation de l’ARNpg. Par ailleurs, il a été montré que des délétions au niveau de certaines asparagines (mutants « Asp-core ») permettaient la synthèse complète du premier brin d’ADN mais abolissait la synthèse du deuxième brin (Basagoudanavar, Perlman et al. 2007). La protéine Core jouerait ainsi le rôle de chaperonnes en participant à la synthèse de l’ADN RC en fonction du degré de phosphorylation de son domaine CTD (Wang, Dhason et al. 2012). La protéine de capside aurait également une affinité différente entre les molécules d’ARN simple brin et d’ADN double conférant aux dimères de Core la propriété d’encapsider majoritairement l’ARNpg. Ce phénomène aboutirait à la formation de capsides plus stables que celles contenant l’ADN RC, qui pourront par ailleurs être capable de se désassembler au niveau du noyau pour libérer le génome viral (Rabe, Delaleau et al. 2009; Dhason, Wang et al. 2012). Par ailleurs, la protéine X pourrait également participer à la phosphorylation des résidus sérines de la protéine Core et ainsi exercer un effet régulateur sur la réplication virale (Melegari, Wolf et al. 2005).

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FIGURE 13 : RETRO-TRANSCRIPTION DE L'ARN PREGENOMIQUE ET SYNTHESE DE L'ADN RC

(1) Parallèlement à l’encapsidation, la polymérase se lie de façon covalente à l’ARNpg et induit la polymérisation du brin (-) via son activité RT, ainsi que la dégradation de l’ARNpg via son activité RNaseH. Seul un oligonucléotide (coiffe) sera épargné et servira d’amorce pour la synthèse du brin (+). (2) Cette oligonucléotide contient la séquence DR1 et sera transloqué en 5’ du brin d’ADN (-) néosynthétisé au niveau de la région DR2 (forte homologie entre les séquences DR1 et DR2). (3) Il y aura circularisation de l’ADN via la complémentarité des deux régions DR1. (4) La synthèse du brin (+) pourra être initiée mais restera inachevée formant ainsi l’ADN RC. (4 bis) En cas d’échec du transfert de l’amorce au niveau de la région DR2, il y a formation d’ADN db linéaire par initiation de la polymérisation de l’ADN (+) au niveau de la séquence DR1.

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I.2.5.4 De la formation des nucléocapsides matures à leur